מדידת התפשטות של תאים שרירים וסקולריים חלקה באמצעות לחץ כימיה

Summary

התפשטות היא חלק מכריע בתפקוד הסלולר, ובדיקה משותפת המשמשת להערכת רעילות פוטנציאלית של תרופות חדשות. מדידת התפשטות היא, לכן, שימוש תכוף בביולוגיה התא. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה, רב-תכליתית של מדידת התפשטות כי ניתן להשתמש בתאים חסיד ושאינם חסיד.

Abstract

היכולת של תא להתרבות היא בלתי נפרד לתפקוד הרגיל של רוב התאים, והדיסרגולציה של התפשטות היא בלב תהליכי מחלות רבים. מסיבות אלה, מדידת ההפצה היא כלי נפוץ המשמש להערכת הפונקציה cell. ניתן למדוד את תפוצת התא רק על ידי ספירה; עם זאת, זהו אמצעי עקיף למדידת התפשטות. אחד האמצעים השכיחים של במישרין זיהוי תאים הכנת לחלק הוא על ידי התאגדות של התווית האנלוגית נוקלאוסייד. אלה כוללים את הרדיו האנלוגי נוקלאוטיל ³H-thymidine פלוס non-רדיואקטיבי נוקלאוסייד אנלוגיות כגון 5-bromo-2 ' Deoxyuridine (bromo) ו-5-ethynyl-2′-Deoxyuridine (EdU). התאגדות של EdU מזוהה על ידי לחיצה על כימיה, אשר יש מספר יתרונות כאשר בהשוואה BrdU. בדוח זה, אנו מספקים פרוטוקול למדידת התפשטות באמצעות התאגדות של EdU. פרוטוקול זה כולל אפשרויות לקריאות שונות, יחד עם היתרונות והחסרונות של כל אחד מהם. אנו גם דנים במקומות שבהם הפרוטוקול יכול להיות ממוטב או שונה כדי לענות על הצרכים הספציפיים של הניסוי המתוכנן. לבסוף, אנו נוגעים בדרכים כי פרוטוקול בסיסי זה ניתן לשנות עבור מדידת מטבוליטים תא אחרים.

Introduction

התפשטות היא חלק מכריע בתפקוד הסלולר^1,2. שליטה על התפשטות ההשפעות על תהליכים נורמליים כגון פיתוח, תהליכים פתולוגיים כגון סרטן ומחלות לב וכלי דם. צמיחה היפרפלסטית של תאים שריר וסקולריים חלקה, למשל, הוא חשב להיות הקודמן טרשת עורקים³. שינויים בתפוצת התאים משמשים גם להערכת רעילות פוטנציאלית של תרופות חדשות. בהתחשב בהשפעה הנרחבת שלה, מדידת ההפצה היא התווך של מעבדות רבות בביולוגיה המבוססת על תאים.

ניתן למדוד את תפוצת התא על-ידי ספירת תאים בלבד אם אוכלוסיית הריבית מתפצלת במהירות רבה. עבור תאים הגדלים לאט יותר, ספירת תאים עשויה להיות פחות רגישה. התפשטות נמדדת לעתים קרובות על ידי התאגדות של התווית האנלוגית נוקלאוסייד. למרות התקן הזהב הוא ³H-thymidine התאגדות, מעבדות רבות מקבל הרחק משיטה זו בהתחשב בזמינות של חדש, לא רדיואקטיבי חלופות. אלה כוללים צבעי פלורסנט cytoplasmic, זיהוי של מחזור תאים חלבונים משויכים, והתאגדות של שאינם רדיואקטיביים נוקלאוסייד אנלוגיות כגון 5-bromo-2 ' deoxyuridine (Bromo) ו-5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)⁴.

צבעי cytoplasmic, כגון carboxyfluoraatstcdedit (CFSE), לזהות התפשטות משום שעוצמת החצאים של הצבע בכל פעם תא מחלק⁵. טכניקה זו משמשת בדרך כלל בזרימה cy, לנסות תאים שאינם חסיד. זה לא נעשה הרבה עבור תאים חסיד, אבל עם הדור החדש של הקוראים צלחת ההדמיה זה עשוי להשתנות. זיהוי של מחזור התא חלבונים הקשורים באמצעות נוגדנים מבוססי טכניקות (הזרימה cy, כימיה אימונוהיסטוכימיה, וכו ') משמש לעתים קרובות עבור רקמות או תאים שאינם חסיד. תאים/רקמות אלה חייב להיות קבוע מחלחל לפני כתמים. הפונקציה מזהה את הקוד האנלוגי מדומה BrdU ו-EdU דומים בגישה ל- ³שעות-thymidine. התאגדות של BrdU מזוהה על ידי נוגדנים אנטי BrdU, ולכן התאים חייב להיות קבוע וחדיר לפני כתמים. בנוסף, התאים חייבים להיות מטופלים עם DNase כדי לחשוף את האפיפי של BrdU.

התאגדות של EdU מזוהה על ידי לחיצה על כימיה, שבה הקבוצה האלקין והעזידה "לחץ" יחד בנוכחות של נחושת קטליטי. כל קבוצה יכולה לשמש כמולקולה הביואופטית המשולבת או מולקולה גילוי⁴. הקבוצה האלמני הזמינה מסחרית. לצורך התפשטות ההפצה, לפיכך, פונקציונליות האלנובית של נוקלאוסייד אנלוגי מזוהה על ידי עזידה מצומת לצבע פלורסנט או סמן אחר. לשילוב של EdU יש מספר יתרונות על BrdU. ראשית, מכיוון שקבוצות האלאלקין והעזידה אינן מצויים בתאי היונקים, האינטראקציה הזאת היא מאוד ספציפית עם רקע נמוך⁶. בגלל שתי הקבוצות הן קטנות, תאים לא צריך לעבור דנטורציה DNA כדי לחשוף את נוקלאוטיד אנלוגי כנדרש brdu⁷. לבסוף, לחץ על כימיה הוא תכליתי מאוד, והוא יכול לשמש תיוג מטבולית של DNA, RNA, חלבון, חומצות שומן, ופחמימות^8,9,10,11. אם יעד הריבית הmetabolically נמצא על משטח התא, ניתן לתייג תאים חיים¹². בנוסף, תאים יכולים להיות מעובדים עוד יותר עבור הוספת כתמים אימונולוורםעם נוגדנים.

הפרוטוקול הבא מתאר את השימוש ב-EdU התאגדות ולחץ כימיה כדי למדוד התפשטות בתאי השריר החלק כלי הדם האנושיים (איור 1). אנו מראים שלוש דרכים שונות של התאגדות של EdU ניתן למדוד, מייצגים תוצאות מכל אחד, ואת היתרונות והחסרונות שלהם. מדידת התפשטות באמצעות כימיה לחץ היא שימושית במיוחד עבור חסיד, תאים הגדלים לאט יותר. בנוסף, את המבנה של התא הוא מתוחזק היטב, מבוססי נוגדן מכתים ניתן גם לבצע.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. זיהוי של EdU באמצעות תווית פלורסנט

1. פתרונות מניות
   1. הכינו פתרון מניות של 5 ממ מ על ידי הוספת 12.5 מ"ג של EdU ל 10 מ ל של כפול מזוקקים H₂O.
   2. להכין את רכיבי הפתרון תיוג: 200 mM טריס (3-הידרוקסימתיל) אמין (THPTA) (100 mg ב 1.15 mL H₂o), 100 MM cuso₄ (15.95 Mg ב 1 ml h₂o; להפוך טריים), 10 מ"מ Cy3 picolyl-azide (1 מ"ג בתוך 95.3 mL-h₂o) , מאוחסן ב-5 μL מעלות at-20 ° c), ו 1 ascorbate נתרן (200 mg ב 1 mL H₂O; להפוך טריים).
   3. הכנת resazurin מניות פתרון בריכוז של 0.15 mg/mL. מסנן לעקר ולאחסן 1 mL הבליטים ב 4 ° c.
      הערה: picolyl אזיד זמין מצומת לכמה fluors שונים, biotin, ו חזרת peroxidase (hrp).
2. סמן תאים שריר וסקולריים חלקה (VSMC) עם EdU.
   הערה: vsmcs האנושי מבודדים מעורקים כסל באמצעות התרחבות מפיסות הרקמה ההסבר. כאשר גדל בתוך מדיה חינם סרום עם אינסולין, העברת, סלניום תאים אלה לבטא סמנים VSMC smoothelin, שריר חלק רירן שרשרת כבדה (SM-MHC) ו-SMC αactin¹³.
   1. לוחית כלי דם חלקה שרירים בתוך 2 x 10⁴/mL ב בינונית של הנשר שונה של העיט (dmem) ב 96 צלחת היטב.
      הערה: התאים גדלים ב 37 ° צ' בתקשורת תא שרירים חלקה עם 2% סרום עוברי העובר.
   2. אופציונלי אפשר מספר שעות למשך הלילה לצורך הדבקות. הוסף 20 מניות Μrea במלאי לכל באר. מחלת הקרינה ב 37 ° c עבור 3 ה. לקרוא את האות הפלואורסצנטית בקורא צלחת (560_ex, 594_em). החלף מדיה באמצעות DMEM טרי.
      הערה: שלב זה הוא אופציונלי. Resazurin משמש לנרמל מספרי תאים וחשבון עבור השתנות היטב בציפוי¹⁴.
   3. הוספת מלוחים באגירה פוספט (PBS) או גורם הגדילה הנגזר של טסיות (PDGF) 30 ng/mL ל 3-6 בארות לכל טיפול בתחילת תקופת התרבות ו הדגירה עבור 72 h.
   4. לדלל 5 מ"מ מלאי של המניה 1 מ"מ. הוסף 2 μL לכל הבאר (ריכוז סופי 20 μM) עבור 24 שעות האחרונות של תקופת התרבות 72 h. אל תוסיף EdU לקבוצה אחת של שכפול. בארות אלה ישמשו לקביעת מעבר לאור ברקע.
      הערה: משך התרבות והתיוג עם EdU מותאם במיוחד לתאי שריר חלקים, אך ייתכן שיהיה צורך לשנותם לכל סוג תא.
3. תקן תאים פאראפורמלדהיד.
   1. הסרת מדיה והוספת 150 μL של 4% בכיוון הערוץ (PBS) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. להסיר את התחתית ולהוסיף 150 μl של 1% פוליאתילן גליקול טרט-octylphenyl אתר (TX-100) (במים) בבאר עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. הסר TX-100 על ידי שטיפת שלוש פעמים עם PBS.
      התראה: המטה רעיל, לטפל בזהירות.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן לאחסן תאים קבועים ב-PBS ב-4 ° c.
4. זיהוי משולב של EdU.
   1. לבצע תיוג פתרון (10 מ"ל לכל 96 צלחת הבאר, באמצעות הפנימי 60 בארות) רק לפני השימוש על ידי הוספת ריאגנטים מתוך פתרונות המניה בסדר הבא: thpta 20 μl, cuso₄ 20 μl, Cy3 picolyl אזיד 5 μl, Na ascorbate 100 μl ל-PBS עבור נפח כולל של 10 mL.
   2. להסיר PBS מבארות ולהוסיף 150 μL של הפתרון תיוג לכל טוב. דגירה 30 דקות ב 37 ° c. כדי לזהות את כל גרעיני, להוסיף 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לכל טוב. קרא על הקורא צלחת הזריחה (Cy3 550_ex, 570_em; DAPI 350_לשעבר, 470_em) או תמונה על מיקרוסקופ.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן לאחסן תאים קבועים ומוכתמים ב-PBS ב-4 ° צ' ובתמונה במועד מאוחר יותר.

2. זיהוי של EdU באמצעות הומינסנציה

1. סעיפים שלמים 1.1 – 1.3.
2. הכינו טריס-מלוחים באגירה עם 0.1% polysorbate 20 (TBST).
3. . בלוק בארות
   1. הוסף 150 μL של חסימת מאגר (טבלה של חומרים) על כל באר ו מארג עבור 90 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. הסר מאגר חוסם ושטוף שלוש פעמים עם 200 μL של PBS.
4. זיהוי משולב של EdU.
   1. הפוך את פתרון התיוג כמכוון בשלב 1.4.1, והחליף ביוטין picolyl עבור Cy3 picolyl אזיד.
   2. רוחצים את הבארות חמש פעמים עם 200 μL של TBST, עם טלטול, 3 דקות לכביסה.
   3. Peroxidases אנדודוגני כיבוי עם 150 μL של 0.3% H₂O₂ עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. הסרת H₂O₂ ולשטוף חמש פעמים עם 200 ΜL של tbst, עם טלטול 3 דקות לשטוף.
   5. לדלל streptavidin-חזרת peroxidase (SA-HRP; 1:200) ב TBST ולהוסיף 50 μL לכל טוב. . משטח 1 בטמפרטורת החדר
   6. שטוף חמש פעמים עם 200 μL של TBST, עם טלטול, 3 דקות לכביסה.
   7. הוסף 50 μL של שיטת האנזים החיסוני המקושרת באמצעות אנזימים (שולחן חומרים) לכל באר.
   8. קרא מיד בקורא לוחית המסוגל לזהות הומינסנציה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

באיור 2, אנו להדגים את התוצאות של שלושה ניסויים שונים מדידת התפשטות VSMC בתגובה pdgf. לאחר שגדל את התאים במדיה שגובשה עבור SMCs, אנו ביצעו את הניסוי ב-DMEM בחינם סרום, כדי לחסל את כל ההשפעות הפוטנציאליות של סרום או גורמי גדילה על התפשטות. באיור 2A אנו משווים תוצאות, מאו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

התאגדות של EdU היא דרך פשוטה ופשוטה למדוד הפצת תאים; הוא שימושי במיוחד עבור תאים חסיד¹³. הפרוטוקול שלנו משתמש בתאי שריר חלקה, אבל זה חל על כל תא חסיד (אפיתל, אנדותל, וכו '). למרות שהפרוטוקול אינו מורכב, הצעד הקריטי היחיד מבצע את פתרון התיוג-יש להוסיף את החומרים בסדר המפורט. בנוסף, כמו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine	Carbosynth	NE08701
biotin picolyl azide	Click Chemistry Tools	1167-5
CuSO4	Fisher Scientific	C1297-100G
Cy3 picolyl azide	Click Chemistry Tools	1178-1
Cytation Plate Reader	Biotek
EVOS Microscope	Thermo Fisher Scientific
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763
Na ascorbate	Sigma-Aldrich	11140-250G
NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes	Invitrogen	R37606	DAPI nuclear stain
Odyssey Blocking Buffer	Li-Cor	927-40000	blocking buffer
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Services	15710
PBS	Fisher Scientific	SH3002802
Sodium Chloride	Sigma Life Science	S3014-5kg
Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate	Life Technologies	S911
Super Signal ELISA Femto	Thermo Scientific	PI137075	ELISA substrate
Synergy Plate Reader	Biotek
THPTA	Click Chemistry Tools	1010-100
Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)	Fisher Scientific	BP153-500
Triton X 100	Bio-Rad	1610407
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100