Medição da proliferação de células musculares vasculares lisas usando química clique

Resumo

A proliferação é uma parte crítica da função celular, e uma leitura comum usada para avaliar a toxicidade potencial de novos medicamentos. A medição da proliferação é, portanto, um ensaio freqüentemente usado na biologia celular. Aqui apresentamos um método simples e versátil de medição da proliferação que pode ser usado em células aderentes e não aderentes.

Resumo

A capacidade de uma célula para proliferar é parte integrante da função normal da maioria das células, e a desregulação da proliferação está no coração de muitos processos de doença. Por estas razões, medir a proliferação é uma ferramenta comum usada para avaliar a função celular. A proliferação celular pode ser medida simplesmente pela contagem; no entanto, este é um meio indireto de medir a proliferação. Um meio comum de detectar diretamente as células se preparando para dividir é a incorporação de análogos nucleosídeos rotulados. Estes incluem o análogo radioradioativo do nucleosídeo ³H-thymidine mais análogos não radioativos do nucleosside tais como o deoxyuridine de 5 bromo-2' (BrdU) e 5-etilnyl-2′-deoxyuridine (EdU). A incorporação da EdU é detectada pela química do clique, que tem várias vantagens quando comparada à BrdU. Neste relatório, fornecemos um protocolo para medir a proliferação pela incorporação da EdU. Este protocolo inclui opções para várias leituras, juntamente com as vantagens e desvantagens de cada um. Também discutimos locais onde o protocolo pode ser otimizado ou alterado para atender às necessidades específicas do experimento planejado. Finalmente, tocamos nas maneiras que este protocolo básico pode ser modificado para medir outros metabólitos celulares.

Introdução

A proliferação é uma parte crítica da função celular^1,2. O controle da proliferação influencia processos normais, como desenvolvimento e processos patológicos, como câncer e doenças cardiovasculares. Acredita-se que o crescimento hiperplástico das células musculares lisas vasculares, por exemplo, seja um precursor da aterosclerose^3. Mudanças na proliferação celular também são usadas para avaliar a toxicidade potencial de novos medicamentos. Dado o seu impacto generalizado, medir a proliferação é um pilar de muitos laboratórios baseados em biologia celular.

A proliferação celular pode ser medida simplesmente pela contagem de células se a população celular de interesse se dividir rapidamente. Para células de crescimento mais lento, a contagem de células pode ser menos sensível. A proliferação é muitas vezes medida pela incorporação de análogos nucleosídeos rotulados. Embora o padrão ouro seja a incorporação ³H-thymidine, muitos laboratórios estão fugindo desse método, dada a disponibilidade de alternativas mais novas e não radioativas. Estes incluem corantes fluorescentes citoplasmais, detecção de proteínas associadas ao ciclo celular e incorporação de análogos de nucleosídeos não radioativos, como deoxiuridina (BrdU) 5-bromo-2' e 5-etilnyl-2′-deoxyuridine (EdU)⁴.

Corantes citoplasmais, como carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE), detectam proliferação porque a intensidade do corantes metades cada vez que a célula divide⁵. Esta técnica é comumente usada em citometria de fluxo para células não aderentes. Não foi usado muito para pilhas aderentes, mas com a geração nova de leitores da placa da imagem latente isto pode mudar. A detecção de proteínas associadas ao ciclo celular através de técnicas baseadas em anticorpos (citometria de fluxo, imunohistoquímica, etc.) é frequentemente usada para tecidos ou células não aderentes. Estas células/tecidos devem ser fixadas e permeabilizadas antes da coloração. Os análogos de nucleosídeo BrdU e EdU são semelhantes na aproximação a ³H-thymidine, mas sem a inconveniência da radioatividade. A incorporação da BrdU é detectada por anticorpos anti-BrdU e, portanto, as células devem ser fixas e permeabilizadas antes da coloração. Além disso, as células devem ser tratadas com DNAse para expor o epítopo brdu.

A incorporação da EdU é detectada pela química do clique, na qual os grupos de alquino e azida "clicam" juntos na presença de cobre catalítico. Um ou outro grupo pode serir como a molécula biossintética incorporada ou a molécula⁴da deteção. Análogos nucleosídeos comercialmente disponíveis têm o grupo de alquin. Para ensaios de proliferação, portanto, o análogo nucleosídeo funcionalizado de alquino é detectado por um azide conjugado a um corante fluorescente ou outro marcador. A incorporação da EdU tem várias vantagens sobre a BrdU. Primeiro, como os grupos de alquino e azida não são encontrados em células de mamíferos, essa interação é altamente específica, com um fundo baixo^6. Como ambos os grupos são pequenos, as células não precisam se submeter à desnaturação de DNA para expor o análogo nucleosídeo, conforme necessário para o BrdU^7. Finalmente, a química do clique é altamente versátil, e pode ser usada para a rotulagem metabólica de DNA, RNA, proteínas, ácidos graxos e carboidratos^8,9,10,11. Se o alvo metabolicamente rotulado de interesse está na superfície celular, as células vivas podem ser rotulados¹². Além disso, as células podem ser processadas para coloração imunofluorescente com anticorpos.

O seguinte protocolo descreve o uso da incorporação da UEd e clique na química para medir a proliferação de células musculares suaves vasculares humanas(Figura 1). Mostramos três maneiras diferentes de incorporação de EdU pode ser medido, resultados representativos de cada um, e suas vantagens e desvantagens. Medir a proliferação através da química do clique é particular útil para células de crescimento mais lentas e aderentes. Além disso, a morfologia da célula é bem conservada e a coloração baseada em anticorpos também pode ser realizada.

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Protocolo

1. Detecção de EdU usando rótulo fluorescente

1. Soluções de ações
   1. Prepare uma solução de ações edu de 5 mM adicionando 12,5 mg de EdU a 10 mL de H₂O destilado duplo.
   2. Prepare os componentes da solução de rotulagem: 200 mM tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) (100 mg em 1,15 mL H₂O), 100 mM CuSO₄ (15,95 mg em 1 mL H₂O; fazer fresco), 10 mM Cy3 picolyl-azide (1 mg em 95,3 m HL 2 Ol₂Ozi2 , armazenados em 5 μL alíquotas a -20 °C) e 1 M de ascorbate de sódio (200 mg em 1 mL H₂O; faça fresco).
   3. Prepare a solução de ações resazurina a uma concentração de 0,15 mg/mL. Filtrar esterilizar e armazenar 1 mL adiantos a 4 °C.
      NOTA: Picolyl azide está disponível conjugado a vários fluores diferentes, biotina e peroxidase rábano (HRP).
2. Rotular células musculares lisas vasculares (VSMC) com EdU.
   NOTA: Vsmcs humanos foram isolados das artérias ilíacas através de conseqüência de pedaços explantados de tecido. Quando cultivadas em mídia livre de soro com insulina, transferrina, selênio, essas células expressam marcadores VSMC smoothelin, cadeia pesada de miosina muscular lisa (SM-MHC) e SMC αactin¹³.
   1. Células musculares lisas vasculares da placa em 2 x 10⁴/mL no meio modificado da águia de Dulbecco (DMEM) em uma placa de 96 poços.
      NOTA: As células são cultivadas a 37 °C em mídia de células musculares lisas com 2% de soro bovino fetal.
   2. (Opcional) Deixe várias horas para durante a noite para aadesão. Adicione 20 μL resazurin estoque para cada poço. Incubar a 37 °C para 3 h. Leia o sinal de fluorescência em um leitor de placa (560_ex,594_em). Substitua a mídia por um Novo DMEM.
      NOTA: Esta etapa é opcional. A resazurina é usada para normalizar o número de celulares e explicar a variabilidade bem-a-bem em revestimento¹⁴.
   3. Adicione soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) ou fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) 30 ng/mL a 3 a 6 poços por tratamento no início do período cultural e incubar por 72 h.
   4. Diluir 5 mM EdU estoque para 1 mM. Adicione 2 μL a cada poço (concentração final 20 μM) para as últimas 24 h do período de cultura de 72 h. Não adicione edu a um conjunto de réplicas. Estes poços serão usados para determinar a fluorescência/luminescência do fundo.
      NOTA: A duração da cultura e rotulagem com EdU é otimizada para células musculares lisas, mas pode precisar ser modificada por tipo de célula.
3. Fixar células em paraformaldeído (PFA).
   1. Remover a mídia e adicionar 150 μL de 4% PFA (em PBS) por poço por 10 min à temperatura ambiente.
   2. Remover PFA e adicionar 150 μL de 1% de polietileno glicol tert-octilfenyl éter (TX-100) (em água) por poço por 30 min à temperatura ambiente.
   3. Retire o TX-100 lavando três vezes com a PBS.
      CUIDADO: PFA é tóxico, lidar com cuidado.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. As células fixas podem ser armazenadas na PBS a 4 °C.
4. Detectar EdU incorporado.
   1. Faça a solução de rotulagem (10 mL por placa de 96 poços, usando 60 poços internos) pouco antes de usar, adicionando reagentes de soluções de ações na seguinte ordem: THPTA 20 μL, CuSO₄ 20 μL, Cy3 picolyl azide 5 μL, Na ascorbate 100 μL à PBS para um volume total de 10 mL.
   2. Retire pbs de poços e adicionar 150 μL de solução de rotulagem para cada poço. Incubar 30 min a 37 °C. Para detectar todos os núcleos, adicione 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) a cada poço. Leia sobre um leitor de placa de fluorescência (Cy3 550_ex,570_em; DAPI 350_ex,470_em)ou imagem em um microscópio.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Células fixas e manchadas podem ser armazenadas em PBS a 4 °C e imagems posteriores.

2. Detecção de EdU usando luminescência

1. Completa seções 1.1-1.3.
2. Prepare sorline tris-buffered com polisorrbato de 0,1% 20 (TBST).
3. Bloqueie poços.
   1. Adicione 150 μL de tampão de bloqueio(Tabela de Materiais)a cada poço e incubar por 90 min à temperatura ambiente.
   2. Remover o tampão de bloqueio e lavar três vezes com 200 μL de PBS.
4. Detectar EdU incorporado.
   1. Faça a solução de rotulagem como direcionada na etapa 1.4.1, substituindo biotina picolyl azide por Cy3 picolyl azide.
   2. Lave poços cinco vezes com 200 μL de TBST, com agitação, 3 min por lavagem.
   3. Saciar peroxidases endógenas com 150 μL de 0,3% H₂O₂ para 20 min à temperatura ambiente.
   4. Retire h₂o₂ e lave cinco vezes com 200 μL de TBST, com agitação 3 min por lavagem.
   5. Diluir a peroxidase de streptavidin-rábano (SA-HRP; 1:200) no TBST e adicionar 50 μL a cada poço. Incubar 1 h à temperatura ambiente.
   6. Lave cinco vezes com 200 μL de TBST, com agitação, 3 min por lavagem.
   7. Adicione 50 μL de substo imunosorbent (ELISA) ligado a enzimas quimiculares (Tabela de Materiais)a cada poço.
   8. Leia imediatamente no leitor de placas capaz de detectar luminescência.

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Resultados

Na Figura 2,demonstramos os resultados de três experimentos diferentes que medem a proliferação do VSMC em resposta ao PDGF. Depois de cultivar as células em meios de comunicação formulados para SMCs, realizamos o experimento em DMEM livre de soro, para eliminar quaisquer efeitos potenciais do soro ou fatores de crescimento na proliferação. Na Figura 2A comparamos os resultados, do mesmo experimento, usando uma leitura fluorescente vs luminescente. Para ...

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Discussão

A incorporação da UEd é uma forma simples e direta de medir a proliferação celular; é particularmente útil para as células aderentes¹³. Nosso protocolo usa células musculares lisas, mas é aplicável a qualquer célula aderente (epiteliais, endoteliais, etc.). Embora o protocolo não seja complicado, o único passo crítico é fazer a solução de rotulagem - os ingredientes devem ser adicionados na ordem listada. Além disso, como as manchas ocidentais quimiiluminescentes, se usar a leit...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine	Carbosynth	NE08701
biotin picolyl azide	Click Chemistry Tools	1167-5
CuSO4	Fisher Scientific	C1297-100G
Cy3 picolyl azide	Click Chemistry Tools	1178-1
Cytation Plate Reader	Biotek
EVOS Microscope	Thermo Fisher Scientific
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763
Na ascorbate	Sigma-Aldrich	11140-250G
NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes	Invitrogen	R37606	DAPI nuclear stain
Odyssey Blocking Buffer	Li-Cor	927-40000	blocking buffer
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Services	15710
PBS	Fisher Scientific	SH3002802
Sodium Chloride	Sigma Life Science	S3014-5kg
Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate	Life Technologies	S911
Super Signal ELISA Femto	Thermo Scientific	PI137075	ELISA substrate
Synergy Plate Reader	Biotek
THPTA	Click Chemistry Tools	1010-100
Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)	Fisher Scientific	BP153-500
Triton X 100	Bio-Rad	1610407
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100