استخراج الكورتيزول من زعانف سمك الحفش ومصفوفات عظم الفك

Summary

في هذه الدراسة، نقدم بروتوكول لاستخراج الكورتيزول من الزفية وعظم الفك من أنواع سمك الحفش. تم فحص مستويات الكورتيزول الزعانف وعظم الفك مرة أخرى عن طريق مقارنة اثنين من المذيبات الغسيل تليها الاختبارات ELISA. وقد قامت هذه الدراسة بتجريب جدوى الكورتيزول في عظم الفك كمؤشر جديد للإجهاد.

Abstract

وكانت أهداف هذه الدراسة تطوير تقنية لاستخراج الكورتيزول من زعانف سمك الحفش باستخدام اثنين من المذيبات الغسيل (الماء وisopropanol) وتحديد أي اختلافات في مستويات الكورتيزول الزفين بين ثلاثة أنواع رئيسية من سمك الحفش. تم حصاد زعانف من 19 الحفش التضحية بما في ذلك سبعة بيلوجا(هوسو هوسو)،سبعة سيبيريا(Acipenser baerii)،وخمسة سيفروغا(A. stellatus). وقد رُفع سمك الحفش في المزارع الإيرانية لمدة سنتين (2017-2018)، وأُجري تحليل لاستخراج الكورتيزول في كوريا الجنوبية (كانون الثاني/يناير - شباط/فبراير 2019). كما تم استخدام عظام الفك من خمسة H. huso لاستخراج الكورتيزول. تم تحليل البيانات باستخدام إجراء النموذج الخطي العام (GLM) في بيئة SAS. وكانت معاملات التباين داخل وبين التبَوَس14 و7.70 على التوالي. باختصار، وشملت تقنية استخراج الكورتيزول غسل العينات (300 ± 10 ملغ) مع 3 مل من المذيبات (المياه النقية جدا وisopropanol) مرتين، والتناوب في 80 دورة في الدقيقة لمدة 2.5 دقيقة، وتجفيف الهواء العينات غسلها في درجة حرارة الغرفة (22-28 درجة مئوية) لمدة 7 أيام، مزيد من التجفيف العينات باستخدام الخافق حبة في 50 هرتز لمدة 32 دقيقة وطحنلهم في مسحوق، وتطبيق 1.5 مل الميثانول على مسحوق المجففة (75 ± 5 ملغ)، ودوران بطيء (40 دورة في الدقيقة) لمدة 18 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع خلط مستمر. وبعد الاستخراج، تم طرد العينات بالطرد المركزي (500 9 x غرام لمدة 10 دقائق)، ونُقل جهاز سوبرناتان تبقدر 1 مل إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الصغير (1.5 مل)، واحتضن في درجة حرارة 38 درجة مئوية لتبخر الميثانول، وحلل عن طريق الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) . لم تلاحظ أي اختلافات في مستويات الكورتيزول الزفية بين الأنواع أو في مستويات الكورتيزول الزفية وعظم الفك بين غسل المذيبات. تظهر نتائج هذه الدراسة أن مصفوفة عظم الفك سمك الحفش هو مؤشر الإجهاد البديل واعدة إلى المصفوفات الصلبة.

Introduction

الكورتيزول هو مؤشر موثوق به للإجهاد الحيواني. استخراج الكورتيزول يوفر إطارا صالحا للباحثين لرصد مستويات الإجهاد والأنماط العامة في الضغوط. على سبيل المثال، أجرت الدراسات السابقة التحقق المنهجي من قياسات الكورتيزول الشعر باستخدام أساليب مختلفة في البشر^1،2،الالقردة^3،4،الماشية^5،الأغنام^6،و ذهبية^7،8. في أنواع الأسماك، وقد ثبت قياسات الكورتيزول في المصفوفات مثل المقاييس، والمخاط الجلد، والبراز، والدم⁹ لتوفير معلومات عن صحة الأسماك. عندما يكون أخذ عينات الدم إشكالية أو عدم وجود جداول، هناك حاجة إلى مصفوفات بديلة لاستخراج الكورتيزول. في الأسماك، يمكن أن تشمل المصفوفات البديلة عظم الفك، وهو نسيج صلب مماثل للسن البشري^10.

إن وضع مصفوفات جديدة وتقنيات معتمدة لتحديد مستويات الإجهاد على الأسماك له أهمية خاصة بالنسبة لصناعة الكافيار، حيث يمكن أن يتعرض سمك الحفش لفترات طويلة لعوامل الإجهاد البيئي¹¹. جنس سمك الحفش لا يمكن تحديدها قبل 2 سنة من العمر، وسمك الحفش ليس لديها جداول. لأن الكورتيزول يتراكم تدريجيا في المصفوفات الصلبة خلال مرحلة النمو^2،7،12، على المدى الطويل بيانات تراكم الكورتيزول من المصفوفات الصلبة مثل زعانف وعظام الفك يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في الإجهاد المستويات في مراحل النمو المختلفة. وعلى النقيض من ذلك، توفر مستويات الكورتيزول في الدم لقطة من مستويات الإجهاد في وقت الوفاة ولا يمكن أن تمثل بدقة الإجهاد خلال ظروف تربية طويلة الأجل^13،14. ومع تزايد المنافسة في سوق الكافيار، تشكل النهج الجديدة لتحسين ظروف الإجهاد لإنتاج بيض أكثر صحة بين أنواع سمك الحفش أثناء تربية الحفش على المدى الطويل (8-12 سنة أو أكثر) مجالا ً متزايد الأهمية من مجالات البحث. ونظرا لارتفاع تكلفة سمك الحفش، فإن العينات التي يتم حصادها مكلفة للغاية (000 8-000 15 دولار لكل سمكة ناضجة حسب الأنواع ومرحلة النمو)، وهو عامل يحد من مشاريع البحوث. ومع ذلك، فإن تطوير تقنية مناسبة لاستخراج الكورتيزول من زعانف سمك الحفش وعظام الفك يمكن تطبيقها بشكل مفيد على كل من نظم تربية الأسماك والأسماك البرية لتحسين نوعية وحصاد بيض سمك الحفش للاستهلاك وعلى حد سواء حفظ.

فضلا عن توفير نتائج موثوق بها⁶، واختيار تقنية استخراج الكورتيزول المناسبة ذات أهمية حاسمة لضمان أن المركبات الأخرى الموجودة في المصفوفة أثناء إعداد العينة لا تشوش الناتج ، والتي قد تؤدي إلى نتائج غير متناسقة. من المهم بنفس القدر تحديد ما إذا كانت مستويات الكورتيزول الزفية وعظم الفك تتأثر بمستويات الهرمونات في المياه المحيطة. واقترح Heimbürge وآخرون^أن عددا من العوامل قد تؤثر على مستويات الكورتيزول بما في ذلك العمر والجنس والحمل والموسم واللون¹²، ومنطقة الجسم التي يتم استخراج الكورتيزول¹⁶. ومع ذلك، لا تتوفر سوى معلومات قليلة عن آثار غسل المذيبات على استخراج الكورتيزول في مصفوفات جسم السمك⁸، ولا شيء عن هذه الآثار في سمك الحفش ، باستثناء بيض سمك الحفش¹⁷.

على الرغم من أن تحليل مستويات الكورتيزول الأساسية من زعانف وعظام الفك من سمك الحفش يتطلب أن يتم قتل الأسماك، وهذا النهج لا ينطوي على التقنيات الغازية اللازمة لأخذ عينات الدم في سمك الحفش الحية. يتم جمع عينات الزفين وعظم الفك بسهولة، ويمكن إجراء استخراج من هذه الأنسجة بسرعة. وبالمثل, استخراج هرمون وتحليل واضحة وتتطلب القليل من المعدات المتخصصة.

في هذه الدراسة، نقدم تقنية جديدة وسهلة التطبيق لاستخراج وغسل وتحديد الكورتيزول من زعانف الأسماك وعظام الفك، بهدف تحديد ما إذا كانت مستويات الكورتيزول تقاس من هذه المصفوفات يمكن استخدامها بشكل موثوق كإجهاد مؤشرات. وتشمل مزايا هذه التقنية نهج⁸ سهلة وغير الغازية, أقل تباين البيانات, والانتاج موثوق بها^1,6,8,17; هذه التقنية تنطبق على أنواع الأسماك دون جداول مثل سمك الحفش. هذه التقنية تتطلب ذبح الأسماك، واختيار المذيبات الغسيل^{المناسبة2،4،}طحن السليم من العينات^3،5،المهنية المرتبطة بالإنزيم فحص المناعية (ELISA) تطبيق^5،7، ومعرفة واسعة من دمج مصادر الكورتيزول في المصفوفات الصلبة^6.

طبقنا اثنين من المذيبات الغسيل مختلفة (المياه النقية جدا وisopropanol) للحصول على مستويات الكورتيزول القاعدية في زعانف من ثلاثة أنواع سمك الحفش: بيلوجا(هوسو هوسو)،سيبيريا(Acipenser baerii)،وسيفروغا(A. stellatus )، في ظل الظروف البيئية القياسية لكل نوع. كما تم استخدام عظام الفك من H. huso لتقييم الإجهاد في سمك الحفش. هذه هي أول دراسة لقياس مستويات الكورتيزول في عظام الفك الحفش. وسوف توفر نتائج هذه الدراسة بيانات الكورتيزول المقارنة لأنواع سمك الحفش في مرحلة النمو المبكر (~ 1 سنة) قبل تحديد الجنس.

Protocol

ووافقت هيئة رعاية الحيوان والأخلاق في جامعة كانغوون الوطنية، تشونتشون، جمهورية كوريا، على الإجراءات والأساليب التجريبية التالية.

1. جمع الزفية

1. التقاط سمك الحفش بلطف باستخدام شبكة للحد من الإصابات والإجهاد.
2. شطف الأسماك بعناية بالماء العذب ثم مسح سطح الجسم مع منشفة ماصة قبل القتل الرحيم.
3. ضرب رأس السمكباستخدام مطرقة بلاستيكية بحيث يتم فاجأ الأسماك أو يفقد الوعي. إزالة الرأس باستخدام سكين.
4. قياس وزن الجسم (ز) وطول (سم).
5. بعد القتل الرحيم، وجمع عينات زمنة عن طريق قطع أقرب ما يمكن من الجسم باستخدام مقص الجراحية المعقمة.
   ملاحظة: يجب استخدام المناشف الماصة الفردية غير المعاد تدويرها لكل سمكة. وكانت الإحصاءات الوصفية للأنواع المستخدمة في هذه الدراسة على النحو التالي: سمك الحفش البيلوجا(H. huso):العمر = 18 ± 2.1 أشهر، وزن الجسم = 2700 ± 300 غرام، وطول الجسم = 55 ± 5 سم؛ سمك الحفش السيبيري(A. baerii):العمر = 9.6 ± 2.4 أشهر، وزن الجسم = 1750 ± 250 غرام، وطول الجسم = 45 ± 5 سم؛ سيفروغا سمك الحفش(A. stellatus):العمر = 14 ± 1.3 أشهر، وزن الجسم = 1000 ± 100 غرام، وطول الجسم = 65 ± 5 سم.

2. إعداد الزفين لاستخراج الكورتيزول

1. ضع عينات الزفية (عينة واحدة لكل نسيج: حوالي 3 جم) على ورق وزن المختبر (107 مم × 210 مم) وجاف في درجة حرارة الغرفة لبضعة أيام حتى يجف.
2. التفاف عينات في صفائح من رقائق الألومنيوم، ووضع هافيأكياس بلاستيكية المسمى، ونقلها إلى المختبر.
3. تخزين العينات في الثلاجة لمزيد من الاستخدام، بما في ذلك الغسيل، واستخراج الكورتيزول، والتجفيف، وتحليل ELISA(الشكل 2).

3. تحليل الكورتيزول الزفية

1. معايرة المقياس التحليلي الرقمي (الدقة: 0.0001) وتزن 300 ± 10 عينات ملغ مع ورقة وزنها على عموم مقياس.
2. اغسل العينات
   1. نقل كل عينة في أنبوب البولي بروبلين مخروطي 15 L. إضافة 3 مل من إيزوبروبانول إلى كل أنبوب باستخدام ماصة قناة واحدة 5000 ميكرولتر.
   2. تدوير الأنابيب في 80 دورة في الدقيقة لمدة 2.5 دقيقة لغسل الكورتيزول وإزالة أي تلوث خارجي محتمل. كرر هذا الإجراء مرتين.
   3. الهواء الجاف العينات غسلها في درجة حرارة الغرفة (22-28 درجة مئوية) لمدة 7 أيام.
   4. كرر إجراء الغسيل باستخدام الماء النقي للغاية كعامل الغسيل.
3. استخراج عظم الفك من أنسجة الجسم باستخدام ملقط قطع العظام. تطبيق الخطوات 1.5-3.2.4 على عينات عظم الفك.
4. وزن (75 ± 5 ملغ) عينات الزمن المجفف أو عظم الفك وطحن باستخدام الخافق حبة في 50 هرتز لمدة 32 دقيقة.
   1. تسليم 1.5 مل من الميثانول في كل أنبوب يحتوي على زعانف مسحوق أو عظم الفك باستخدام ماصة 1000 درجة مئوية. ضع العينات على مدورة أنبوب في دوران بطيء (40 دورة في الدقيقة) لمدة 18 ساعة في درجة حرارة الغرفة لاستخراج الكورتيزول مع الخلط المستمر.
5. بعد استخراج الكورتيزول، الطرد المركزي العينات في 9500 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي، جمع الطبقة العضوية العليا التي تحتوي على الكورتيزول (1 مل) من كل عينة ووضعها في أنبوب منفصل 1.5 مل الطرد المركزي.
   1. تجفيف العينات عن طريق الحضانة في 38 درجة مئوية لتبخر الميثانول. الحفاظ على عينات الكورتيزول المستخرجة تحت غطاء الدخان بين عشية وضحاها للسماح الميثانول لتبديد.
      ملاحظة: الطبقة التي تحتوي على الكورتيزول عادة ما تكون مصفرة في اللون.

4. كشف الكورتيزول الزفية

1. إذابة عينات الزفين المجفف أو عظم الفك في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 ساعة قبل استخدام مجموعة ELISA.
2. إضافة 400 درجة مئوية من الفوسفات العازلة، دوامة، والطرد المركزي في 1500 × ز لمدة 15 دقيقة.
3. قم بتشغيل كل عينة (25 درجة مئوية) مكررة لتحسين دقة وموثوقية الدقة في الدقة. قم بإزالة أية بيانات خارج المنحنى القياسي كالقيم الخارجية.
4. تعيين قارئ لوحة صغيرة إلى 450 نانومتر، ثم تعيين إلى درجة مئوية dL^-1 وقراءة الكثافة البصرية لللوحة.
   1. استخدم برنامج الميكروبليت مع منحنى انحدار غير خطي ذو أربعة معلمات مناسب. تحويل مستويات الكورتيزول من العينات التي تم الحصول عليها من البرنامج إلى pg mg^-1 باستخدام المعادلة التالية:
      واو = 000 10 هاء (ألف/باء) (جيم/دال)،
      حيث F = القيمة النهائية لمستوى الكورتيزول الزفية في (pg mg^-1)،E = حجم (مل) من المخزن المؤقت اختبار المستخدمة لإعادة تشكيل استخراج المجففة، A = التركيز (μg dL^-1)المقدمة من الناتج اختبار، B = الوزن (ملغ) من الزينة التي تخضع لإضافية ction, C = حجم (مل) من الميثانول المضافة إلى الزفون المجففة, و D = حجم (مل) من الميثانول تعافى من استخراج والمجففة في وقت لاحق أسفل³.

5. التحليل الإحصائي

1. تقسيم كل عينة إلى عينتين فرعيتين قبل إجراء الغسيل ثم تشغيل في تكرار أثناء اختبار مجموعة ELISA (2 × 2 = 4 ملاحظات لكل عينة) لتحسين قوة الاختبار وموثوقية النتائج.
2. مقارنة تأثيرات المذيبات الغسيل اثنين وتفاعلاتها عن طريق تطبيق إجراء النموذج الخطي العام (GLM) في بيئة البرمجيات SAS لبيانات القياس¹⁸.
3. اختبار الاختلافات بين الوسائل باستخدام اختبار توكي على مستوى أهمية p < 0.05. قبول 0.05 < p < 0.10 كدليل على الميل بدلاً من أن يكون فرقاً كبيراً.

النتائج

وقد تم تطوير تقنية استخراج الكورتيزول الزفية المقدمة وتأكيدها في هذه الدراسة باستخدام ثلاثة أنواع من سمك الحفش. تم مقارنة مستويات الكورتيزول التي تم الحصول عليها باستخدام المياه النقية جدا وisopropanol كما تم مقارنة المذيبات الغسيل(الشكل 2). تم فحص الكورتيزول...

Discussion

ويطلق على سمك الحفش في بعض الأحيان "أحفوري حي" لأنه أظهر القليل من التعديلات على مدى آلاف السنين الماضية. يحتوي جنس سمك الحفش Acipenser على 27 نوعاً تنتج الكافيار. ومع ذلك، ثلاثة أنواع (بيلوجا، بايري، وسيفوروغا) تنتج معظم إمدادات الكافيار العالمية. وسمك الحفش معرض للإفراط في صيد الأسماك وال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposal latex surgical gloves	Ansell	63754090
Platform scale-electronic weighing 100kg	Baskoolnikoo	101 EM
Serological pipette to deliver up to 24 mL	Becton Dickinson Falcon	35-7550
Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters	BioTek	8041000
Reagent reservoirs	BrandTech	703459
Zipper storage plastic bag	Cleanwrap	30cm x100m
Isopropyl alcohol	Daejung chemicals & Metals	5035-4400
Methyl alcohol	Daejung chemicals & Metals	5558-4100
Tube rotator- MX-RL-Pro	DLAB Scientific	824-222217777
Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL	Eppendorf Research Plus	M21518D
Precision pipette to deliver 15 and 25 μL	Eppendorf Research Plus	R25623C
Weighing paper (107 x 210 mm)	Fisherbrand	09-898-12B
Bead beater, 50/60 Hz 2A	GeneReach Biotechnology Corp	tp0088
Plate rotator with orbit capable of 500 rpm	Hangzhou Miu Instrument	MU-E30-1044
Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL	Hyundai Micro	H20050
Fume hood	Kwang Dong Industrial	KD 901-22128175
Micro-centrifuge capable of 1500 x g	Labo Gene	9.900.900.729
Mini vortex mixer	LMS	VTX-3000L
Lotte aluminum foil roll	Lotte Aluminum	B0722X5FK5
Digital scale	Mettler Toledo	ME204
Ultrapure water	MDM	MDM-0110
Pipette tips	Neptune Scientific	REF 2100.N
Large fish net	Pond H2O	Hoz135
Salivary cortisol kit	Salimetrics	1-3002-4
Bone cutting forceps	Sankyo	26-188A
Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL	VITLAB	18A68756
Towel	Yuhan Kimberly	1707921546
Tissue paper (107 × 210)	Yuhan Kimberly	41117