Измерение распространения сосудистых гладких мышечных клеток с помощью нажмите химии

Victoria Wong; Prakash Arumugam; Lucile E. Wrenshall

doi:10.3791/59930

АВТОРЫ

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Method Article

Измерение распространения сосудистых гладких мышечных клеток с помощью нажмите химии

DOI:

10.3791/59930

⸱

October 30th, 2019

Victoria Wong¹, Prakash Arumugam¹, Lucile E. Wrenshall¹^,²

¹Department of Neuroscience, Cell Biology, and Physiology, Wright State University, ²Department of Surgery, Boonshoft School of Medicine, Wright State University

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Резюме

Распространение является важной частью клеточной функции, и общие считывая используется для оценки потенциальной токсичности новых препаратов. Измерение пролиферации, таким образом, часто используется в клеточной биологии. Здесь мы представляем простой, универсальный метод измерения пролиферации, который может быть использован в клетках,приверженных и непридерживаться.

Аннотация

Способность клетки размножаться является неотъемлемой частью нормальной функции большинства клеток, и дисрегуляция пролиферации лежит в основе многих процессов заболевания. По этим причинам измерение пролиферации является общим инструментом, используемым для оценки функции клеток. Пролиферация клеток может быть измерена просто путем подсчета; однако это косвенное средство измерения распространения. Одним из распространенных средств непосредственного обнаружения клеток, готовящихся к разделению, является включение помеченных нуклеозидных аналогов. К ним относятся радиоактивный нуклеозидный аналог³H-тимидин плюс нерадиоактивные нуклеозидные аналоги, такие как 5-бромо-2' deoxyuridine (BrdU) и 5-этинил-2 -deoxyuridine (EdU). Включение EdU обнаруживается по щелчку химии, которая имеет ряд преимуществ по сравнению с BrdU. В настоящем докладе мы предусматриваем протокол для измерения распространения путем включения Эду. Этот протокол включает в себя варианты различных считываний, а также преимущества и недостатки каждого из них. Мы также обсуждаем места, где протокол может быть оптимизирован или изменен для удовлетворения конкретных потребностей запланированного эксперимента. Наконец, мы касаемся способов, которыми этот базовый протокол может быть изменен для измерения других метаболитов клеток.

Введение

Распространение является важнейшей частью клеточной функции^1,². Контроль распространения влияет на нормальные процессы, такие как развитие, и патологические процессы, такие как рак и сердечно-сосудистые заболевания. Гиперпластический рост сосудистых гладких мышечных клеток, например, считается предшественником атеросклероза^3. Изменения в пролиферации клеток также используются для оценки потенциальной токсичности новых препаратов. Учитывая его широкое воздействие, измерение распространения является основой многих лабораторий, основанных на клеточной биологии.

Пролиферация клеток может быть измерена путем простого подсчета клеток, если популяция клеток, представляющих интерес, делится довольно быстро. Для более медленных растущих клеток количество клеток может быть менее чувствительным. Распространение часто измеряется путем включения помеченных нуклеозидных аналогов. Хотя золотой стандарт ³H-тимидин включения, многие лаборатории уходят от этого метода, учитывая наличие новых, нерадиоактивных альтернатив. К ним относятся цитоплазматические флуоресцентные красители, обнаружение связанных с клетками белков и включение нерадиоактивных нуклеозидных аналогов, таких как деоксюридин 5-бромо-2' (BrdU) и 5-этинил-2 --deoxyuridine (EdU)⁴.

Цитоплазматические красители, такие как carboxyfluorescein диацетат succinimidyl эфир (CFSE), обнаружить пролиферацию, потому что интенсивность красителя половинки каждый раз, когда клетка делит⁵. Этот метод обычно используется в цитометрии потока для неприсоединения клеток. Он не был использован много для приверженцев клеток, но с новым поколением изображений пластины читателей это может измениться. Обнаружение клеточного цикла связанных белков с помощью антител на основе методов (поток цитометрии, иммуногистохимии и т.д.) часто используется для тканей или неприсоединения клеток. Эти клетки / ткани должны быть исправлены и проницательны до окрашивания. Нуклеозидные аналоги BrdU и EdU похожи по подходу к ³H-тимидину, но без неудобства радиоактивности. Включение BrdU обнаруживается анти-BrdU антител, и поэтому клетки должны быть фиксированными и проницаемыми до окрашивания. Кроме того, клетки должны рассматриваться dNase подвергать эпитоп BrdU.

Включение EdU обнаруживается щелчком химии, в которой алкин и азид групп "нажмите" вместе в присутствии каталитического меди. Любая группа может служить в качестве биосинтетически включены молекулы или обнаружения молекулы⁴. Коммерчески доступные нуклеозидные аналоги имеют алкин группы прилагается. Таким образом, для анализов пролиферации алкининовый нуклеозидный аналог обнаруживается ацидом азида, спряженный к флуоресцентному красищу или другому маркеру. Включение EdU имеет ряд преимуществ перед BrdU. Во-первых, потому что алкин и азид группы не встречаются в клетках млекопитающих, это взаимодействие является весьма конкретным с низким фоном⁶. Поскольку обе группы малы, клетки не должны проходить денатурацию ДНК, чтобы разоблачить аналог нуклеозидов, как это требуется для BrdU^7. Наконец, нажмите химии является весьма универсальным, и может быть использован для метаболической маркировки ДНК, РНК, белка, жирных кислот и углеводов⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹. Если метаболически помеченная цель интереса находится на поверхности клетки, живые клетки могут быть помечены¹². Кроме того, клетки могут быть дополнительно обработаны для иммунофлуоресцентного окрашивания антителами.

Следующий протокол описывает использование edU включения и нажмите химии для измерения пролиферации в человеческих сосудистых гладких мышечных клеток(рисунок 1). Мы показываем три различных способа включения EdU могут быть измерены, репрезентативные результаты от каждого, и их преимущества и недостатки. Измерение пролиферации с помощью щелчка химии особенно полезно для приверженцев, медленнее растущих клеток. Кроме того, морфология клетки в хорошем состоянии и антитела на основе окрашивания также может быть выполнена.