Ультразвуковое дополненное первичное взрослое фибробластновая изоляция

Резюме

Мы представляем протокол для изолировать первичные фибробласты для взрослых простым, быстрым и надежным способом, выполняемым новичками (например, студентами). Процедура сочетает в себе ферментативное пищеварение тканей и механическое возбуждение с ультразвуковыми волнами для получения первичных фибробластов. Протокол можно легко адаптировать к конкретным экспериментальным требованиям (например, к тканям человека).

Аннотация

Первичные фибробласты для взрослых стали важным инструментом для изучения фиброза, взаимодействия фибробластов и воспаления во всех тканях организма. Поскольку первичные фибробласты не могут делиться бесконечно из-за дифференциации миофибробластов или индукции сенесценции, необходимо регулярно устанавливать новые культуры. Однако в ходе процессов разработки надежного протокола изоляции и первичной изоляции фибробластов существует несколько препятствий: степень сложности метода (особенно для начинающих), риск бактериального загрязнения, требуется время, пока первичные фибробласты могут быть использованы для экспериментов, и последующее качество клеток и жизнеспособность. В этом исследовании, быстрый, надежный и простой в освоении протокол для изоляции и культуры первичных взрослых фибробластов от мыши сердца, легких, печени и почек сочетания ферментативного пищеварения и ультразвукового возбуждения предоставляется.

Введение

Фибробласты плоские, шпиндель-образные клетки с несколькими процессами стеллатаи обширным грубым эндоплазмическим ретикулумом 1,². Средний фибробласт измеряет 30 - 100 мкм и имеет продолжительность жизни 57 и 3 дня^1,3. Средняя продолжительность клеточного цикла фибробластов человека колеблется от 16до 48 ч в зависимости от условий культуры 4. Имеются данные, свидетельствующие о том, что репликационные возможности и функциональное качество культивируемых первичных фибробластов негативно коррелирует с возрастом донора, что позволяет по возможности предпочесть более молодых доноров (животных или пациентов) по возможности^5,6 .

Фибробласты представляют собой преобладающий клеточный тип большинства тканей тела млекопитающих. Несмотря на их повсеместное присутствие, молекулярная идентификация фибробластов по-прежнему является проблемой⁷. Фибробласты мигрируют к развивающимся тканями органам из разных источников во время эмбрионального развития 8. По этой причине, есть множество маркерных белков, которые могут быть найдены в фибробластах, в то время как уникальные маркерные белки, которые присутствуют в каждой популяции фибробластов и эксклюзивные для фибробластов, по-прежнему отсутствуют. Таким образом, для идентификации фибробластов обычно используются шаблоны выражения нескольких распознаваемых маркеров. Среди наиболее узнаваемых маркеров – виментин, белок поверхности фибробласта человека (hFSP), рецептор домена дискоидин 2 (DDR2) и альфа-гладкий мышечный актин (ЗСМА).

Фибробласты являются основным внеклеточным матричным (ECM)- производящим тип клетки. Таким образом, фибробласты поддерживают упорядоченную архитектуру тканей и обеспечивают механическую поддержку соседних клеток¹. Баланс между синтезом ECM и деградацией является хорошо регулируемым процессом. Сдвиги в сторону синтеза знаменуют собой начало чрезмерного осаждения ECM, которое, если не прекращается, приводит к фиброзу. Фиброз опосредовано миофибробластами, которые происходят из активированных фибробластов, претерпеваемых молекулярными и фенотипическими изменениями. Одной из отличительных черт миофибробластов является усиленная секреция ЭКМ и цитокинов и выражение упорядоченных микрофиламентов⁹.

Первичные фибробласты были в центре внимания последних исследований упором на фиброз, воспаление тканей и фибробласт-рак-клеток взаимодействий^10,11. Однако, чтобы эффективно изучать фибробластные свойства в здоровье и болезни, необходимо изолировать жизнеспособные первичные фибробласты взрослого на регулярной основе. Есть несколько методов, доступных для изоляции фибробластов^12,13,14. Три основных метода фибробластной изоляции являются выращение из тканей куски^12,ферментативное пищеварение ткани¹⁵, и ферментативной перфузии полых органов^9,13,16. Преимуществом роста является мягкий процесс изоляции без ферментативной деградации клеток. С другой стороны, культуры роста обычно требуют длительных периодов культуры, пока клетки могут быть использованы для экспериментов. Общее ферментативное пищеварение быстро, но несет риск заражения другими типами клеток (например, эндотелиальными клетками) или бактериями в процессе агитации, что необходимо для механического растворения ткани. Кроме того, эти методы часто являются сложными и требуют времени и навыков, чтобы узнать.

Что касается важности первичных фибробластов в исследованиях, то по-прежнему существует необходимость оптимизации существующих подходов к изоляции клеток с точки зрения быстроты, простоты и надежности. Здесь предоставляется новый ультразвуковой метод ферментатической изоляции фибробластов, обеспечивающий высокое качество клеток.

протокол

Следующий протокол следует институциональным руководящим принципам по уходу за животными ВДШТовского университета, Германия (Номер файла: T 2014/4), а также международно признанным руководящим принципам по уходу за животными (FELASA)¹⁷. Рисунок 1 визуализирует процесс изоляции клеток.

1. Подготовка установки, материалов и средств массовой информации

1. Подготовка среды клеточной культуры, раствор PBS, коллагенеза смесь бульона решение (восстановить 50 мг лиофилизированной коллагеназе смесь в 12 мл стерильной ультрачистой воды), и 0,25% трипсина раствора.
2. Разогрейте среду, PBS и раствор трипсина до 37 градусов по Цельсию.
3. Разогреть ультразвуковую водяную ванну до 37 градусов по Цельсию.
4. Дезинфицирующие щипцы, шпатель из нержавеющей стали, скальпели (2x скальпеля на орган) и 2 стеклянных стакана с 70% этанола и поместите эти материалы под капот клеточной культуры.
5. Заполните один стакан с 70% этанола, а другой стерильной водой или РАСТВОРом PBS. Эти клювы необходимы для дезинфекции и мыть прибор после каждого органа процессии.
6. Поместите стерильные пластиковые трубки 15 мл, содержащие холодные PBS, на мокрый лед. Количество труб зависит от количества органов, от которых вы хотите изолировать фибробласты.

2. Рассечение мышей и удаление органов

1. Носите две пары перчаток один над другой, так что первая пара может быть удалена, как только животное было вскрыто.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура предотвращает распространение бактерий из меха и кожи животного по органам.
2. Эвтанизировать мышь (например, вывих шейки матки) и прикрепить тушу с помощью иглки к каждой конечности к полистироловой площадке.
3. Дезинфекция туши мыши с помощью 70% этанола спрей. Убедитесь, что мех пропитан этанолом, чтобы волосы не закружились.
4. Вырежьте мех прямо над урогенитальным трактом с помощью хирургических щипц и травматических ножниц. Вырежьте кожу рядом со средней линией от точки первоначального разреза до шеи (3 - 4 см) и добавьте рельефные порезы на конечностях.
   ВНИМАНИЕ: Не перфорировать мышечный слой на этом этапе, чтобы избежать бактериального загрязнения!
5. Прикрепите кожу к прокладке пены полистирола, чтобы иметь оптимальный доступ к мускулатуре, покрывающей брюшную полость.
6. Дезинфекция мускулатуры брюшной полости дважды с помощью 70% этанола. Пусть этанол высохнет, прежде чем перейти к следующему шагу.
7. Снимите первую пару перчаток. Используйте новый стерильный набор щипц и ножниц.
8. Откройте брюшную полость и грудную клетку, разрезая мышечный слой хирургическими ножницами, чтобы аккуратно удалить органы по выбору. Поэтому держите орган осторожно хирургическими щипками (не прокалывайте орган, используйте минимальное давление) и разрезайте поставляя кровеносные сосуды возле точки входа в орган ножницами.
9. Положите органы в стерильные трубки, содержащие холодные PBS. Закройте трубки плотно. Поместите трубки на мокрый лед до тех пор, пока не продолжитес шаг 3.1.

3. Тканевая обмокание, пищеварение и извлечение клеток

1. Перенесите трубки под стерильный капюшон культуры клеток.
   ВНИМАНИЕ: Носите новую пару перчаток и дезинфицировать трубки с 70% этанола перед передачей их под капотом!
2. Вынизуйте орган из трубки 15 мл с помощью стерильных щиптов. Поместите орган на половину стерильной 6 см Петри блюдо и мыть орган кратко с PBS, чтобы удалить избыток крови. Перенесите орган во вторую половину чашки Петри, удалите избыток PBS.
3. Фарш ткани с помощью двух стерильных скальпелей. Остальные фрагменты ткани не должны быть больше 1 - 2 мм.
4. Перенесите измельченную ткань в новую стерильную трубку 15 мл с помощью стерильного шпателя и добавьте 2 мл раствора трипсина 0,25%. Поместите трубку в инкубатор клеточной культуры при 37 градусах по Цельсию в течение 5 мин.
5. Вихрь трубки мягко (около 1400/мин) в течение 10 с.
6. Остановите реакцию трипсина под капотом клеточной культуры, добавив 4 мЛ FCS-содержащей среды клеточной культуры (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), например).
7. Добавьте 250 зЛ раствора смеси коллагеназа к каждой трубке, содержащей ткани сердца или легких, и 100 Л л для почек или печени, соответственно.
8. Поместите трубки в ультразвуковую водяную ванну (37 градусов по Цельсию) и активируйте ультразвуковой звуковой элемент в течение 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ультразвуковая водяная ванна, используемая в этом протоколе, имеет операционную частоту 35 кГц и максимальную мощность 320 Вт.
9. Вихрь трубки мягко (около 1400/мин) в течение 10 с.
10. Поместите трубки снова в ультразвуковой водяной бане в течение 10 минут.
11. Вихрь мягко (около 1400/мин) на 10 с.
12. Дезинфекция труб с 70% этанола и передать их под стерильным капюшоном культуры клеток.
13. Фильтр раствора с 40 мкм сетки в новую стерильную трубку 15 мл.
14. Центрифуга трубки на 500 х г в течение 5 мин.
15. Удалите супернатант и resuspend гранулы в 1 мл свежей среде.
16. Перенесите клетки в подходящий сосуд клеточной культуры (например, 6-ну хорошо пластины) и поместите сосуд в инкубатор клеточной культуры на ночь при 37 градусах Цельсия и 5% CO_2.
17. На следующий день удалите среду, промойте 3 раза PBS, затем добавьте свежую среду (добавленный объем зависит от сосуда клеточной культуры выбора, 2 мл на колодец 6-хорошей пластины и т.д.).
18. Изменение среды через день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фибробласты могут быть разделены после достижения оптического слияния 90% (обычно через 5-7 дней).

Результаты

Была продемонстрирована способность этого протокола изолировать взрослые фибробласты из твердой ткани мурин. Были получены жизнеспособные фибробласты, которые могут быть использованы для последующих экспериментов, таких как иммунофлуоресцентное окрашивание или эксперименты по ра?...

Обсуждение

По сравнению с увековеченными фибробластными клеточными линиями, первичные фибробласты предлагают несколько преимуществ. Они могут быть изолированы экономически эффективно в высоком качестве и количестве. Кроме того, первичные культуры предлагают возможность изучения клеток у неск...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	T4049-100ML
Antibiotics	Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA	Gibco LS15140148	Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL)
Cell culture hood	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	51023608	HeraSafe KSP15
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	50049176	BBD 6220
Cell culture plates	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	depends on vessel	6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction	VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany	20727400	BVC professional suction
Cell strainer (mesh)	Corning, Tewksbury, USA	431750	40 µm Nylon
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	75007213	Megafuge 8R
Cordless pipetting controller	Hirschmann, Eberstadt, Germany	9907200	Pipetus
Disposable pipette tips	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL)
Disposable plastic pipettes	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL
Disposable sterile scalpel	Myco Medical, Cary, USA	n.a.	Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	41965-062	High glucose
Eppendorf tubes	Eppendorf, Hamburg, Germany	depends on volume	50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL
Fetal calf serum (FCS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	F2442-50ML
Collagenase blend	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	5401020001	Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D8537-500ML	500 mL
Senescence detection kit	Abcam, Cambridge, UK	ab65351
Shaker/ Vortex	IKA, Staufen im Breisgau, Germany	n.a.	MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	Falcon 352095	BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL)
Ultrasonic water bath	BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany	312	Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic)	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	NR 82
Surgical scissors	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	eq 1060.09
Surgical forceps	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	BD577