JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويشكل الانتشار جزءا هاما من الوظيفة الخلوية ، وقراءه مشتركه تستخدم لتقييم السمية المحتملة للعقاقير الجديدة. ولذلك ، فان قياس الانتشار هو فحص يستخدم بكثرة في بيولوجيا الخلايا. نقدم هنا طريقه بسيطه ومتنوعة لقياس الانتشار يمكن استخدامها في الخلايا الملتصقة وغير الملتصقة.

Abstract

قدره الخلية علي التكاثر جزء لا يتجزا من الوظيفة العادية لمعظم الخلايا ، وخلل الانتشار هو في قلب العديد من عمليات المرض. ولهذه الأسباب ، فان قياس الانتشار أداه مشتركه تستخدم لتقييم وظيفة الخلية. ويمكن قياس تكاثر الخلايا ببساطه عن طريق العد ؛ ومع ذلك ، فان هذه وسيله غير مباشره لقياس الانتشار. أحدي الوسائل الشائعة للكشف المباشر عن الخلايا التي تستعد للتقسيم هي عن طريق دمج النظير النيونوسايد المسمي. وتشمل هذه التناظرية النيونوسايد المشعة 3ح-thymidine بالاضافه إلى النظير النيونوسايد غير المشعة مثل 5-برومو-2 ' ديوكسيريدين (brdu) و 5-ethynyl-2′-ديوكسيرادين (ايدو). يتم الكشف عن تاسيس EdU بالنقر علي الكيمياء ، والتي لديها العديد من المزايا بالمقارنة مع BrdU. وفي هذا التقرير ، نقدم بروتوكولا لقياس الانتشار بدمج النظام التعليمي. ويتضمن هذا البروتوكول خيارات لمختلف القراءات ، إلى جانب مزايا ومساوئ كل منها. ونناقش أيضا الأماكن التي يمكن فيها تحسين البروتوكول أو تغييره لتلبيه الاحتياجات المحددة للتجربة المخطط لها. وأخيرا ، فاننا نلمس الطرق التي يمكن بها تعديل هذا البروتوكول الأساسي لقياس نواتج أيض الخلايا الأخرى.

Introduction

الانتشار هو جزء هام من الوظيفة الخلوية1،2. السيطرة علي الانتشار يؤثر علي العمليات العادية مثل التنمية ، والعمليات المرضية مثل السرطان وامراض القلب والاوعيه الدموية. فرط النمو من خلايا العضلات الملساء الاوعيه الدموية, علي سبيل المثال, ويعتقد ان تكون مقدمه لتصلب الشرايين3. وتستخدم أيضا التغيرات في انتشار الخلايا لتقييم السمية المحتملة للعقاقير الجديدة. ونظرا لتاثيرها الواسع النطاق ، فان قياس الانتشار هو عماد العديد من المختبرات القائمة علي بيولوجيا الخلايا.

ويمكن قياس تكاثر الخلايا بمجرد عد الزنزانات إذا كان عدد سكان الخلية من الفائدة يقسم بسرعة إلى حد ما. بالنسبة للخلايا البطيءه النمو ، قد تكون عمليات عد الخلايا اقل حساسية. وغالبا ما يقاس الانتشار بإدماج النظير المسمي النيونوسايد. علي الرغم من ان معيار الذهب هو 3H-التاسيس thymidine, العديد من المختبرات الابتعاد عن هذه الطريقة نظرا لتوافر البدائل الأحدث, غير المشعة. وتشمل هذه الاصباغ الفلورية الخلوية ، والكشف عن دوره الخلايا البروتينات المرتبطة بها ، ودمج النظير النيونوسايد غير المشعة مثل 5-برومو-2 ' ديوكسيريدين (BrdU) و 5-ethynyl-2′-ديوكسيرادين (ايدو)4.

الاصباغ الخلوية ، مثل كاربوكسيفلوريسسين دياسيتات النجاح استر (cfse) ، والكشف عن انتشار لان كثافة نصفين الصبغة في كل مره يقسم الخلية5. ويشيع استخدام هذه التقنية في التدفق الخلوي للخلايا غير الملتصقة. لم يتم استخدامه كثيرا للخلايا الملتصقة ، ولكن مع الجيل الجديد من قراء لوحه التصوير قد يتغير هذا. وغالبا ما يستخدم الكشف عن البروتينات المرتبطة بدوره الخلية من خلال التقنيات القائمة علي الأجسام المضادة (قياس التدفق الخلوي ، مناعي ، الخ) للانسجه أو الخلايا غير الملتصقة. يجب ان تكون هذه الخلايا/الانسجه ثابته وتتخللها قبل تلطيخ. النظائر النيونوسيد BrdU و EdU متشابهة في النهج إلى 3H-الثيميدين ، ولكن من دون إزعاج من النشاط الإشعاعي. يتم الكشف عن دمج BrdU من قبل الأجسام المضادة BrdU ، التالي يجب ان تكون ثابته الخلايا وتتخللها قبل تلطيخ. الاضافه إلى ذلك ، يجب ان تعامل الخلايا مع DNase لفضح مرضبه BrdU.

يتم الكشف عن تاسيس EdU عن طريق النقر الكيمياء ، والتي المجموعات الالكيد وأزيد "انقر" معا في وجود النحاس الحفاز. يمكن لأي من المجموعتين ان تكون بمثابه الجزيء الحيوي المدمج أو جزيء الكشف4. النظائر النيونوسيد المتاحة تجاريا لديها مجموعه الالكاين المرفقة. بالنسبة لاختبارات الانتشار ، لذلك ، يتم الكشف عن التناظرية الوظيفية الالكالي الجانبية من قبل أزيد مترافق إلى صبغه فلورية أو علامة أخرى. دمج التعليمية له العديد من المزايا علي BrdU. أولا ، لأنه لم يتم العثور علي المجموعات الكيميه والأزيد في خلايا الثدييات ، وهذا التفاعل هو محدده للغاية مع خلفيه منخفضه6. لان كلا المجموعتين صغيره ، الخلايا لا تحتاج إلى الخضوع لمسخ الحمض النووي لفضح التناظرية النونوزيد كما هو مطلوب ل BrdU7. وأخيرا ، انقر فوق الكيمياء هو تنوعا للغاية ، ويمكن استخدامها لوضع العلامات الايضيه من الحمض النووي ، RNA ، البروتين ، الأحماض الدهنية ، والكربوهيدرات8،9،10،11. إذا كان الهدف الأيضي المسمي الفائدة علي سطح الخلية ، يمكن تسميه الخلايا الحية12. الاضافه إلى ذلك ، يمكن معالجه الخلايا لتلطيخ النيون المناعي مع الأجسام المضادة.

يصف البروتوكول التالي استخدام التاسيس EdU وانقر فوق الكيمياء لقياس الانتشار في خلايا العضلات الملساء الوعائية البشرية (الشكل 1). نعرض ثلاث طرق مختلفه لدمج ايدو يمكن قياسها ، والنتائج التمثيلية من كل منها ، ومزاياها وعيوبها. قياس الانتشار عن طريق النقر بالكيمياء مفيد بشكل خاص للخلايا الملتصقة والبطيءه النمو. الاضافه إلى ذلك ، يتم الحفاظ علي مورفولوجية الخلية بشكل جيد ويمكن أيضا تلطيخ المضادة للأجسام التي تقوم بها.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. الكشف عن ايدو باستخدام تسميه الفلورسنت

  1. حلول الأسهم
    1. اعداد الحل 5 مم ايدو الأسهم عن طريق أضافه 12.5 ملغ من ايدو إلى 10 مل من المقطر مزدوج ه2س.
    2. اعداد مكونات حل الملصقات: 200 مم تريس (3-هيدروكسي بروبيل تريازيلميثيل) أمين (THPTA) (100 ملغ في 1.15 mL ح2) ، 100 مم cuso4 (15.95 mg في 1 مل h2؛ جعل الطازجة) ، 10 ملم Cy3 picolyl-أزيد (1 ملغ في 95.3 ml h2o ، المخزنة في 5 μl قسامات في-20 درجه مئوية) ، و 1 م اسكوربات الصوديوم (200 ملغ في 1 مل H2؛ جعل الطازجة).
    3. اعداد محلول الأسهم resلازوردي في تركيز 0.15 ملغ/مل. تصفيه تعقيم وتخزين 1 مل قسامات في 4 ° c.
      ملاحظه: يتم الحصول علي العديد من المزامير المختلفة ، البيوتين ، والبيروكسيديز الفجل (الرسالة التالية).
  2. تسميه خلايا العضلات الملساء الاوعيه الدموية (VSMC) مع ايدو.
    ملاحظه: تم عزل VSMCs البشرية من الشرايين الحرقفيه عبر النمو من القطع المفسرة من الانسجه. عندما تزرع في المصل وسائل الاعلام الحرة مع الانسولين ، transferrin ، السيلينيوم هذه الخلايا التعبير عن علامات VSMC سموثيلين ، سلس العضلات ميوسين سلسله الثقيلة (SM-MHC) و SMC αactin13.
    1. لوحه خلايا العضلات الملساء الاوعيه الدموية في 2 × 104/مل في المتوسطة دولبيكو النسر المعدلة (dmem) في لوحه 96 جيدا.
      ملاحظه: تزرع الخلايا في 37 درجه مئوية في وسائط الخلايا العضلية الملساء مع 2 ٪ مصل الأبقار الجنينية.
    2. اختياري السماح لعده ساعات ليلا للانضمام. أضافه 20 μL resلازوردي الأسهم لكل بئر. احتضان في 37 درجه مئوية ل 3 ح. قراءه اشاره مضان في قارئ لوحه (560ex، 594em). استبدل الوسائط ب DMEM الجديد.
      ملاحظه: هذه الخطوة اختياريه. يتم استخدام resلازوردي لتطبيع أرقام الخلايا وحساب للتغير جيدا إلى حسنا في الطلاء14.
    3. أضافه الفوسفات المالحة مخزنه (تلفزيوني) أو الصفائح الدموية المشتقة عامل النمو (PDGF) 30 نانوغرام/مل إلى 3 − 6 ابار لكل علاج في بداية فتره الثقافة واحتضان ل 72 h.
    4. تمييع 5 ملم ايدو الأسهم إلى 1 ملم. أضافه 2 μL لكل بئر (التركيز النهائي 20 μM) لأخر 24 ح من فتره الثقافة 72 h. لا تقم باضافه EdU إلى مجموعه واحده من النسخ المتماثلة. ستستخدم هذه الآبار لتحديد الخلفية الفلورية/التلالؤ.
      ملاحظه: يتم تحسين مده الثقافة ووضع العلامات مع EdU لخلايا العضلات الملساء ولكن قد تحتاج إلى تعديل لكل نوع الخلية.
  3. إصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد (PFA).
    1. أزاله وسائل الاعلام وأضافه 150 μL من 4 ٪ PFA (في الخدمات التلفزيونية) لكل بئر لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
    2. أزاله PFA وأضافه 150 μL من 1 ٪ البولي إيثيلين جلايكول تيرتي-اوكتيلف# ينيل الأثير (TX-100) (في الماء) لكل بئر لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
    3. أزاله TX-100 عن طريق غسل ثلاث مرات مع تلفزيوني.
      تحذير: PFA السامة ، والتعامل مع الرعاية.
      ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. ويمكن تخزين الخلايا الثابتة في الاذاعه التلفزيونية في 4 ° c.
  4. كشف المدمجة ايدو.
    1. جعل الحل وضع العلامات (10 مل لكل 96 لوحه جيدا ، وذلك باستخدام الآبار 60 الداخلية) فقط قبل استخدامها عن طريق أضافه الكواشف من حلول الأوراق المالية في الترتيب التالي: THPTA 20 μL ، CuSO4 20 Μl ، Cy3 picolyl أزيد 5 Μl ، Na اسكوربات 100 μl إلى النظام
    2. أزاله تلفزيوني من الآبار وأضافه 150 μL من حل وضع العلامات لكل بئر. احتضان 30 دقيقه في 37 درجه مئوية. للكشف عن جميع النوى ، أضافه 4 ′ ، 6-diamidino-2-فينيلانديول (DAPI) لكل بئر. قراءه علي قارئ لوحه مضان (Cy3 550ex, 570em; DAPI 350ex، 470em) أو صوره علي المجهر.
      ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. ويمكن تخزين الخلايا الثابتة والملونة في الاذاعه التلفزيونية في 4 درجه مئوية والذين تتراوح أعمارهم في وقت لاحق.

2. الكشف عن ايدو باستخدام التلالؤ

  1. الأقسام الكاملة 1.1 – 1.3.
  2. اعداد تريس-المالحة مخزنه مع 0.1 ٪ السكاريد 20 (TBST).
  3. كتله الآبار.
    1. أضافه 150 μL من حظر المخزن المؤقت (جدول المواد) لكل بئر واحتضان لمده 90 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
    2. أزاله حظر المخزن المؤقت ويغسل ثلاث مرات مع 200 μL من تلفزيوني.
  4. كشف المدمجة ايدو.
    1. جعل الحل وضع العلامات وفقا لتوجيهات في الخطوة 1-4-1 ، واستبدال البيوتين picolyl أزيد ل Cy3 picolyl أزيد.
    2. يغسل الآبار خمس مرات مع 200 μL من TBST ، مع الاهتزاز ، 3 دقيقه لكل غسل.
    3. إرواء البيروكسياسات الذاتية مع 150 μL من 0.3% H2O2 لمده 20 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
    4. أزاله H2O2 ويغسل خمس مرات مع 200 ΜL من tbst ، مع اهتزاز 3 دقيقه لكل غسل.
    5. تمييع العقديات-الفجل البيروكسيديز (SA-الصورة ؛ 1:200) في TBST وأضافه 50 μL لكل بئر. احتضان 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة.
    6. يغسل خمس مرات مع 200 μL من TBST ، مع الاهتزاز ، 3 دقيقه لكل غسل.
    7. أضافه 50 μL من انزيم الكيميائية المرتبطة المقايسة المناعية (اليسا) الركيزة (جدول المواد) لكل بئر.
    8. قراءه فورا في لوحه القارئ قادره علي الكشف عن التلالؤ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في الشكل 2، ونحن نظهر نتائج ثلاث تجارب مختلفه قياس انتشار vsmc استجابه ل PDGF. بعد زراعه الخلايا في وسائل الاعلام وضعت ل SMCs ، نفذنا التجربة في المصل DMEM مجانا ، للقضاء علي اي اثار محتمله من المصل أو عوامل النمو علي الانتشار. في الشكل 2A نقارن النتائج ، من نفس التجرب?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

دمج التعليمية هو وسيله بسيطه ومباشره لقياس انتشار الخلايا. ومن المفيد بشكل خاص للخلايا الملتصقة13. بروتوكولنا يستخدم خلايا العضلات الملساء ، ولكنه ينطبق علي اي خليه ملتصقة (الظهاريه ، بطانية ، الخ). علي الرغم من ان البروتوكول ليس معقدا ، فان الخطوة الحاسمة الواحدة هي صنع حل وضع...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

نشكر كاتي كارول علي المساعدة الفنية. كما نشكر الدكتور ديفيد كول ومختبر تحليل البروبروتيميكس لتعليم وتوفير قارئ لوحه التصوير الخلوي. وكان هذا العمل مدعوما بمنحه من مؤسسه رايت ستيت (إلى L.E.W.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5-Ethynyl-2'-deoxyuridineCarbosynthNE08701
biotin picolyl azideClick Chemistry Tools1167-5
CuSO4Fisher ScientificC1297-100G
Cy3 picolyl azideClick Chemistry Tools1178-1
Cytation Plate ReaderBiotek
EVOS MicroscopeThermo Fisher Scientific
Hydrogen peroxide solutionSigma-Aldrich216763
Na ascorbateSigma-Aldrich11140-250G
NucBlue Fixed Cell Stain Ready ProbesInvitrogenR37606DAPI nuclear stain
Odyssey Blocking BufferLi-Cor927-40000blocking buffer
ParaformaldehydeElectron Microscopy Services15710
PBSFisher ScientificSH3002802
Sodium ChlorideSigma Life ScienceS3014-5kg
Streptavidin Horseradish Peroxidase ConjugateLife TechnologiesS911
Super Signal ELISA FemtoThermo ScientificPI137075ELISA substrate
Synergy Plate ReaderBiotek
THPTAClick Chemistry Tools1010-100
Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)Fisher ScientificBP153-500
Triton X 100Bio-Rad1610407
Tween 20Fisher ScientificBP337-100

References

  1. Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
  2. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  3. Cizek, S. M., et al. Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia. Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).
  4. Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).
  5. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).
  6. Sletten, E., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).
  7. Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).
  8. Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).
  9. Jiang, H., et al. Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).
  10. Izquierdo, E., Delgado, A. Click chemistry in sphingolipid research. Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).
  11. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  12. Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).
  13. Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells. The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).
  14. Stoddart, M. J. Mammalian cell viability: methods and protocols. , Humana Press. New York, NY. (2011).
  15. Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling. Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).
  16. Bescancy-Webler, C., et al. Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study. Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).
  17. Diermeier-Daucher, S., et al. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).
  18. Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU). Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

152

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved