Mesurer la prolifération des cellules musculaires vasculaires lisses à l'aide de la chimie de clic

Résumé

La prolifération est une partie essentielle de la fonction cellulaire, et une lecture commune utilisée pour évaluer la toxicité potentielle de nouveaux médicaments. La mesure de la prolifération est donc un résultat fréquemment utilisé en biologie cellulaire. Nous présentons ici une méthode simple et polyvalente de mesure de la prolifération qui peut être utilisée dans les cellules adhérentes et non adhérentes.

Résumé

La capacité d'une cellule à proliférer fait partie intégrante de la fonction normale de la plupart des cellules, et la dysrégulation de la prolifération est au cœur de nombreux processus de la maladie. Pour ces raisons, la mesure de la prolifération est un outil courant utilisé pour évaluer la fonction cellulaire. La prolifération cellulaire peut être mesurée simplement par comptage; cependant, il s'agit d'un moyen indirect de mesurer la prolifération. Un moyen courant de détecter directement les cellules se préparant à se diviser est par l'incorporation d'analogues nucléosides étiquetés. Il s'agit notamment de la nucléoside radioactive analogique ³H-thymidine plus non-radioactifs analogues nucléoside tels que 5-bromo-2' deoxyuridine (BrdU) et 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU). L'incorporation d'EdU est détectée par la chimie de clic, qui a plusieurs avantages par rapport à BrdU. Dans ce rapport, nous fournissons un protocole pour mesurer la prolifération par l'incorporation de l'UE. Ce protocole comprend des options pour diverses lectures, ainsi que les avantages et les inconvénients de chacun. Nous discutons également des endroits où le protocole peut être optimisé ou modifié pour répondre aux besoins spécifiques de l'expérience planifiée. Enfin, nous touchons à la façon dont ce protocole de base peut être modifié pour mesurer d'autres métabolites cellulaires.

Introduction

La prolifération est une partie essentielle de la fonction cellulaire^1,2. Le contrôle de la prolifération influence les processus normaux tels que le développement, et les processus pathologiques tels que le cancer et les maladies cardiovasculaires. La croissance hyperplastique des cellules musculaires lisses vasculaires, par exemple, est pensé pour être un précurseur de l'athérosclérose³. Les changements dans la prolifération cellulaire sont également utilisés pour évaluer la toxicité potentielle de nouveaux médicaments. Compte tenu de son impact généralisé, la mesure de la prolifération est un pilier de nombreux laboratoires de biologie cellulaire.

La prolifération cellulaire peut être mesurée en comptant simplement les cellules si la population cellulaire d'intérêt se divise assez rapidement. Pour les cellules à croissance plus lente, le nombre de cellules peut être moins sensible. La prolifération est souvent mesurée par l'incorporation d'analogues nucléodés étiquetés. Bien que l'étalon-or soit l'incorporation de ³H-thymidine, de nombreux laboratoires s'éloignent de cette méthode étant donné la disponibilité de nouvelles alternatives non radioactives. Il s'agit notamment de colorants fluorescents cytoplasmiques, la détection des protéines associées au cycle cellulaire, et l'incorporation d'analogues nucléosides non radioactifs tels que la désoxyuridine 5-bromo-2' (BrdU) et 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU)⁴.

Les colorants cytoplasmiques, tels que la carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE), détectent la prolifération parce que l'intensité du colorant diminue à chaque fois que la cellule divise⁵. Cette technique est couramment utilisée dans la cytométrie de flux pour les cellules non adhérentes. Il n'a pas été utilisé beaucoup pour les cellules adhérentes, mais avec la nouvelle génération de lecteurs de plaques d'imagerie cela peut changer. La détection des protéines associées au cycle cellulaire par des techniques à base d'anticorps (cytométrie de flux, immunohistochimie, etc.) est souvent utilisée pour les tissus ou les cellules non adhérentes. Ces cellules/tissus doivent être fixés et perméabilisés avant la coloration. Les analogues nucléoside brdU et EdU sont similaires en approche à ³H-thymidine, mais sans les inconvénients de la radioactivité. L'incorporation de BrdU est détectée par des anticorps anti-BrdU, et donc les cellules doivent être fixées et perméabilisées avant la coloration. En outre, les cellules doivent être traitées avec DNase pour exposer l'épitope BrdU.

L'incorporation d'EdU est détectée par la chimie de clic, dans laquelle les groupes d'alkyne et d'azide « cliquent » ensemble en présence du cuivre catalytique. L'un ou l'autre groupe peut servir de molécule biosynthétiquement incorporée ou molécule de détection⁴. Les analogues nucléosidedisponibles disponibles dans le commerce ont le groupe d'alkyne attaché. Pour les essais de prolifération, par conséquent, l'analogue nucléoside fonctionnalisé d'alkyne est détecté par un azide conjugué à un colorant fluorescent ou à un autre marqueur. L'incorporation d'EdU présente plusieurs avantages par rapport à BrdU. Tout d'abord, parce que les groupes d'alkyne et d'azide ne se trouvent pas dans les cellules de mammifères, cette interaction est très spécifique avec un fond bas⁶. Parce que les deux groupes sont petits, les cellules n'ont pas besoin de subir la dénaturation de l'ADN pour exposer l'analogique nucléoside comme requis pour BrdU⁷. Enfin, la chimie de clic est très polyvalente, et peut être employée pour l'étiquetage métabolique de l'ADN, de l'ARN, des protéines, des acides gras, et des hydrates de carbone^8,9,10,11. Si la cible d'intérêt étiquetée métaboliquement se trouve à la surface des cellules, les cellules vivantes peuvent être étiquetées¹². En outre, les cellules peuvent être traitées plus en détail pour la coloration immunofluorescente avec des anticorps.

Le protocole suivant décrit l'utilisation de l'incorporation D'EdU et de la chimie des clics pour mesurer la prolifération dans les cellules musculaires lisses vasculaires humaines (Figure 1). Nous montrons trois façons différentes d'incorporation d'EdU peut être mesurée, les résultats représentatifs de chacun, et leurs avantages et inconvénients. La mesure de la prolifération par l'intermédiaire de la chimie de clic est particulièrement utile pour les cellules adhérentes et de plus en plus lentes. En outre, la morphologie de la cellule est bien entretenue et la coloration à base d'anticorps peut également être effectuée.

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Protocole

1. Détection de l'EdU à l'aide d'une étiquette fluorescente

1. Solutions boursières
   1. Préparer une solution de 5 mM EdU en ajoutant 12,5 mg d'EdU à 10 ml de H₂O double distillé.
   2. Préparer les composants de la solution d'étiquetage : 200 mM tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) (100 mg en 1,15 mL H₂O), 100 mM CuSO₄ (15,95 mg en 1 mL H₂O; faire frais), 10 mM Cy3 picolyl-azide (1 mg en 95,3 m L₂L , stocké dans 5 aliquots ll à -20 oC) et 1 M d'ascorbate de sodium (200 mg dans 1 ml H₂O; faire frais).
   3. Préparer la solution de stock de résine à une concentration de 0,15 mg/mL. Filtrer la stérilisation et entreposer 1 ml d'aliquots à 4 oC.
      REMARQUE : L'azide de Picolyl est disponible conjugué à plusieurs flueurs différents, biotine, et peroxidase de raifort (HRP).
2. Étiqueter les cellules musculaires vasculaires lisses (VSMC) avec EdU.
   REMARQUE : Les VSMC humains ont été isolés des artères iliaques par la croissance des morceaux explantés de tissu. Lorsqu'elles sont cultivées dans des médias sans sérum avec de l'insuline, de la transferrine, du sélénium, ces cellules expriment des marqueurs VSMC smooth, une chaîne musculaire lisse de myosine (SM-MHC) et sMC^{'actin 13}.
   1. Plaquedes musculaires vasculaires lisses à 2 x 10⁴/mL dans le milieu modifié de l'aigle de Dulbecco (DMEM) dans une plaque de puits de 96.
      REMARQUE : Les cellules sont cultivées à 37 oC dans des cellules musculaires lisses avec 2 % de sérum bovin fœtal.
   2. (Facultatif) Prévoyez plusieurs heures pour la nuit pour l'adhérence. Ajouter 20 l de resazurin à chaque puits. Incuber à 37 oC pendant 3 h. Lire le signal de fluorescence dans un lecteur de plaque (560_ex, 594_em). Remplacez les médias par du DMEM frais.
      REMARQUE : Cette étape est facultative. La résazurine est utilisée pour normaliser le nombre de cellules et expliquer la variabilité du bien-à-puits dans le placage¹⁴.
   3. Ajouter le phosphate tamponné salin (PBS) ou le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) 30 ng/mL à 3-6 puits par traitement au début de la période de culture et incuber pendant 72 h.
   4. Diluer 5 mM EdU stock à 1 mm. Ajouter 2 ll à chaque puits (concentration finale de 20 m) pour les 24 dernières heures de la période de culture de 72 h. N'ajoutez pas D'EdU à un ensemble de répliques. Ces puits seront utilisés pour déterminer la fluorescence/luminescence de fond.
      REMARQUE : La durée de la culture et de l'étiquetage avec EdU est optimisée pour les cellules musculaires lisses, mais peut-être besoin d'être modifiée par type de cellule.
3. Fixer les cellules dans le paraformaldéhyde (PFA).
   1. Retirer les supports et ajouter 150 'L de 4% DE PFA (en PBS) par puits pendant 10 min à température ambiante.
   2. Retirez l'éther pfA et ajoutez 150 l de 1 % de polyéthylène glycol tert-octylyl (TX-100) (dans l'eau) par puits pendant 30 min à température ambiante.
   3. Retirez le TX-100 en lavant trois fois avec du PBS.
      CAUTION: PFA est toxique, manipuler avec soin.
      REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Les cellules fixes peuvent être stockées dans du PBS à 4 oC.
4. Détecter EdU incorporé.
   1. Faire la solution d'étiquetage (10 ml par plaque de puits 96, à l'aide de 60 puits intérieurs) juste avant l'utilisation en ajoutant des réactifs à partir de solutions de stock dans l'ordre suivant : THPTA 20 L, CuSO₄ 20 'L, Cy3 picolyl azide 5 'L, Na ascorbate 100 'L à PBS pour un volume total de 10 mL.
   2. Retirez le PBS des puits et ajoutez 150 l de solution d'étiquetage à chaque puits. Incuber 30 min à 37 oC. Pour détecter tous les noyaux, ajoutez 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à chaque puits. Lire sur un lecteur de plaque de fluorescence (Cy3 550_ex, 570_em; DAPI 350_ex, 470_em) ou image sur un microscope.
      REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Les cellules fixes et tachées peuvent être stockées dans du PBS à 4 oC et représentées ultérieurement.

2. Détection de l'EdU à l'aide de la luminescence

1. Sections complètes 1.1-1.3.
2. Préparer la saline tamponnée Tris avec 0,1 % de polysorbate 20 (TBST).
3. Bloquer les puits.
   1. Ajouter 150 l de tampon de blocage (Table de Matériaux) à chaque puits et couver pendant 90 min à température ambiante.
   2. Supprimer le tampon de blocage et laver trois fois avec 200 L de PBS.
4. Détecter EdU incorporé.
   1. Faire la solution d'étiquetage comme indiqué dans l'étape 1.4.1, en remplaçant la biotine picolyl azide pour Cy3 picolyl azide.
   2. Laver les puits cinq fois avec 200 L de TBST, en secouant, 3 min par lavage.
   3. Peroxidases endogènes avec 150 OL de 0,3 % H₂O₂ pendant 20 min à température ambiante.
   4. Retirer H₂O₂ et laver cinq fois avec 200 L de TBST, en secouant 3 min par lavage.
   5. Diluer la peroxidase streptavidin-raifort (SA-HRP; 1:200) en TBST et ajouter 50 L à chaque puits. Incuber 1 h à température ambiante.
   6. Laver cinq fois avec 200 L de TBST, en secouant, 3 min par lavage.
   7. Ajouter 50 lde de substrat immunosorbent lié à l'enzyme chemiluminescent (ELISA) substrat (Tableau des matériaux) à chaque puits.
   8. Lire immédiatement dans le lecteur de plaque capable de détecter la luminescence.

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Résultats

Dans la figure 2, nous démontrons les résultats de trois expériences différentes mesurant la prolifération de VSMC en réponse au PDGF. Après avoir augmenté les cellules dans les médias formulés pour les SMC, nous avons effectué l'expérience dans le Srum dMEM libre, pour éliminer tous les effets potentiels du sérum ou des facteurs de croissance sur la prolifération. Dans la figure 2A, nous comparons les résultats, de la même expérience, à l'aid...

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Discussion

L'incorporation d'EdU est un moyen simple et simple de mesurer la prolifération cellulaire; il est particulièrement utile pour les cellules adhérentes¹³. Notre protocole utilise des cellules musculaires lisses, mais il s'applique à toute cellule adhérente (épithéliale, endothéliale, etc.). Bien que le protocole ne soit pas compliqué, la seule étape critique consiste à faire la solution d'étiquetage — les ingrédients doivent être ajoutés dans l'ordre indiqué. En outre, comme les t...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine	Carbosynth	NE08701
biotin picolyl azide	Click Chemistry Tools	1167-5
CuSO4	Fisher Scientific	C1297-100G
Cy3 picolyl azide	Click Chemistry Tools	1178-1
Cytation Plate Reader	Biotek
EVOS Microscope	Thermo Fisher Scientific
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763
Na ascorbate	Sigma-Aldrich	11140-250G
NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes	Invitrogen	R37606	DAPI nuclear stain
Odyssey Blocking Buffer	Li-Cor	927-40000	blocking buffer
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Services	15710
PBS	Fisher Scientific	SH3002802
Sodium Chloride	Sigma Life Science	S3014-5kg
Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate	Life Technologies	S911
Super Signal ELISA Femto	Thermo Scientific	PI137075	ELISA substrate
Synergy Plate Reader	Biotek
THPTA	Click Chemistry Tools	1010-100
Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)	Fisher Scientific	BP153-500
Triton X 100	Bio-Rad	1610407
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100