使用点击化学测量血管平滑肌细胞增殖

摘要

增殖是细胞功能的关键部分，也是用于评估新药潜在毒性的常见读物。因此，测量增殖是细胞生物学中常用的测定方法。在这里，我们提出了一种简单、通用的测量增殖方法，可用于附着细胞和非粘附细胞。

摘要

细胞增殖能力是大多数细胞正常功能的组成部分，增殖障碍是许多疾病过程的核心。由于这些原因，测量增殖是评估细胞功能的常用工具。细胞增殖只需计数即可测量;然而，这是衡量扩散的间接手段。直接检测准备分裂的细胞的一种常见方法就是加入标记的核苷模拟物。其中包括放射性核苷^模拟3H-硫酰胺加非放射性核苷模拟物，如5-溴-2'脱氧尿碱（BrdU）和5-乙酰-2+-脱氧尿碱（EdU）。EdU 的加入通过点击化学检测，与 BrdU 相比，它具有几个优点。在本报告中，我们提供了一个协议，用于通过纳入EdU来测量扩散。该协议包括各种读出选项，以及每种读出的优缺点。我们还讨论了可以优化或更改协议以满足计划实验的特定需求的地方。最后，我们来谈谈如何修改这个基本协议来测量其他细胞代谢物。

引言

增殖是细胞^功能1，2的关键部分。控制扩散会影响正常过程，如发育和病理过程，如癌症和心血管疾病。例如，血管平滑肌细胞的超塑性生长被认为是动脉粥样^硬化3的前兆。细胞增殖的变化也被用来评估新药的潜在毒性。鉴于其广泛影响，测量增殖是许多基于细胞生物学的实验室的支柱。

如果感兴趣的细胞群分裂得相当快，只需计算细胞，即可测量细胞增殖。对于生长较慢的细胞，细胞计数可能不太敏感。扩散通常通过加入标记的核苷模拟物来衡量。虽然金本标准^是3个H-硫酰胺结合，许多实验室正在摆脱这种方法，因为有更新的，非放射性替代品。其中包括细胞质荧光染料，检测细胞周期相关蛋白质，并纳入非放射性核苷类物，如5-bromo-2'脱氧尿碱（BrdU）和5-乙酰-2+-脱氧尿碱（EdU）4。

细胞质染料，如卡博氟西林二乙酸二乙酰乙酯（CFSE），检测增殖，因为染料的强度减半，每次细胞^分裂5。此技术通常用于非粘附细胞的流式细胞测定。它并没有被大量用于粘附细胞，但随着新一代成像板读取器，这种情况可能会改变。通过基于抗体的技术（流细胞测定、免疫组织化学等）检测细胞周期相关蛋白，通常用于组织或非粘附细胞。这些细胞/组织在染色前必须固定和渗透。核苷模拟BrdU和EdU在^接近3个H-硫酰胺的方法上相似，但没有放射性的不便。BrdU的加入通过抗BrdU抗体检测，因此细胞在染色前必须固定和渗透。此外，细胞必须用DNase处理，以暴露BrdU表位。

EdU的加入通过点击化学检测，其中烷基和阿齐德组在催化铜的存在下"点击"在一起。任一组都可以作为生物合成结合的分子或检测^分子4。商业上可用的核苷类物附加了烷基组。因此，对于增殖测定，烷基可功能化核苷模拟被与荧光染料或其他标记物结合的阿齐德检测。与 BrdU 公司多，EdU 的合并有几个优势。首先，由于烷基和阿齐德组在哺乳动物细胞中找不到，这种相互作用在低^背景6下是高度特异性的。由于两组都很小，细胞不需要进行DNA变性，以暴露核苷模拟，如BrdU⁷要求。最后，点击化学是高度通用的，可用于DNA，RNA，蛋白质，脂肪酸和碳水化合物8，9，10，11的代谢标记。如果代谢标记感兴趣的目标在细胞表面，活细胞可以^{标记为12。}此外，细胞可以进一步处理免疫荧光染色与抗体。

以下协议描述了使用EdU合并和点击化学测量人类血管平滑肌细胞的增殖（图1）。我们展示了三种不同的方法，可以衡量EdU的合并，每个方法具有代表性的结果，以及它们的优缺点。通过点击化学测量增殖对于粘附性、生长较慢的细胞特别有用。此外，细胞的形态得到了很好的维护，并且也可以进行基于抗体的染色。

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研究方案

1. 使用荧光标签检测 EDU

1. 库存解决方案
   1. 通过将 12.5 mg EdU 添加到 10 mL 的双蒸馏 H₂O 中，准备 5 mM EdU 库存溶液。
   2. 准备标签溶液组分:200 mM tris（3-羟基苯甲酸酯）胺（THPTA）（100毫克，1.15 mL H₂O），100 mM CuSO 4（15.95毫克，1 mL H₂O;制作新鲜），10mM Cy3 picolyl-azide（1毫克，在95.3 mL H₂O中），储存在-20°C下5μL等分，和1M抗坏血酸钠（200毫克在1mL H₂O;使新鲜）。
   3. 以0.15mg/mL的浓度制备resazurin库存溶液。过滤灭菌，并在4°C下储存1 mL等分。
      注: Picolyl azide 可与几种不同的荧光、生物锡和马萝卜过氧化物酶 （HRP） 结合使用。
2. 使用 EdU 标记血管平滑肌细胞 （VSMC）。
   注:人类VSMC通过从外植的块组织中生长，从iliac动脉中分离出来。当生长在无血清介质与胰岛素，转移素，硒这些细胞表达VSMC标记平滑素，平滑肌黄素重链（SM-MHC）和SMCβactin13。
   1. 在Dulbeco的改性鹰介质（DMEM）中的2 x 10⁴/mL的板血管平滑肌细胞（DMEM）。
      注:细胞在平滑肌细胞培养基中生长37°C，胎儿牛血清为2%。
   2. （可选）等待几个小时过夜，以便坚持。在每个井中加入 20 μL 雷沙祖林库存。在37°C孵育3小时。在板读器（560 ex，594_em）中读取荧光信号。用新的 DMEM 替换介质。
      注: 此步骤是可选的。Resazurin用于使细胞数量正常化，并解释电^镀14中的可良好变异性。
   3. 在培养期开始时，每次处理加入磷酸盐缓冲盐水（PBS）或血小板衍生生长因子（PDGF）30纳克/mL至3⁄6孔，孵育72小时。
   4. 稀释 5 mM EdU 库存至 1 mM。在 72 h 培养期的最后 24 小时，向每口井添加 2 μL（最终浓度为 20 μM）。不要将 EdU 添加到一组复制。这些井将用于确定背景荧光/发光。
      注: 培养和标记与 EdU 的持续时间针对平滑肌细胞进行了优化，但可能需要根据每个细胞类型进行修改。
3. 将细胞固定在甲醛（PFA）中。
   1. 取出介质，在室温下每口井内加入 150 μL 4% PFA（PBS 中）。
   2. 去除PFA，并在室温下每井加入150 μL的1%聚乙烯乙二醇三酯-八苯醚（TX-100）（水中）。
   3. 使用 PBS 清洗三次，取出 TX-100。
      注意:PFA是有毒的，小心处理。
      注: 可以在此处暂停该协议。固定细胞可储存在4°C的PBS中。
4. 检测合并 EdU。
   1. 在使用前，通过按以下顺序从库存溶液中添加试剂，使贴标溶液（每 96 孔板 10 mL，使用内部 60 孔）:THPTA 20 μL，CuSO₄ 20 μL，Cy3 picolyl azide 5 μL，Na 抗坏剂 100 μL 到 PBS，总体积为 10 mL。
   2. 从井中取出PBS，并在每口井中加入150μL的标签溶液。在37°C下孵育30分钟。要检测所有核，在每个孔中加入4°，6-二酰胺-2-苯林多尔（DAPI）。在荧光板读取器上阅读（Cy3 550_ex，570_em;DAPI 350_ex， 470_em） 或显微镜上的图像。
      注: 可以在此处暂停该协议。固定和染色细胞可储存在4°C的PBS中，并在以后进行成像。

2. 使用发光检测 EdU

1. 完成第 1.1~1.3 节。
2. 用0.1%多索巴20（TBST）制备三缓冲盐水。
3. 堵住井。
   1. 在每个井中加入150 μL的阻塞缓冲液（材料表），并在室温下孵育90分钟。
   2. 去除阻塞缓冲液，用200 μL的PBS洗涤三次。
4. 检测合并 EdU。
   1. 使标签溶液按照步骤 1.4.1 中的指示，用生物锡片片代替 Cy3 picolyl azide。
   2. 用200 μL的TBST洗井5次，摇动，每次洗涤3分钟。
   3. 在室温下，用150μL的0.3%H₂O₂₂淬火内源性过氧化物酶20分钟。
   4. 去除 H₂O_2，用 200 μL 的 TBST 洗涤 5 次，每次洗涤时摇动 3 分钟。
   5. 在TBST中稀释链球蛋白-马萝卜过氧化物酶（SA-HRP;1:200），并在每口井中加入50μL。在室温下孵育1小时。
   6. 用200 μL的TBST洗涤5次，摇动，每次洗涤3分钟。
   7. 在每个井中加入50μL的化学发光酶链接免疫吸附测定（ELISA）基板（材料表）。
   8. 立即在能够检测发光的板式读取器中读取。

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结果

在图2中，我们演示了三个不同实验的结果，它们测量VSMC在PDGF下的激增。在培养为SMC配制的培养细胞后，我们进行了无血清DMEM实验，以消除血清或生长因子对增殖的任何潜在影响。在图2A中，我们使用荧光与发光读出比较了同一实验的结果。为了读取这些板，我们使用多模微板读取器，可以读取吸光度、荧光和发光（参见材料表）。

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讨论

纳入EdU是测量细胞增殖的一种简单、直接的方法;它特别适用于附着^细胞13。我们的协议使用平滑肌肉细胞，但它适用于任何粘附细胞（上皮，内皮等）。尽管协议并不复杂，但关键的一步是制作标签解决方案 - 成分必须按列出的顺序添加。此外，像化学发光的西方印迹，如果使用发光读出板必须立即读取。

可以根据需要修改或优化协议的几个部分。其中一?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine	Carbosynth	NE08701
biotin picolyl azide	Click Chemistry Tools	1167-5
CuSO4	Fisher Scientific	C1297-100G
Cy3 picolyl azide	Click Chemistry Tools	1178-1
Cytation Plate Reader	Biotek
EVOS Microscope	Thermo Fisher Scientific
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763
Na ascorbate	Sigma-Aldrich	11140-250G
NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes	Invitrogen	R37606	DAPI nuclear stain
Odyssey Blocking Buffer	Li-Cor	927-40000	blocking buffer
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Services	15710
PBS	Fisher Scientific	SH3002802
Sodium Chloride	Sigma Life Science	S3014-5kg
Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate	Life Technologies	S911
Super Signal ELISA Femto	Thermo Scientific	PI137075	ELISA substrate
Synergy Plate Reader	Biotek
THPTA	Click Chemistry Tools	1010-100
Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)	Fisher Scientific	BP153-500
Triton X 100	Bio-Rad	1610407
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100