Ultrasonik-Augmented primer yetişkin fibroblast yalıtım

Özet

Birincil erişkin fibroblastları, yeni başlayanlar tarafından (örn. öğrenciler) kolay, hızlı ve güvenilir bir şekilde ayırmak için bir protokol sunuyoruz. Prosedür primer fibroblastlar elde etmek için enzimatik doku sindirim ve ultrasonik dalgalar ile mekanik ajitasyon birleştirir. Protokol, belirli deneysel gereksinimlere (örn. insan dokusu) kolayca adapte edilebilir.

Özet

Primer erişkin fibroblastlar tüm vücut dokularında fibrozis, fibroblast etkileşimleri ve inflamasyonu incelemek için önemli bir araç haline gelmiştir. Primer fibroblastlar myofibroblast farklılaşma veya senesans indüksiyon nedeniyle sonsuza kadar bölünemez beri, yeni kültürler düzenli olarak kurulmalıdır. Ancak, güvenilir bir yalıtım Protokolü ve primer fibroblast yalıtım kendisi geliştirme süreçleri sırasında üstesinden gelmek için birkaç engel vardır: zorluk yöntemin derecesi (özellikle yeni başlayanlar için), bakteriyel kontaminasyon riski, Primer fibroblastlar deneyler için kullanılabilir ve sonraki hücre kalitesi ve viability kadar gerekli zaman. Bu çalışmada, hızlı, güvenilir ve öğrenme kolay bir protokol izole etmek ve kültür birincil yetişkin fibroblastlar fare kalp, akciğer, karaciğer ve böbrek enzimatik sindirim ve ultrasonik ajitasyon birleştiren sağlanır.

Giriş

Fibroblastlar, birden fazla stellat süreçleri ve geniş bir kaba endoplazmik retikulum ile düz, iğ şeklinde hücreler^1,2. Ortalama bir fibroblast 30-100 μm ölçer ve 57 ± 3 gün^1,3yaşam süresi vardır. İnsan fibroblastlarının ortalama hücre döngüsü süresi, kültür koşullarına göre 16-48 h arasında değişmektedir⁴. Kültürlü primer fibroblastların çoğaltılabilir kapasitesinin ve fonksiyonel kalitesinin, donör çağıyla olumsuz şekilde ilişkilendirileceğinden, Genç bağışçıların (hayvanların veya hastaların) mümkünse^5,6 .

Fibroblastlar en memeli vücut dokularının baskın bir hücre türünü oluşturmaktadır. Her zaman bulundukları varlığa rağmen, fibroblastların moleküler tanımlaması hala bir zorluk⁷. Fibroblastlar, embriyonik gelişim sırasında farklı kaynaklardan gelen doku ve organlara göç etmek⁸. Bu nedenle, fibroblastlar içinde bulunan, her fibroblast nüfusunda bulunan ve fibroblastların özel olan benzersiz Marker proteinlerinin hala eksik olduğu bir bolluk Marker proteini vardır. Böylece, birçok tanınan işaretçileri ifade desenleri genellikle fibroblastlar tanımlamak için kullanılır. En tanınmış belirteçleri arasında vimentin, insan fibroblast yüzey proteini (hFSP), discoidin Domain reseptör 2 (DDR2) ve Alfa pürüzsüz Kas aksini (αSMA).

Fibroblastlar, büyük hücre içi matris (ECM) üreten hücreli tiptir. Böylece, fibroblastlar düzenli bir doku mimarisi korumak ve komşu hücreler için mekanik destek sağlamak¹. ECM sentezi ile bozulma arasındaki denge iyi düzenlenmiş bir süreçtir. Sentez yönüne doğru vardiyalar, sonlandırılmadıkça fibrozis yol açan aşırı ECM birikmesi başlangıcına işaret ederler. Fibrozis, moleküler ve fenotektal değişikliklerden kaynaklanan aktif fibroblastlar kaynaklı myofibroblastlar tarafından aracılılar. Miyofibroblastların bir damgasını ECM ve sitokinlerin salgılanması ve düzenli olarak düzenlenmiş αSMA mikrofilemlerin ifadesi⁹.

Primer fibroblastlar, fibrozis, doku iltihabı ve fibroblast-kanser-hücre etkileşimlerine odaklanan son araştırmaların Spotlight olduğunu^10,11. Ancak, sağlık ve hastalık fibroblast özellikleri etkili bir şekilde çalışmak için, düzenli olarak uygun primer erişkin fibroblastlar izole etmek gereklidir. Fibroblastlar^12,13,14yalıtmak için çeşitli yöntemler mevcuttur. Fibroblast izolasyonunun üç ana yöntemi, doku parçaları¹², enzimatik doku sindirimi¹⁵ve boş organların enzimatik perfüzyon^9,13,16büyüme vardır. Büyüme avantajı enzimatik hücre bozulması olmadan nazik bir yalıtım sürecidir. Öte yandan, büyüme kültürler genellikle hücreler deneyler için kullanılabilir kadar uzun süreli kültür dönemleri gerektirir. Yaygın enzimatik sindirim hızlı ama diğer hücre türleri ile kontaminasyon riski taşımaktadır (örneğin, endotel hücreleri) veya bakteri ajitasyon sürecinde, hangi mekanik doku çözülür için gerekli olan. Ayrıca, bu yöntemler genellikle ayrıntılı ve öğrenmek için zaman ve beceri gerektirir.

Araştırmalarda primer fibroblastların önemi ile ilgili olarak, mevcut hücre yalıtım yaklaşımlarını hızlı, basitlik ve güvenilirlik açısından optimize etmek için hala bir ihtiyaç vardır. Burada, yüksek kaliteli hücreler sunan bir yeni ultrasonik bazlı enzimatik fibroblast yalıtım yöntemi sağlanır.

Protokol

Aşağıdaki protokol Technische Universität Dresden, Almanya (dosya numarası: T 2014/4) yanı sıra uluslararası kabul görmüş hayvan bakım kuralları (FELASA)¹⁷kurumsal hayvan bakım yönergeleri takip eder. Şekil 1 hücre yalıtım sürecini görselleştirir.

1. Kurulum, malzeme ve medyayı hazırlama

1. Hazırlamak hücre kültürü orta, PBS çözüm, kolajenaz karışım stok çözüm (Re, 50 mg likofilized kolajenaz karışımı 12 ml steril ultra saf su), ve 0,25% tripsin çözeltisi.
2. Orta, PBS ve tripsin solüsyonu 37 °C ' ye kadar ısıtın.
3. Ultrasonik su banyosunu 37 °C ' ye ısıtın.
4. Forseps dezenfekte, paslanmaz çelik spatula, neşter (organ başına 2x neşter) ve 70% etanol ile 2 cam bevisler ve hücre kültürü kaputu altında bu malzemeleri yerleştirin.
5. % 70 etanol ve diğer steril su veya PBS çözeltisi ile bir kabı doldurun. Bu arıcılar her organ alayı sonrasında cihazı dezenfekte etmek ve yıkamak zorundadır.
6. Islak buzda soğuk PBS içeren steril 15 mL Plastik tüpler yerleştirin. Boru sayısı, fibroblastları izole etmek istediğiniz organların sayısına bağlıdır.

2. fare diseksiyonu ve organ kaldırma

1. İki çift eldiven bir diğeri üzerinde giymek, bu yüzden ilk çifti en kısa sürede hayvan dissected edilmiş olarak kaldırılabilir.
   Not: Bu prosedür, hayvanın kürk ve cilt organları üzerinde yayılması bakteri önler.
2. Fare (örneğin, servikal dislocation) ötenize ve bir polistiren pad her ekstremite iğneler ile karkas pin.
3. 70% etanol sprey kullanarak fare karkas dezenfekte. Saç kadar girdap olmaz böylece kürk etanol ıslatılmış olduğundan emin olun.
4. Cerrahi forseps ve atraumatik makas kullanarak ürogenital sistemin hemen üstündeki kürk kes. İlk kesi noktasından boyun (3-4 cm) noktasından orta çizginin yanında cildi kesip ekstremitelerde kabartma kesimleri ekleyin.
   DIKKAT: bakteriyel kontaminasyonu önlemek için bu adımda kas tabakasını delmeyin!
5. Karın boşluğu kapsayan kas için optimum erişim için Polistiren köpük Pad cilt pin.
6. % 70 etanol kullanarak karın kasısını iki kez dezenfekte edin. Bir sonraki adıma geçmeden önce etanol kuru edelim.
7. İlk eldiven çifti çıkarın. Yeni, steril bir forseps ve makas seti kullanın.
8. Karın boşluğunu ve toraks, kas katmanını cerrahi makas ile yakarak seçim organlarını nazikçe kaldırmak için açın. Bu nedenle, cerrahi forseps ile yavaşça organ tutun (organ delmek değil, minimal basınç kullanın) ve makas ile organ giriş noktası yakın tedarik kan damarlarını kesti.
9. Organları soğuk PBS içeren steril tüplere koyun. Tüpleri sıkıca kapatın. Adım 3,1 ile devam edene kadar tüpler ıslak buz üzerine yerleştirin.

3. doku mincing, sindirim ve hücre ekstraksiyon

1. Tüpleri steril hücre kültürü kaputu altında aktarın.
   DIKKAT: yeni bir çift eldiven giyin ve onları kaput altına aktarmadan önce% 70 etanol ile tüpleri dezenfekte edin!
2. Steril forseps kullanarak 15 mL tüpten organ alın. Organ steril 6 cm Petri çanak bir yarısında üzerine yerleştirin ve aşırı kan kaldırmak için PBS ile organ kısa bir süre yıkayın. Organ Petri tabak ikinci yarısında transfer, aşırı PBS kaldırmak.
3. İki steril neşter kullanarak doku Mince. Kalan doku parçacıkları 1-2 mm 'den büyük olmamalıdır.
4. Steril spatula kullanarak yeni bir steril 15 mL tüp içine kıyılmış doku aktarmak ve% 0,25 tripsin solüsyonu 2 mL ekleyin. Tüp, 37 °C ' de 5 dakika boyunca bir hücre kültürü kuluçvörü haline yerleştirin.
5. Tüpü yavaşça (1400/dk.) 10 s için Vortex.
6. 4 mL FCS içeren hücre kültürü ortamı (Dulbecco 'nun modifiye kartal Orta (DMEM), örneğin) ekleyerek hücre kültürü kaputu altında tripsin reaksiyonu durdurun.
7. Sırasıyla böbrek veya karaciğer için kalp veya akciğer dokusu ve 100 μL içeren her tüp için 250 μL kolajenaz karışım çözeltisi ekleyin.
8. Bir ultrasonik su banyosu (37 °C) içine tüpler yerleştirin ve 10 dakika ultrasonik sonicator etkinleştirin.
   Not: Bu protokolde kullanılan ultrasonik su banyosu 35 kHz ve 320 W maksimal gücü bir çalışma sıklığı vardır.
9. Tüpleri hafifçe (1400/dk) 10 s için Vortex.
10. Tüpleri tekrar ultrasonik su banyosuna 10 dakika boyunca yerleştirin.
11. 10 s için yavaşça Vortex (1400/dk).
12. % 70 etanol ile tüpleri dezenfekte edin ve steril hücre kültürü kaputu altında aktarın.
13. Solüsyonu bir 40 μm Mesh ile yeni bir steril 15 mL tüpüne filtreleyin.
14. Tüp Santrifüjü 500 x g 5 dk.
15. Süpernatant kaldırmak ve taze orta 1 ml Pelet pelletini.
16. Hücreleri uygun bir hücre kültürü gemisine (örn. 6-kuyu plakası) aktarın ve gemiyi, 37 °C ve% 5 CO₂' de bir gecede hücre kültürü kuluçyanına yerleştirin.
17. Ertesi gün, orta çıkarın, PBS ile 3 kez yıkayın, sonra taze orta ekleyin (eklenen hacim seçim hücre kültürü gemisi bağlıdır, 2 mL iyi başına 6-kuyu plaka vb.).
18. Her gün ortamı değiştirin.
    Not: fibroblastlar% 90 optik konfluence ulaştıktan sonra bölünebilir (genellikle 5-7 gün sonra).

Sonuçlar

Bu protokolün yetişkin fibroblastları katı duvar dokusundan yalıtmak için yeteneği gösterildi. İmmünofluoresesans boyama veya proliferasyon deneyleri (Şekil 2D-F, Şekil 5A) gibi sonraki deneyler için kullanılabilecek fibroblastlar elde edildi.

Erişkin fibroblastlar genellikle monolayers^12,18büyümek birden fazla hücresel süre...

Tartışmalar

Mortalize fibroblast hücre hatları ile karşılaştırıldığında, primer fibroblastlar çeşitli avantajlar sunar. Yüksek kalitede ve miktarda verimli bir şekilde maliyet yalıtılabilir. Ayrıca, primer kültürler, elde edilen sonuçların güvenilirliğini artıran ve sadece hücre kültürü eserlerinin incelenmesi olasılığını azaltan birden fazla kişiden hücre Etüdü olanağı sunar. Yeni primer kültürlerin sürekli üretimi, tekrarlanan geçişte²¹' den sonra sıklıkla meyd...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	T4049-100ML
Antibiotics	Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA	Gibco LS15140148	Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL)
Cell culture hood	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	51023608	HeraSafe KSP15
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	50049176	BBD 6220
Cell culture plates	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	depends on vessel	6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction	VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany	20727400	BVC professional suction
Cell strainer (mesh)	Corning, Tewksbury, USA	431750	40 µm Nylon
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	75007213	Megafuge 8R
Cordless pipetting controller	Hirschmann, Eberstadt, Germany	9907200	Pipetus
Disposable pipette tips	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL)
Disposable plastic pipettes	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL
Disposable sterile scalpel	Myco Medical, Cary, USA	n.a.	Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	41965-062	High glucose
Eppendorf tubes	Eppendorf, Hamburg, Germany	depends on volume	50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL
Fetal calf serum (FCS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	F2442-50ML
Collagenase blend	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	5401020001	Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D8537-500ML	500 mL
Senescence detection kit	Abcam, Cambridge, UK	ab65351
Shaker/ Vortex	IKA, Staufen im Breisgau, Germany	n.a.	MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	Falcon 352095	BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL)
Ultrasonic water bath	BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany	312	Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic)	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	NR 82
Surgical scissors	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	eq 1060.09
Surgical forceps	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	BD577