Ultraschall-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll, um primäre erwachsene Fibroblasten auf einfache, schnelle und zuverlässige Weise zu isolieren, die von Anfängern (z. B. Studenten) durchgeführt werden können. Das Verfahren kombiniert enzymatische Gewebeverdauung und mechanische Agitation mit Ultraschallwellen, um primäre Fibroblasten zu erhalten. Das Protokoll kann leicht an spezifische experimentelle Anforderungen (z.B. menschliches Gewebe) angepasst werden.

Zusammenfassung

Primäre erwachsene Fibroblasten sind zu einem wichtigen Werkzeug geworden, um Fibrose, Fibroblasten-Wechselwirkungen und Entzündungen in allen Körpergeweben zu untersuchen. Da sich primäre Fibroblasten aufgrund der Myofibroblastendifferenzierung oder der Seneszenzinduktion nicht unbegrenzt aufteilen können, müssen regelmäßig neue Kulturen etabliert werden. Es gibt jedoch mehrere Hindernisse, die während der Prozesse der Entwicklung eines zuverlässigen Isolationsprotokolls und der primären Fibroblastenisolation selbst zu überwinden sind: der Schwierigkeitsgrad der Methode (insbesondere für Anfänger), das Risiko einer bakteriellen Kontamination, die benötigte Zeit, bis primäre Fibroblasten für Experimente verwendet werden können, und anschließende Zellqualität und Lebensfähigkeit. In dieser Studie wird ein schnelles, zuverlässiges und leicht zu erlernendes Protokoll zur Isolierung und Kultur primärer Erwachsener Fibroblasten aus Mausherz, Lunge, Leber und Niere bereitgestellt, das enzymatische Verdauung und Ultraschall-Agitation kombiniert.

Einleitung

Fibroblasten sind flache, spindelförmige Zellen mit mehreren stellaten Prozessen und einem ausgedehnten groben endoplasmatischen Retikulum^1,2. Ein durchschnittlicher Fibroblasten misst 30 - 100 m und hat eine Lebensdauer von 57 x 3 Tagen^1,3. Die durchschnittliche Zellzyklusdauer menschlicher Fibroblasten reicht von 16 - 48 h, abhängig von den Kulturbedingungen⁴. Es gibt Hinweise darauf, dass die reproduktive Kapazität und funktionelle Qualität kultivierter primärer Fibroblasten negativ mit dem Spenderalter korreliert, was darauf hindeutet, dass jüngere Spender (Tiere oder Patienten) nach Möglichkeit bevorzugt werden sollten^5,6 .

Fibroblasten stellen einen vorherrschenden Zelltyp der meisten Säugetierkörpergewebe dar. Trotz ihrer allgegenwärtigen Präsenz ist die molekulare Identifizierung von Fibroblasten immer noch eine Herausforderung⁷. Fibroblasten wandern während der embryonalen Entwicklung zu sich entwickelnden Geweben und Organen aus verschiedenen Quellen⁸. Aus diesem Grund gibt es eine Fülle von Markerproteinen, die in Fibroblasten gefunden werden können, während einzigartige Markerproteine, die in jeder Fibroblastenpopulation vorhanden sind und exklusiv für Fibroblasten sind, noch fehlen. Daher werden Expressionsmuster mehrerer erkannter Marker in der Regel verwendet, um Fibroblasten zu identifizieren. Zu den bekanntesten Markern gehören Vimentin, humanes Fibroblasten-Oberflächenprotein (hFSP), Discoidin-Domänenrezeptor 2 (DDR2) und Alpha-Glattmuskel-Actin (SMA).

Fibroblasten sind der wichtigste extrazelluläre Matrix (ECM)-produzierende Zelltyp. Dabei erhalten Fibroblasten eine geordnete Gewebearchitektur und bieten mechanische Unterstützung für benachbarte Zellen¹. Das Gleichgewicht zwischen ECM-Synthese und Abbau ist ein gut regulierter Prozess. Verschiebungen in Richtung Synthese markieren den Beginn einer übermäßigen ECM-Ablagerung, die, wenn sie nicht beendet wird, zu Fibrose führt. Fibrose wird durch Myofibroblasten vermittelt, die von aktivierten Fibroblasten stammen, die molekularen und phänotypischen Veränderungen unterzogen werden. Ein Markenzeichen von Myofibroblasten ist die verbesserte Sekretion von ECM und Zytokinen und die Expression von geordnetangeordneten SMA-Mikrofilamenten⁹.

Primäre Fibroblasten standen im Rampenlicht der jüngsten Forschung, die sich auf Fibrose, Gewebeentzündung und Fibroblasten-Krebs-Zell-Wechselwirkungen^10,11konzentriert. Jedoch, um effektiv zu studieren Fibroblasten Eigenschaften in Gesundheit und Krankheit, Ist es notwendig, lebensfähige primäre erwachsene Fibroblasten auf einer regelmäßigen Basis zu isolieren. Es stehen mehrere Methoden zur Verfügung, um Fibroblasten zu isolieren^12,13,14. Die drei wichtigsten Methoden der Fibroblastenisolation sind das Auswachsen aus Gewebebrocken¹², enzymatische Gewebeverdauung¹⁵, und enzymatische Perfusion von Hohlorganen^9,13,16. Der Vorteil des Auswuchses ist ein schonender Isolationsprozess ohne enzymatischen Zellabbau. Auf der anderen Seite benötigen Auswachstumskulturen in der Regel längere Kulturperioden, bis Zellen für Experimente verwendet werden können. Die häufige enzymatische Verdauung ist schnell, birgt aber das Risiko einer Kontamination mit anderen Zelltypen (z. B. Endothelzellen) oder Bakterien im Rührprozess, die notwendig sind, um das Gewebe mechanisch aufzulösen. Darüber hinaus sind diese Methoden oft aufwendig und erfordern Zeit und Geschick zu lernen.

Hinsichtlich der Bedeutung primärer Fibroblasten in der Forschung besteht nach wie vor die Notwendigkeit, bestehende Zellisolationsansätze in Bezug auf Schnelligkeit, Einfachheit und Zuverlässigkeit zu optimieren. Hier wird eine neuartige Ultraschall-basierte enzymatische Fibroblasten-Isolationsmethode angeboten, die hochwertige Zellen liefert.

Protokoll

Das folgende Protokoll folgt den institutionellen Tierpflegerichtlinien der Technischen Universität Dresden (Aktenzeichen: T 2014/4) sowie den international anerkannten Tierpflegerichtlinien (FELASA)¹⁷. Abbildung 1 visualisiert den Prozess der Zellisolierung.

1. Vorbereitung des Setups, des Materials und der Medien

1. Bereiten Sie Zellkulturmedium, PBS-Lösung, Kollagenase-Mischstofflösung (rekonstituieren 50 mg lyophilisierte Kollagennase-Mischung in 12 ml sterilem Reinstwasser) und 0,25% Trypsinlösung.
2. Das Medium, das PBS und die Trypsin-Lösung auf 37 °C aufwärmen.
3. Das Ultraschall-Wasserbad auf 37 °C vorheizen.
4. Desinfektionszange, ein Edelstahlspachtel, Skalpelle (2x Skalpelle pro Organ) und 2 Glasbecher mit 70% Ethanol und legen diese Materialien unter die Zellkulturhaube.
5. Füllen Sie einen Becher mit 70% Ethanol und den anderen mit sterilem Wasser oder PBS-Lösung. Diese Becher sind erforderlich, um das Instrument nach jeder Orgelprozession zu desinfizieren und zu waschen.
6. Sterile 15 ml Kunststoffrohre mit kaltem PBS auf nassem Eis aufstellen. Die Anzahl der Röhren hängt von der Anzahl der Organe ab, von denen Sie Fibroblasten isolieren möchten.

2. Maussektion und Organentfernung

1. Tragen Sie zwei Paar Handschuhe übereinander, so dass das erste Paar entfernt werden kann, sobald das Tier seziert wurde.
   HINWEIS: Dieses Verfahren verhindert, dass sich Bakterien aus fell und hautaus über die Organe ausbreiten.
2. Euthanisieren Sie die Maus (z. B. Zervixdislokation) und heften Sie den Kadaver mit Nadeln an jedes Glied an ein Polystyrolpad.
3. Desinfizieren Sie die Mauskarkasse mit 70% Ethanolspray. Stellen Sie sicher, dass das Fell in Ethanol getränkt ist, damit das Haar nicht aufwirbelt.
4. Schneiden Sie das Fell direkt über dem Urogenitaltrakt mit chirurgischen Zangen und atraumatischen Scheren. Schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie vom Punkt des anfänglichen Schnitts bis zum Hals (3 - 4 cm) und fügen Sie Reliefschnitte an den Gliedmaßen hinzu.
   VORSICHT: Perforieren Sie die Muskelschicht bei diesem Schritt nicht, um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden!
5. Pin die Haut an das Polystyrol-Schaumpad, um optimalen Zugang zur Muskulatur zu haben, die die Bauchhöhle bedeckt.
6. Desinfizieren Sie die Bauchmuskulatur zweimal mit 70% Ethanol. Lassen Sie das Ethanol trocknen, bevor Sie zum nächsten Schritt weiterfahren.
7. Entfernen Sie das erste Paar Handschuhe. Verwenden Sie einen neuen, sterilen Satz Von Zangen und Scheren.
8. Öffnen Sie die Bauchhöhle und den Thorax, indem Sie die Muskelschicht mit einer chirurgischen Schere einschneiden, um die Organe der Wahl sanft zu entfernen. Halten Sie das Organ daher vorsichtig mit chirurgischen Zangen (das Organ nicht durchbohren, minimalen Druck verwenden) und schneiden Sie die zuliefernden Blutgefäße in der Nähe des Einstiegspunkts am Organ mit einer Schere.
9. Legen Sie die Organe in die sterilen Schläuche, die kalte SPBS enthalten. Schließen Sie die Rohre fest. Legen Sie die Rohre auf nasses Eis, bis Sie mit Schritt 3.1 fortfahren.

3. Gewebeminzierung, Verdauung und Zellextraktion

1. Übertragen Sie die Rohre unter die sterile Zellkulturhaube.
   VORSICHT: Tragen Sie ein frisches Paar Handschuhe und desinfizieren Sie die Schläuche mit 70% Ethanol, bevor Sie sie unter die Haube übertragen!
2. Nehmen Sie das Organ mit steriler Zange aus dem 15 ml-Rohr. Legen Sie das Organ auf die Hälfte einer sterilen 6 cm Petrischale und waschen Sie das Organ kurz mit PBS, um überschüssiges Blut zu entfernen. Übertragen Sie die Orgel auf die zweite Hälfte der Petrischale, entfernen Sie überschüssige PBS.
3. Hacken Sie das Gewebe mit zwei sterilen Skalpellen. Die verbleibenden Gewebefragmente sollten nicht größer als 1 - 2 mm sein.
4. Übertragen Sie das gehackte Gewebe mit dem sterilen Spachtel in ein neues steriles 15 ml-Rohr und fügen Sie 2 ml 0,25% Trypsinlösung hinzu. Legen Sie die Röhre 5 min bei 37 °C in einen Zellkultur-Inkubator.
5. Wirbeln Sie das Rohr sanft (ca. 1400/min) für 10 s.
6. Stoppen Sie die Trypsin-Reaktion unter der Zellkulturhaube, indem Sie 4 ml FCS-haltiges Zellkulturmedium (Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM), z.B.) hinzufügen.
7. Fügen Sie jeder Röhre, die Herz- oder Lungengewebe enthält, 250 l Kollagenase-Mischlösung und für Niere bzw. Leber 100 l Kollagennase-Mischlösung hinzu.
8. Legen Sie die Schläuche in ein Ultraschall-Wasserbad (37 °C) und aktivieren Sie den Ultraschall-Sonicator 10 min.
   HINWEIS: Das in diesem Protokoll verwendete Ultraschall-Wasserbad hat eine Betriebsfrequenz von 35 kHz und eine maximale Leistung von 320 W.
9. Wirbeln Sie die Rohre sanft (ca. 1400/min) für 10 s.
10. Legen Sie die Schläuche 10 min wieder in das Ultraschall-Wasserbad.
11. Wirbel sanft (ca. 1400/min) für 10 s.
12. Desinfizieren Sie die Rohre mit 70% Ethanol und übertragen Sie sie unter die sterile Zellkulturhaube.
13. Filtern Sie die Lösung mit einem 40-mm-Netz in ein neues steriles 15 ml-Rohr.
14. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 500 x g für 5 min.
15. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml frischem Medium wieder auf.
16. Übertragen Sie die Zellen in ein geeignetes Zellkulturgefäß (z.B. 6-Well-Platte) und legen Sie das Gefäßüber Nacht bei 37 °C und 5% CO2 in den Zellkultur-Inkubator.
17. Am nächsten Tag entfernen Sie das Medium, waschen Sie 3 mal mit PBS, dann fügen Sie frisches Medium hinzu (das zusätzliche Volumen hängt vom Zellkulturgefäß der Wahl ab, 2 ml pro Brunnen einer 6-Well-Platte usw.).
18. Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag.
    HINWEIS: Fibroblasten können nach Erreichen des optischen Zusammenflusses von 90% (in der Regel nach 5-7 Tagen) geteilt werden.

Ergebnisse

Die Fähigkeit dieses Protokolls, erwachsene Fibroblasten aus festem murinen Gewebe zu isolieren, wurde nachgewiesen. Es wurden lebensfähige Fibroblasten erhalten, die für nachfolgende Experimente wie Immunfluoreszenzfärbung oder Proliferationsexperimente verwendet werden konnten (Abbildung 2D-F, Abbildung 5A).

Erwachsene Fibroblasten sind flache spindelförmige Zellen mit mehreren zellulären Proz...

Diskussion

Im Vergleich zu verewigten Fibroblasten-Zelllinien bieten primäre Fibroblasten mehrere Vorteile. Sie lassen sich kostengünstig in hoher Qualität und Quantität isolieren. Darüber hinaus bieten Primärkulturen die Möglichkeit, Zellen von mehreren Individuen zu untersuchen, was die Zuverlässigkeit der erhaltenen Ergebnisse erhöht und die Wahrscheinlichkeit verringert, nur Zellkulturartefakte zu studieren. Kontinuierliche Erzeugung neuer Primärkulturen verhindert genetische Veränderungen, die häufig nach wiederhol...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	T4049-100ML
Antibiotics	Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA	Gibco LS15140148	Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL)
Cell culture hood	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	51023608	HeraSafe KSP15
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	50049176	BBD 6220
Cell culture plates	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	depends on vessel	6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction	VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany	20727400	BVC professional suction
Cell strainer (mesh)	Corning, Tewksbury, USA	431750	40 µm Nylon
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	75007213	Megafuge 8R
Cordless pipetting controller	Hirschmann, Eberstadt, Germany	9907200	Pipetus
Disposable pipette tips	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL)
Disposable plastic pipettes	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL
Disposable sterile scalpel	Myco Medical, Cary, USA	n.a.	Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	41965-062	High glucose
Eppendorf tubes	Eppendorf, Hamburg, Germany	depends on volume	50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL
Fetal calf serum (FCS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	F2442-50ML
Collagenase blend	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	5401020001	Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D8537-500ML	500 mL
Senescence detection kit	Abcam, Cambridge, UK	ab65351
Shaker/ Vortex	IKA, Staufen im Breisgau, Germany	n.a.	MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	Falcon 352095	BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL)
Ultrasonic water bath	BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany	312	Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic)	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	NR 82
Surgical scissors	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	eq 1060.09
Surgical forceps	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	BD577