Isolação adulta preliminar ultra-som-aumentada do fibroblasto

Resumo

Nós apresentamos um protocolo para isolar fibroblastos adultos preliminares em uma maneira fácil, rápida e de confiança, performable por novatos (por exemplo, estudantes). O procedimento combina a digestão enzimática do tecido e a agitação mecânica com ondas ultra-sônicas para obter fibroblastos primários. O protocolo pode facilmente ser adaptado às exigências experimentais específicas (por exemplo, tecido humano).

Resumo

Os fibroblastos adultos primários tornaram-se uma importante ferramenta para estudar fibrose, interações fibroblásticas e inflamação em todos os tecidos do corpo. Desde que os fibroblastos preliminares não podem dividir indefinidamente devido à diferenciação do Miofibroblasto ou à indução da senescência, as culturas novas devem ser estabelecidas regularmente. No entanto, existem vários obstáculos a superar durante os processos de desenvolvimento de um protocolo de isolamento confiável e isolamento primário de fibroblastos: o grau de dificuldade do método (especialmente para iniciantes), o risco de contaminação bacteriana, o tempo necessário até que os fibroblastos primários possam ser utilizados para experimentos, e subsequente qualidade e viabilidade celular. Neste estudo, um protocolo rápido, confiável e fácil de aprender para isolar e cultura fibroblastos adultos primários do coração do mouse, pulmão, fígado e rim combinando digestão enzimática e agitação ultra-sônica é fornecido.

Introdução

Os fibroblastos são células planas, em forma de fuso, com múltiplos processos de stellate e um retículo endoplasmático áspero^1,2. Um fibroblasto médio mede 30-100 μm e tem uma esperança de vida de 57 ± 3 dias^1,3. A duração média do ciclo celular de fibroblastos humanos varia de 16-48 h, dependendo das condições de cultura⁴. Há evidências de que a capacidade replicativa e a qualidade funcional dos fibroblastos primários cultivados se correlacionam negativamente com a idade do doador, sugerindo que os doadores mais jovens (animais ou pacientes) devam ser preferidos se possível^5,6 .

Os fibroblastos constituem um tipo de célula predominante da maioria dos tecidos corporais de mamíferos. Apesar de sua presença onipresente, a identificação molecular dos fibroblastos ainda é um desafio⁷. Os fibroblastos migram para desenvolver tecidos e órgãos de diferentes fontes durante o desenvolvimento embrionário⁸. Por esta razão, há uma pletora de proteínas do marcador que podem ser encontradas nos fibroblasto visto que as proteínas originais do marcador, que estão atuais em cada população do fibroblasto e exclusivas para fibroblastos, são ainda ausentes. Assim, os padrões de expressão de vários marcadores reconhecidos são geralmente usados para identificar fibroblastos. Entre os marcadores mais reconhecidos estão vimentina, proteína de superfície fibroblástica humana (hfsp), receptor de domínio filhote 2 (DDR2) e actina de músculo liso alfa (αsma).

Os fibroblastos são os principais tipos de células produtoras de matriz extracelular (ECM). Assim, os fibroblastos mantêm uma arquitetura de tecido ordenada e fornecem suporte mecânico para as células vizinhas¹. O equilíbrio entre a síntese e a degradação do ECM é um processo bem regulado. Os deslocamentos para a síntese marcam o começo do depósito excessivo do ECM que, se não terminado, conduz à fibrose. A fibrose é mediada por miofibroblastos, que se originam de fibroblastos ativados submetidos a alterações moleculares e fenotípicas. Uma indicação dos miofibroblastos é secretion realçado do ECM e dos citocinas e a expressão de microfilamentos arranjados ordenadamente de αsma⁹.

Os fibroblastos primários têm sido os holofotes de pesquisas recentes com foco em fibrose, inflamação tecidual e interações fibroblastos-câncer-células^10,11. Entretanto, para estudar eficazmente Propriedades do fibroblasto na saúde e na doença, é necessário isolar fibroblastos adultos preliminares viáveis em uma base regular. Existem vários métodos disponíveis para isolar os fibroblastos^12,13,14. Os três principais métodos de isolamento de fibroblastos são o crescimento dos pedaçosde tecido¹², a digestão enzimática do tecido¹⁵e a perfusão enzimática de órgãos ocos^9,13,16. A vantagem do crescimento é um processo de isolamento suave sem degradação celular enzimática. De um lado, as culturas do conseqüência exigem geralmente períodos prolongados da cultura até que as pilhas possam ser usadas para experiências. A digestão enzimática comum é rápida, mas tem um risco de contaminação com outros tipos de células (por exemplo, células endoteliais) ou bactérias no processo de agitação, o que é necessário para dissolver mecanicamente o tecido. Além disso, esses métodos são muitas vezes elaborados e exigem tempo e habilidade para aprender.

Em relação à importância dos fibroblastos primários na pesquisa, ainda há a necessidade de otimizar as abordagens de isolamento de células existentes em termos de rapidez, simplicidade e confiabilidade. Aqui, um novo método de isolamento de fibroblastos enzimáticos baseados em ultra-som que fornece células de alta qualidade é fornecido.

Protocolo

O seguinte protocolo segue as diretrizes institucionais de cuidados com os animais da Technische Universität Dresden, Alemanha (número do arquivo: T 2014/4), bem como as diretrizes de cuidados com os animais internacionalmente aceites (FELASA)¹⁷. A Figura 1 visualiza o processo de isolamento da célula.

1. preparando a configuração, material e mídia

1. Prepare o meio de cultura celular, solução de PBS, solução de estoque de mistura de colagenase (reconstituir 50 mg de mistura de colagenase liofilizada em 12 ml de água ultrapura estéril) e solução de tripsina de 0,25%.
2. Aqueça o meio, a PBS e a solução de tripsina para 37 ° c.
3. Pré-aqueça o banho de água Ultrassônico a 37 ° c.
4. Desinfete fórceps, uma espátula de aço inoxidável, bipéis (2x bipels por órgão) e 2 copos de vidro com 70% de etanol e coloque esses materiais a capa de cultura celular.
5. Encha um copo com 70% de etanol e outro com água estéril ou solução de PBS. Estes copos são obrigados a desinfectar e lavar o instrumento após cada procissão de órgão.
6. Coloque tubos de plástico estéreis de 15 mL contendo PBS frio em gelo molhado. O número de tubos depende do número de órgãos que você deseja isolar os fibroblastos.

2. dissecção do rato e remoção de órgãos

1. Use dois pares de luvas um acima do outro, assim que o primeiro par pode ser removido assim que o animal for dissecado.
   Nota: este procedimento impede que as bactérias do animal peles e pele de espalhar sobre os órgãos.
2. Eutanizar o rato (por exemplo, luxação cervical) e fixar a carcaça com agulhas para cada membro a uma almofada de poliestireno.
3. Desinfete a carcaça do rato usando 70% de spray de etanol. Certifique-se que a pele está encharcada em etanol para que o cabelo não vai girar para cima.
4. Corte a pele direita acima do trato urogenital usando fórceps cirúrgico e tesouras atraumatic. Corte a pele ao lado da linha do meio desde o ponto da incisão inicial até o pescoço (3-4 cm) e adicione cortes de alívio nos membros.
   Cuidado: não perfurar a camada muscular nesta etapa para evitar a contaminação bacteriana!
5. Fixe a pele à almofada da espuma de poliestireno para ter o acesso óptimo à musculatura que cobre a cavidade abdominal.
6. Desinfecte a musculatura abdominal duas vezes usando 70% de etanol. Deixe o etanol secar antes de prosseguir para o próximo passo.
7. Retire o primeiro par de luvas. Use um novo, estéril conjunto de fórceps e tesouras.
8. Abra a cavidade abdominal e o tórax, incitando a camada muscular com tesoura cirúrgica para remover suavemente os órgãos de escolha. Portanto, segure o órgão suavemente com fórceps cirúrgico (não furar o órgão, usar a pressão mínima) e cortar os vasos sanguíneos de fornecimento perto do ponto de entrada no órgão com tesouras.
9. Coloque os órgãos nos tubos estéreis contendo PBS frio. Feche os tubos firmemente. Coloque os tubos em gelo molhado até continuar com a etapa 3,1.

3. tecido mincing, digestão e extração celular

1. Transfira os tubos a capa estéril da cultura de pilha.
   Cuidado: usar um par de luvas frescas e desinfectar os tubos com 70% de etanol antes de transferi-los o capô!
2. Leve o órgão para fora do tubo de 15 mL usando fórceps estéril. Coloque o órgão em uma metade de um prato de Petri estéril de 6 cm e lave o órgão brevemente com PBS para remover o excesso de sangue. Transfira o órgão para a segunda metade do prato de Petri, retire o excesso de PBS.
3. Mince o tecido usando dois bipels estéreis. Os fragmentos restantes do tecido não devem ser maiores do que 1-2 milímetros.
4. Transfira o tecido picado para um novo tubo estéril de 15 mL utilizando a espátula estéril e adicione 2 mL de solução de tripsina a 0,25%. Coloc o tubo em uma incubadora da cultura de pilha em 37 ° c por 5 minutos.
5. Vórtice do tubo suavemente (circa 1400/min) para 10 s.
6. Pare a reação da tripsina a capa de cultura celular adicionando 4 mL de meio de cultura de células contendo FCS (meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM), por exemplo).
7. Adicionar 250 μL de solução de mistura de colagenases a cada tubo contendo tecido cardíaco ou pulmonar e 100 μL para rim ou fígado, respetivamente.
8. Coloque os tubos em um banho de água Ultrassônico (37 ° c) e ative o sonicador ultra-sônico por 10 min.
   Nota: o banho de água Ultrassônico utilizado neste protocolo tem uma frequência de operação de 35 kHz e uma potência máxima de 320 W.
9. Vórtice os tubos suavemente (circa 1400/min) para 10 s.
10. Coloque os tubos novamente no banho de água ultra-sônica por 10 min.
11. Vortex suavemente (cerca de 1400/min) para 10 s.
12. Desinfete os tubos com 70% de etanol e transfira-os a capa de cultura celular estéril.
13. Filtre a solução com uma malha de 40 μm em um novo tubo estéril de 15 mL.
14. Centrifugue o tubo a 500 x g durante 5 min.
15. Retire o sobrenadante e ressuscitem o pellet em 1 mL de meio fresco.
16. Transfira as pilhas em uma embarcação apropriada da cultura da pilha (por exemplo, placa de 6 poços) e coloc a embarcação na incubadora da cultura da pilha durante a noite em 37 ° c e em 5% CO₂.
17. No dia seguinte, retire o meio, lave 3 vezes com PBS, em seguida, adicione o meio fresco (o volume adicionado depende da embarcação de cultura de células de escolha, 2 mL por poço de uma placa de 6 poços, etc.).
18. Mude o meio a cada outro dia.
    Nota: os fibroblastos podem ser divididos depois de atingir a confluência óptica de 90% (geralmente após 5-7 dias).

Resultados

A habilidade deste protocolo de isolar fibroblasto adultos do tecido murino contínuo foi demonstrada. Foram obtidos fibroblastos viáveis que poderiam ser utilizados para experimentos subsequentes, como coloração por imunofluorescência ou experimentos de proliferação (Figura 2D-F, Figura 5A).

Os fibroblastos adultos são células planas em forma de eixo com múltiplos processos celulares que tip...

Discussão

Comparado às linhas de pilha imortalizado do fibroblasto, os fibroblastos preliminares oferecem diversas vantagens. Eles podem ser isolados custo efetivamente em alta qualidade e quantidade. Além disso, as culturas primárias oferecem a possibilidade de estudar células de múltiplos indivíduos, o que aumenta a confiabilidade dos resultados obtidos e diminui a probabilidade de meramente estudar artefatos de cultura celular. A geração contínua de novas culturas primárias previne alterações genéticas que comument...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	T4049-100ML
Antibiotics	Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA	Gibco LS15140148	Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL)
Cell culture hood	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	51023608	HeraSafe KSP15
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	50049176	BBD 6220
Cell culture plates	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	depends on vessel	6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction	VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany	20727400	BVC professional suction
Cell strainer (mesh)	Corning, Tewksbury, USA	431750	40 µm Nylon
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	75007213	Megafuge 8R
Cordless pipetting controller	Hirschmann, Eberstadt, Germany	9907200	Pipetus
Disposable pipette tips	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL)
Disposable plastic pipettes	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL
Disposable sterile scalpel	Myco Medical, Cary, USA	n.a.	Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	41965-062	High glucose
Eppendorf tubes	Eppendorf, Hamburg, Germany	depends on volume	50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL
Fetal calf serum (FCS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	F2442-50ML
Collagenase blend	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	5401020001	Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D8537-500ML	500 mL
Senescence detection kit	Abcam, Cambridge, UK	ab65351
Shaker/ Vortex	IKA, Staufen im Breisgau, Germany	n.a.	MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	Falcon 352095	BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL)
Ultrasonic water bath	BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany	312	Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic)	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	NR 82
Surgical scissors	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	eq 1060.09
Surgical forceps	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	BD577