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요약

증식은 세포 기능의 중요한 부분이며, 신약의 잠재적 독성을 평가하는 데 사용되는 일반적인 판독값입니다. 따라서 증식 측정은 세포 생물학에서 자주 사용되는 분석입니다. 여기에서 우리는 부착 및 비 부착 세포에서 사용될 수 있는 증식을 측정하는 간단하고 다양한 방법을 제시합니다.

초록

증식하는 세포의 능력은 대부분의 세포의 정상적인 기능에 필수적이며, 증식의 dysregulation은 많은 질병 과정의 핵심입니다. 이러한 이유로, 증식 측정은 세포 기능을 평가하는 데 사용되는 일반적인 도구입니다. 세포 증식은 계수만으로 측정할 수 있습니다. 그러나 이것은 확산을 측정하는 간접적인 수단입니다. 분할을 준비하는 세포를 직접 검출하는 한 가지 일반적인 방법은 표지된 뉴클레오시드 유사체의 통합입니다. 이들은 방사성 뉴클레오시드 아날로그 3H-티미딘 플러스 5-브로모-2' deoxyuridine (BrdU) 및 5-에티닐-2′-데옥시우리딘 (EdU)와 같은 비방사성 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. EdU의 통합은 BrdU에 비해 몇 가지 장점이 클릭 화학에 의해 감지됩니다. 이 보고서에서는 EdU의 통합에 의한 확산을 측정하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에는 각각의 장점과 단점과 함께 다양한 판독값에 대한 옵션이 포함되어 있습니다. 또한 계획된 실험의 특정 요구 사항을 충족하기 위해 프로토콜을 최적화하거나 변경할 수 있는 위치에 대해서도 설명합니다. 마지막으로, 우리는 이 기본적인 프로토콜이 그밖 세포 대사 산물을 측정하기 위해 수정될 수 있는 쪽에 접촉합니다.

서문

증식은 세포 기능1,2의중요한 부분입니다. 증식의 통제는 발달과 같은 일반적인 프로세스, 암과 심장 혈관 질병과 같은 병리학 적인 프로세스에 영향을 미칩니다. 혈관 평활근 세포의 과소 플라스틱 성장은 예를 들어, 죽상 동맥 경화증의 전구체로 생각된다3. 세포 증식의 변화는 또한 새로운 약물의 잠재적인 독성을 평가 하는 데 사용 됩니다. 그것의 광범위 한 영향을 감안할 때, 증식 측정은 많은 세포 생물학 기반 실험실의 주류.

관심있는 세포 인구가 상당히 급속하게 분할하는 경우에 세포 증식은 단순히 세포를 계수해서 측정될 수 있습니다. 느린 성장 세포의 경우 세포 수가 덜 민감할 수 있습니다. 증식은 종종 표지된 뉴클레오시드 유사체의 혼입에 의해 측정됩니다. 금 표준은 3H-티미딘 통합이지만, 많은 실험실은 새로운 비 방사성 대안의 가용성을 감안할 때이 방법에서 벗어나고 있다. 이들은 세포질 형광 염료, 세포 주기 관련 단백질의 검출, 및 5-브로모-2' deoxyuridine (BrdU) 및 5-에티닐-2′-데옥시우리딘 (EdU)와 같은 비 방사성 뉴클레오시드 유사체의 혼입을 포함한다4.

카르복시플루아세진과 같은 세포질 염료는 설치니미딜 에스테르(CFSE)를 이아세테이트하며, 세포가 분열될 때마다 염료의 강도가 반으로 줄어들기 때문에 증식을감지한다5. 이 기술은 일반적으로 비 부착 세포에 대한 유세포 분석에서 사용된다. 그것은 부착 된 세포에 많이 사용되지 않았지만 새로운 세대의 이미징 플레이트 판독기와 함께 이 변경 될 수 있습니다. 항체 기반 기술(유세포 분석, 면역조직화학 등)을 통한 세포 주기 관련 단백질의 검출은 종종 조직 또는 비부착 세포에 사용된다. 이 세포/조직은 염색하기 전에 고쳐지고 투과되어야 합니다. 뉴클레오시드 유사체 BrdU 및 EdU는 3H-티미딘에 대한 접근법에서 유사하지만 방사능의 불편함없이. BrdU의 편입은 반대로 BrdU 항체에 의해 검출되고, 그러므로 세포는 염색의 앞에 고정되고 투과되어야 합니다. 또한, 세포는 BrdU 에피토프를 노출시키기 위해 DNase로 처리되어야 한다.

EdU의 통합은 클릭 화학에 의해 감지되며, 알키네와 아지드 그룹은 촉매 구리가있는 경우 함께 "클릭"합니다. 어느 그룹은 생합성 으로 통합된 분자 또는 검출 분자4로서작용할 수 있다. 시판되는 뉴클레오시드 유사체는 알키네 그룹이 부착되어 있다. 증식 검문, 따라서, 알키네 기능화된 뉴클레오시드 유사체는 형광 염료 또는 다른 마커에 공액화된 아지드에 의해 검출된다. EdU의 통합은 BrdU에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 알키네 및 아지드 기는 포유류 세포에서 발견되지 않기 때문에, 이러한 상호작용은 낮은 배경6과매우 특이적이다. 두 그룹 모두 작기 때문에, 세포는 BrdU7에필요한 대로 뉴클레오시드 아날로그를 노출하기 위해 DNA 변성 수술을 받을 필요가 없다. 마지막으로, 클릭 화학은 매우 다재다능하며 DNA, RNA, 단백질, 지방산 및 탄수화물8,9,10,11의대사 라벨링에 사용할 수 있습니다. 관심 있는 대사 표지된 표적이 세포 표면에 있는 경우에, 살아있는 세포는12표지될수 있다. 또한, 세포는 항체로 면역형광 염색을 위해 추가로 처리될 수 있다.

다음 프로토콜은 인간 혈관 평활근 세포에서 증식을 측정하기 위해 EdU 혼입 및 클릭 화학의 사용을설명한다(도 1). 우리는 EdU의 통합을 측정 할 수있는 세 가지 방법, 각각의 대표 결과, 그리고 장점과 단점을 보여줍니다. 클릭 화학을 통한 증식 측정은 부착성, 느린 성장 세포에 특히 유용합니다. 또한, 세포의 형태는 잘 유지되고 항체 계 염색도 수행될 수 있다.

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프로토콜

1. 형광 라벨을 사용하여 EdU의 검출

  1. 재고 솔루션
    1. 이중 증류H2O의 10 mL에 12.5 mg의 EdU를 추가하여 5 mM EdU 재고 솔루션을 준비합니다.
    2. 라벨 링 솔루션 구성 요소를 준비: 200 mM 트리스 (3-하이드록시 프로필리아졸라메틸) 아민 (THPTA) (1.15 mL H2O에서 100 mg), 100 mM CuSO4 (15.95 mg 1mL H2O; 신선한만들기), 10 mM Cy3 피콜릴-아지드 (10 mM Cy3 피콜릴-아지드 3m , -20 °C에서 5 μL aliquots에 저장하고, 1 M 나트륨 아스코르브산염 (1 mL H2O에서 200 mg; 신선하게 만들다).
    3. 0.15 mg/mL의 농도로 resazurin 스톡 솔루션을 준비합니다. 필터 살균 및 4 °C에서 1 mL 알리쿼트 저장.
      참고: 피콜릴 아지드는 여러 가지 다른 형광, 비오틴 및 고추냉이 과산화공 (HRP)에 공액으로 제공됩니다.
  2. EdU로 혈관 평활근 세포(VSMC)에 라벨을 붙입니다.
    참고: 인간 VSMC는 조직의 이식 된 조각에서 자라난을 통해 장골 동맥에서 분리되었습니다. 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄을 함유한 무혈압에서 재배하면 이들 세포는 VSMC 마커스필린, 평활근 미오신 중혈(SM-MHC) 및 SMC αactin13을발현한다.
    1. 플레이트 혈관 평활근 세포는 96웰 플레이트에서 덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)에서 2 x 10 4/mL로 진행된다.
      참고: 세포는 2% 태아 소 혈청을 가진 평활근 세포 매체에 있는 37°C에서 성장합니다.
    2. (선택 사항) 준수를 위해 하룻밤까지 몇 시간 동안 두도록 두드리라. 각 우물에 20 μL resazurin 스톡을 추가합니다. 37°C에서 3시간 동안 배양. 플레이트 리더에서 형광 신호를 판독한다(560ex,594em). 미디어를 신선한 DMEM으로 바꿉습니다.
      참고: 이 단계는 선택 사항입니다. Resazurin는 세포 수를 정규화하고 도금14에있는 잘 잘 가변성을 설명하기 위하여 이용됩니다.
    3. 배양 기간의 시작 부분에서 치료당 3-6 웰에 인산완충식염수(PBS) 또는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 30 ng/mL를 추가하고 72시간 동안 배양한다.
    4. 5 mM EdU 스톡을 1 mM으로 희석하십시오. 72시간 배양 기간의 마지막 24시간 동안 각 웰(최종 농도 20 μM)에 2 μL을 첨가한다. 한 복제 세트에 EdU를 추가하지 마십시오. 이러한 우물은 배경 형광 /발광을 결정하는 데 사용됩니다.
      참고: EdU를 사용하여 배양 및 라벨링 기간은 평활근 세포에 최적화되어 있지만 세포 유형당 수정해야 할 수도 있습니다.
  3. 파라포름알데히드(PFA)에서 세포를 수정합니다.
    1. 매체를 제거하고 실온에서 10 분 동안 잘 당 4 % PFA (PBS)의 150 μL을 추가하십시오.
    2. PFA를 제거하고 실온에서 30 분 동안 잘 당 1 % 폴리에틸렌 글리콜 테르-octylphenyl 에테르 (TX-100)의 150 μL을 추가합니다.
    3. PBS로 세 번 세척하여 TX-100을 제거합니다.
      주의: PFA는 독성이 있으며 조심스럽게 취급하십시오.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 고정 셀은 4°C에서 PBS에 저장할 수 있습니다.
  4. 통합 된 EdU를 감지합니다.
    1. THPTA 20 μL, CuSO4 20 μL, Cy3 피콜릴 아지드 5 μL, Na ascorbate 100 μL에서 PBS에 100 μL의 총 부피를 추가하여 사용 직전에 라벨링 솔루션(96웰 플레이트당 10 mL, 내부 60웰을 사용함)을 확인합니다.
    2. 우물에서 PBS를 제거하고 각 우물에 150 μL의 라벨링 솔루션을 추가합니다. 37 °C에서 30 분 배양. 모든 핵을 검출하려면, 추가 4′,6-디아미디노-2-페니린돌 (DAPI) 각 우물에. 형광 플레이트 리더에 읽기 (Cy3 550전,570em; DAPI 350ex, 470em)또는 현미경상.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 고정 및 염색된 세포는 4°C에서 PBS에 저장되고 나중에 이미지화될 수 있다.

2. 발광을 이용한 EdU 검출

  1. 섹션 1.1-1.3을 완료합니다.
  2. 0.1% 폴리소르베이트 20(TBST)으로 트리스 버퍼링식염수를 준비합니다.
  3. 우물을 차단합니다.
    1. 각 우물에 150 μL의 블로킹버퍼(재료 표)를넣고 실온에서 90분 동안 배양합니다.
    2. 차단 버퍼를 제거하고 200 μL의 PBS로 세 번 씻으하십시오.
  4. 통합 된 EdU를 감지합니다.
    1. Cy3 피콜릴 아지드에 대한 비오틴 피콜릴 아지드를 1.4.1 단계에서 지시대로 라벨링 용액을 확인합니다.
    2. TBST 200 μL로 우물을 5번 씻고, 흔들어서, 세척당 3분.
    3. 실온에서 20 분 동안 0.3 % H2O2의 150 μL로 내인성 과산화를 담금질.
    4. H2O2를 제거하고 200 μL의 TBST로 5회 세척하고, 세척당 3분씩 흔들어 주세요.
    5. TBST에서 스트렙타비딘 고추냉이 과산화를 희석하고 각 우물에 50 μL을 추가합니다. 실온에서 1 h를 배양하십시오.
    6. TBST 200 μL로 5회 세척하고, 흔들어서, 1회 세척당 3분.
    7. 화학 발광 효소 연결 면역 흡착 분석 (ELISA) 기질(재료표)의50 μL을 각 우물에 추가합니다.
    8. 발광을 감지할 수 있는 플레이트 리더에서 즉시 판독하십시오.

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결과

도 2에서,PDGF에 응하여 VSMC의 증식을 측정하는 3가지 다른 실험의 결과를 입증하였다. SMC를 위해 제형화된 매체에서 세포를 성장한 후, 혈청 무첨가 DMEM에서 실험을 수행하여 혈청 또는 증식에 대한 성장 인자의 잠재적 인 영향을 제거하였다. 그림 2A에서는 형광 대 발광 판독을 사용하여 동일한 실험에서 결과를 비교합니다. 이러한 플레이트를 읽기 위?...

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토론

EdU의 통합은 세포 증식을 측정하는 간단하고 간단한 방법입니다. 특히 부착세포(13)에유용하다. 우리의 프로토콜은 평활근 세포를 사용하지만 모든 부착 세포 (상피, 내피 등)에 적용 할 수 있습니다. 프로토콜이 복잡하지는 않지만, 한 가지 중요한 단계는 라벨링 솔루션을 만드는 것입니다 - 성분은 나열된 순서대로 추가되어야 합니다. 또한, 케미발광웨스턴 블롯과 마찬가지로, ...

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공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

케이티 캐롤에게 기술 지원을 부탁드립니다. 우리는 또한 Cytation 화상 진찰 격판덮개 리더의 지시 그리고 제공을 위한 박사 데이비드 쿨 과 Proteomics 분석 실험실감사합니다. 이 작품은 라이트 주립 재단 보조금(L.E.W.)에 의해 지원되었습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
5-Ethynyl-2'-deoxyuridineCarbosynthNE08701
biotin picolyl azideClick Chemistry Tools1167-5
CuSO4Fisher ScientificC1297-100G
Cy3 picolyl azideClick Chemistry Tools1178-1
Cytation Plate ReaderBiotek
EVOS MicroscopeThermo Fisher Scientific
Hydrogen peroxide solutionSigma-Aldrich216763
Na ascorbateSigma-Aldrich11140-250G
NucBlue Fixed Cell Stain Ready ProbesInvitrogenR37606DAPI nuclear stain
Odyssey Blocking BufferLi-Cor927-40000blocking buffer
ParaformaldehydeElectron Microscopy Services15710
PBSFisher ScientificSH3002802
Sodium ChlorideSigma Life ScienceS3014-5kg
Streptavidin Horseradish Peroxidase ConjugateLife TechnologiesS911
Super Signal ELISA FemtoThermo ScientificPI137075ELISA substrate
Synergy Plate ReaderBiotek
THPTAClick Chemistry Tools1010-100
Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)Fisher ScientificBP153-500
Triton X 100Bio-Rad1610407
Tween 20Fisher ScientificBP337-100

참고문헌

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