Aislamiento de fibroblastos para adultos primarios aumentados por ultrasonidos

Resumen

Presentamos un protocolo para aislar los fibroblastos adultos primarios de una manera fácil, rápida y confiable, realizable por principiantes (por ejemplo, estudiantes). El procedimiento combina la digestión del tejido enzimático y la agitación mecánica con ondas ultrasónicas para obtener fibroblastos primarios. El protocolo se puede adaptar fácilmente a requisitos experimentales específicos (por ejemplo, tejido humano).

Resumen

Los fibroblastos adultos primarios se han convertido en una herramienta importante para estudiar la fibrosis, las interacciones con los fibroblastos y la inflamación en todos los tejidos del cuerpo. Dado que los fibroblastos primarios no pueden dividirse indefinidamente debido a la diferenciación de miofibroblastos o a la inducción de la senescencia, se deben establecer periódicamente nuevos cultivos. Sin embargo, hay varios obstáculos que superar durante los procesos de desarrollo de un protocolo de aislamiento fiable y el aislamiento primario de fibroblastos en sí: el grado de dificultad del método (especialmente para principiantes), el riesgo de contaminación bacteriana, el tiempo necesario hasta que los fibroblastos primarios se puedan utilizar para experimentos, y la posterior calidad celular y viabilidad. En este estudio, se proporciona un protocolo rápido, confiable y fácil de aprender para aislar y cultivar fibroblastos adultos primarios del corazón del ratón, pulmón, hígado y riñón combinando digestión enzimática y agitación ultrasónica.

Introducción

Los fibroblastos son células planas en forma de husillo con múltiplesprocesos estelares y un extenso retículo endoplasmático áspero 1,^2. Un fibroblasto medio mide 30 - 100 m y tiene una vida útil de 57 a 3 días^1,3. La duración media del ciclo celular de los fibroblastos humanos oscila entre 16 y 48 h dependiendo de las condiciones de cultivo⁴. Existe evidencia de que la capacidad replicativa y la calidad funcional de los fibroblastos primarios cultivados se correlacionan negativamente con la edad del donante, lo que sugiere que se debe preferir a los donantes más jóvenes (animales o pacientes) si es posible^5,6 .

Los fibroblastos constituyen un tipo celular predominante de la mayoría de los tejidos corporales de mamíferos. A pesar de su presencia omnipresente, la identificaciónmolecular de los fibroblastos sigue siendo un desafío 7. Los fibroblastos migran a desarrollar tejidosy órganos de diferentes fuentes durante el desarrollo embrionario 8. Por esta razón, hay una plétora de proteínas marcadoras que se pueden encontrar en los fibroblastos, mientras que las proteínas marcadoras únicas, que están presentes en cada población de fibroblastos y exclusivas de los fibroblastos, todavía faltan. Por lo tanto, los patrones de expresión de varios marcadores reconocidos se utilizan generalmente para identificar fibroblastos. Entre los marcadores más reconocidos se encuentran la vimentina, la proteína superficial de fibroblastohumano humano (hFSP), el receptor de dominio de discoicina 2 (DDR2) y la actina muscular alfa suave (SMA).

Los fibroblastos son el tipo de célula que produce la matriz extracelular principal (ECM). De este tipo, los fibroblastos mantienen una arquitectura de tejido ordenada y proporcionan soporte mecánico para las células vecinas¹. El equilibrio entre la síntesis y la degradación de ECM es un proceso bien regulado. Los cambios hacia la síntesis marcan el comienzo de una deposición excesiva de ECM que, si no se termina, conduce a la fibrosis. La fibrosis está mediada por miofibroblastos, que se originan a partir de fibroblastos activados sometidos a cambios moleculares y fenotípicos. Una característica distintiva de los miofibroblastos es la secreción mejorada de ECM y citoquinas y la expresión de microfilamentos ordenados de la ACM⁹.

Los fibroblastos primarios han estado en el centro de atención de investigaciones recientes centradas en la fibrosis, la inflamación de los tejidos y las interacciones fibroblastos-cáncer-células^10,11. Sin embargo, para estudiar eficazmente las propiedades de los fibroblastos en la salud y la enfermedad, es necesario aislar los fibroblastos adultos primarios viables de forma regular. Existen varios métodos disponibles para aislar fibroblastos^12,13,14. Los tres principales métodos de aislamiento de fibroblastos son el crecimiento de los trozos de tejido^12,la digestión de tejido enzimático^15,y la perfusión enzimática de órganos huecos^9,13,16. La ventaja del crecimiento es un proceso de aislamiento suave sin degradación celular enzimática. Por otro lado, los cultivos de crecimiento generalmente requieren períodos de cultivo prolongados hasta que las células se pueden utilizar para experimentos. La digestión enzimática común es rápida, pero conlleva un riesgo de contaminación con otros tipos de células (por ejemplo, células endoteliales) o bacterias en el proceso de agitación, que es necesario para disolver mecánicamente el tejido. Además, estos métodos a menudo son elaborados y requieren tiempo y habilidad para aprender.

En cuanto a la importancia de los fibroblastos primarios en la investigación, todavía es necesario optimizar los enfoques de aislamiento celular existentes en términos de rapidez, simplicidad y fiabilidad. Aquí, se proporciona un nuevo método de aislamiento de fibroblastos enzimáticos a base de ultrasonidos que proporciona células de alta calidad.

Protocolo

El siguiente protocolo sigue las directrices institucionales de cuidado de animales de la Universidad Tecnológica de Dresde, Alemania (Número de fichero: T 2014/4), así como las directrices de cuidado animal internacionalmente aceptadas (FELASA)¹⁷. La Figura 1 visualiza el proceso de aislamiento de celda.

1. Preparación de la configuración, material y medios de

1. Preparar el medio de cultivo celular, solución de PBS, solución de mezcla de colagenasa (reconstituir 50 mg de mezcla de colagenasa liofilizada en 12 ml de agua ultrapura estéril) y 0.25% de solución de trippsina.
2. Calentar el medio, el PBS y la solución de trippsina a 37 oC.
3. Precalentar el baño de agua ultrasónica a 37 oC.
4. Desinfecte fórceps, una espátula de acero inoxidable, bisturíes (2 x bisturíes por órgano) y 2 vasos de vidrio con 70% de etanol y coloque estos materiales debajo de la campana de cultivo celular.
5. Llene un vaso de precipitados con 70% de etanol y el otro con agua estéril o solución de PBS. Estos vasos son necesarios para desinfectar y lavar el instrumento después de cada procesión de órgano.
6. Coloque tubos de plástico estériles de 15 ml que contengan PBS frío sobre hielo húmedo. El número de tubos depende del número de órganos de los que desea aislar los fibroblastos.

2. Disección del ratón y extracción de órganos

1. Use dos pares de guantes uno encima del otro, por lo que el primer par se puede quitar tan pronto como el animal ha sido diseccionado.
   NOTA: Este procedimiento evita que las bacterias del pelaje y la piel del animal se propaguen sobre los órganos.
2. Eutanasia el ratón (p. ej., luxación cervical) y clava la carcasa con agujas en cada extremidad a una almohadilla de poliestireno.
3. Desinfecte la carcasa del ratón con un 70% de pulverización de etanol. Asegúrese de que el pelaje esté empapado en etanol para que el cabello no se arremolina.
4. Cortar el pelaje justo por encima del tracto urogenital usando fórceps quirúrgicos y tijeras atraumáticas. Cortar la piel junto a la línea media desde el punto de la incisión inicial hasta el cuello (3 - 4 cm) y añadir cortes de alivio en las extremidades.
   ADVERTENCIA: ¡No perfore la capa muscular en este paso para evitar la contaminación bacteriana!
5. Anclar la piel a la almohadilla de espuma de poliestireno para tener un acceso óptimo a la musculatura que cubre la cavidad abdominal.
6. Desinfectar la musculatura abdominal dos veces con 70% de etanol. Deje que el etanol se seque antes de continuar con el siguiente paso.
7. Retire el primer par de guantes. Usa un nuevo conjunto estéril de fórceps y tijeras.
8. Abra la cavidad abdominal y el tórax inclinando la capa muscular con tijeras quirúrgicas para eliminar suavemente los órganos de elección. Por lo tanto, sostenga el órgano suavemente con fórceps quirúrgicos (no perfore el órgano, use una presión mínima) y corte los vasos sanguíneos suministradores cerca del punto de entrada en el órgano con tijeras.
9. Coloque los órganos en los tubos estériles que contienen PBS frío. Cierre bien los tubos. Coloque los tubos sobre hielo húmedo hasta que continúe con el paso 3.1.

3. Picado de tejido, digestión y extracción celular

1. Transfiera los tubos debajo de la campana de cultivo celular estéril.
   ADVERTENCIA: Use un par de guantes frescos y desinfecte los tubos con 70% de etanol antes de transferirlos bajo el capó!
2. Saque el órgano del tubo de 15 ml con fórceps estériles. Coloque el órgano en la mitad de una placa estéril de 6 cm de Petri y lave el órgano brevemente con PBS para eliminar el exceso de sangre. Transfiera el órgano a la segunda mitad de la placa de Petri, elimine el exceso de PBS.
3. Mince el tejido usando dos bisturíes estériles. Los fragmentos de tejido restantes no deben ser mayores de 1 - 2 mm.
4. Transfiera el tejido picado a un nuevo tubo estéril de 15 ml utilizando la espátula estéril y agregue 2 ml de solución de trippsina al 0,25%. Coloque el tubo en una incubadora de cultivo celular a 37 oC durante 5 minutos.
5. Vortex el tubo suavemente (circa 1400/min) durante 10 s.
6. Detenga la reacción de trippsina bajo el capó del cultivo celular agregando un medio de cultivo celular que contiene FCS de 4 ml (medio de águila modificado (DMMEM) de Dulbecco, por ejemplo).
7. Añadir 250 l de solución de mezcla de colagenasa a cada tubo que contenga tejido cardíaco o pulmonar y 100 l para riñón o hígado, respectivamente.
8. Colocar los tubos en un baño de agua ultrasónico (37 oC) y activar el sonicador ultrasónico durante 10 minutos.
   NOTA: El baño de agua ultrasónico utilizado en este protocolo tiene una frecuencia de funcionamiento de 35 kHz y una potencia máxima de 320 W.
9. Vortex los tubos suavemente (circa 1400/min) durante 10 s.
10. Coloque los tubos de nuevo en el baño de agua ultrasónico durante 10 minutos.
11. Vórtice suavemente (circa 1400/min) durante 10 s.
12. Desinfectar los tubos con 70% de etanol y transferirlos bajo la campana de cultivo celular estéril.
13. Filtrar la solución con una malla de 40 m en un nuevo tubo estéril de 15 ml.
14. Centrifugar el tubo a 500 x g durante 5 min.
15. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de medio fresco.
16. Transfiera las células a un recipiente de cultivo celular adecuado (p. ej., placa de 6 pocillos) ycoloque el recipiente en la incubadora de cultivo celular durante la noche a 37 oC y 5% CO 2.
17. Al día siguiente, retirar el medio, lavar 3 veces con PBS, a continuación, añadir medio fresco (el volumen añadido depende del recipiente de cultivo celular de elección, 2 ml por pozo de una placa de 6 pocillos, etc.).
18. Cambia el medio cada dos días.
    NOTA: Los fibroblastos se pueden dividir después de alcanzar una confluencia óptica del 90% (generalmente después de 5-7 días).

Resultados

Se demostró la capacidad de este protocolo para aislar los fibroblastos adultos del tejido murino sólido. Se obtuvieron fibroblastos viables que podrían utilizarse para experimentos posteriores, como la tinción de inmunofluorescencia o experimentos de proliferación (Figura2D-F, Figura 5A).

Los fibroblastos adultos son células planas en forma de husillo con múltiples procesos celulares que norma...

Discusión

En comparación con las líneas celulares de fibroblastos inmortalizadas, los fibroblastos primarios ofrecen varias ventajas. Pueden ser aislados de manera rentable en alta calidad y cantidad. Además, los cultivos primarios ofrecen la posibilidad de estudiar células de múltiples individuos, lo que aumenta la fiabilidad de los resultados obtenidos y disminuye la probabilidad de estudiar simplemente los artefactos de cultivo celular. La generación continua de nuevos cultivos primarios previene las alteraciones genétic...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	T4049-100ML
Antibiotics	Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA	Gibco LS15140148	Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL)
Cell culture hood	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	51023608	HeraSafe KSP15
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	50049176	BBD 6220
Cell culture plates	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	depends on vessel	6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction	VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany	20727400	BVC professional suction
Cell strainer (mesh)	Corning, Tewksbury, USA	431750	40 µm Nylon
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	75007213	Megafuge 8R
Cordless pipetting controller	Hirschmann, Eberstadt, Germany	9907200	Pipetus
Disposable pipette tips	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL)
Disposable plastic pipettes	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL
Disposable sterile scalpel	Myco Medical, Cary, USA	n.a.	Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	41965-062	High glucose
Eppendorf tubes	Eppendorf, Hamburg, Germany	depends on volume	50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL
Fetal calf serum (FCS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	F2442-50ML
Collagenase blend	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	5401020001	Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D8537-500ML	500 mL
Senescence detection kit	Abcam, Cambridge, UK	ab65351
Shaker/ Vortex	IKA, Staufen im Breisgau, Germany	n.a.	MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	Falcon 352095	BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL)
Ultrasonic water bath	BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany	312	Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic)	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	NR 82
Surgical scissors	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	eq 1060.09
Surgical forceps	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	BD577