Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذه الدراسة، نقدم بروتوكول لاستخراج الكورتيزول من الزفية وعظم الفك من أنواع سمك الحفش. تم فحص مستويات الكورتيزول الزعانف وعظم الفك مرة أخرى عن طريق مقارنة اثنين من المذيبات الغسيل تليها الاختبارات ELISA. وقد قامت هذه الدراسة بتجريب جدوى الكورتيزول في عظم الفك كمؤشر جديد للإجهاد.

Abstract

وكانت أهداف هذه الدراسة تطوير تقنية لاستخراج الكورتيزول من زعانف سمك الحفش باستخدام اثنين من المذيبات الغسيل (الماء وisopropanol) وتحديد أي اختلافات في مستويات الكورتيزول الزفين بين ثلاثة أنواع رئيسية من سمك الحفش. تم حصاد زعانف من 19 الحفش التضحية بما في ذلك سبعة بيلوجا(هوسو هوسو)،سبعة سيبيريا(Acipenser baerii)،وخمسة سيفروغا(A. stellatus). وقد رُفع سمك الحفش في المزارع الإيرانية لمدة سنتين (2017-2018)، وأُجري تحليل لاستخراج الكورتيزول في كوريا الجنوبية (كانون الثاني/يناير - شباط/فبراير 2019). كما تم استخدام عظام الفك من خمسة H. huso لاستخراج الكورتيزول. تم تحليل البيانات باستخدام إجراء النموذج الخطي العام (GLM) في بيئة SAS. وكانت معاملات التباين داخل وبين التبَوَس14 و7.70 على التوالي. باختصار، وشملت تقنية استخراج الكورتيزول غسل العينات (300 ± 10 ملغ) مع 3 مل من المذيبات (المياه النقية جدا وisopropanol) مرتين، والتناوب في 80 دورة في الدقيقة لمدة 2.5 دقيقة، وتجفيف الهواء العينات غسلها في درجة حرارة الغرفة (22-28 درجة مئوية) لمدة 7 أيام، مزيد من التجفيف العينات باستخدام الخافق حبة في 50 هرتز لمدة 32 دقيقة وطحنلهم في مسحوق، وتطبيق 1.5 مل الميثانول على مسحوق المجففة (75 ± 5 ملغ)، ودوران بطيء (40 دورة في الدقيقة) لمدة 18 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع خلط مستمر. وبعد الاستخراج، تم طرد العينات بالطرد المركزي (500 9 x غرام لمدة 10 دقائق)، ونُقل جهاز سوبرناتان تبقدر 1 مل إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الصغير (1.5 مل)، واحتضن في درجة حرارة 38 درجة مئوية لتبخر الميثانول، وحلل عن طريق الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) . لم تلاحظ أي اختلافات في مستويات الكورتيزول الزفية بين الأنواع أو في مستويات الكورتيزول الزفية وعظم الفك بين غسل المذيبات. تظهر نتائج هذه الدراسة أن مصفوفة عظم الفك سمك الحفش هو مؤشر الإجهاد البديل واعدة إلى المصفوفات الصلبة.

Introduction

الكورتيزول هو مؤشر موثوق به للإجهاد الحيواني. استخراج الكورتيزول يوفر إطارا صالحا للباحثين لرصد مستويات الإجهاد والأنماط العامة في الضغوط. على سبيل المثال، أجرت الدراسات السابقة التحقق المنهجي من قياسات الكورتيزول الشعر باستخدام أساليب مختلفة في البشر1،2،الالقردة3،4،الماشية5،الأغنام6،و ذهبية7،8. في أنواع الأسماك، وقد ثبت قياسات الكورتيزول في المصفوفات مثل المقاييس، والمخاط الجلد، والبراز، والدم9 لتوفير معلومات عن صحة الأسماك. عندما يكون أخذ عينات الدم إشكالية أو عدم وجود جداول، هناك حاجة إلى مصفوفات بديلة لاستخراج الكورتيزول. في الأسماك، يمكن أن تشمل المصفوفات البديلة عظم الفك، وهو نسيج صلب مماثل للسن البشري10.

إن وضع مصفوفات جديدة وتقنيات معتمدة لتحديد مستويات الإجهاد على الأسماك له أهمية خاصة بالنسبة لصناعة الكافيار، حيث يمكن أن يتعرض سمك الحفش لفترات طويلة لعوامل الإجهاد البيئي11. جنس سمك الحفش لا يمكن تحديدها قبل 2 سنة من العمر، وسمك الحفش ليس لديها جداول. لأن الكورتيزول يتراكم تدريجيا في المصفوفات الصلبة خلال مرحلة النمو2،7،12، على المدى الطويل بيانات تراكم الكورتيزول من المصفوفات الصلبة مثل زعانف وعظام الفك يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في الإجهاد المستويات في مراحل النمو المختلفة. وعلى النقيض من ذلك، توفر مستويات الكورتيزول في الدم لقطة من مستويات الإجهاد في وقت الوفاة ولا يمكن أن تمثل بدقة الإجهاد خلال ظروف تربية طويلة الأجل13،14. ومع تزايد المنافسة في سوق الكافيار، تشكل النهج الجديدة لتحسين ظروف الإجهاد لإنتاج بيض أكثر صحة بين أنواع سمك الحفش أثناء تربية الحفش على المدى الطويل (8-12 سنة أو أكثر) مجالا ً متزايد الأهمية من مجالات البحث. ونظرا لارتفاع تكلفة سمك الحفش، فإن العينات التي يتم حصادها مكلفة للغاية (000 8-000 15 دولار لكل سمكة ناضجة حسب الأنواع ومرحلة النمو)، وهو عامل يحد من مشاريع البحوث. ومع ذلك، فإن تطوير تقنية مناسبة لاستخراج الكورتيزول من زعانف سمك الحفش وعظام الفك يمكن تطبيقها بشكل مفيد على كل من نظم تربية الأسماك والأسماك البرية لتحسين نوعية وحصاد بيض سمك الحفش للاستهلاك وعلى حد سواء حفظ.

فضلا عن توفير نتائج موثوق بها6، واختيار تقنية استخراج الكورتيزول المناسبة ذات أهمية حاسمة لضمان أن المركبات الأخرى الموجودة في المصفوفة أثناء إعداد العينة لا تشوش الناتج ، والتي قد تؤدي إلى نتائج غير متناسقة. من المهم بنفس القدر تحديد ما إذا كانت مستويات الكورتيزول الزفية وعظم الفك تتأثر بمستويات الهرمونات في المياه المحيطة. واقترح Heimbürge وآخرونأن عددا من العوامل قد تؤثر على مستويات الكورتيزول بما في ذلك العمر والجنس والحمل والموسم واللون12، ومنطقة الجسم التي يتم استخراج الكورتيزول16. ومع ذلك، لا تتوفر سوى معلومات قليلة عن آثار غسل المذيبات على استخراج الكورتيزول في مصفوفات جسم السمك8، ولا شيء عن هذه الآثار في سمك الحفش ، باستثناء بيض سمك الحفش17.

على الرغم من أن تحليل مستويات الكورتيزول الأساسية من زعانف وعظام الفك من سمك الحفش يتطلب أن يتم قتل الأسماك، وهذا النهج لا ينطوي على التقنيات الغازية اللازمة لأخذ عينات الدم في سمك الحفش الحية. يتم جمع عينات الزفين وعظم الفك بسهولة، ويمكن إجراء استخراج من هذه الأنسجة بسرعة. وبالمثل, استخراج هرمون وتحليل واضحة وتتطلب القليل من المعدات المتخصصة.

في هذه الدراسة، نقدم تقنية جديدة وسهلة التطبيق لاستخراج وغسل وتحديد الكورتيزول من زعانف الأسماك وعظام الفك، بهدف تحديد ما إذا كانت مستويات الكورتيزول تقاس من هذه المصفوفات يمكن استخدامها بشكل موثوق كإجهاد مؤشرات. وتشمل مزايا هذه التقنية نهج8 سهلة وغير الغازية, أقل تباين البيانات, والانتاج موثوق بها1,6,8,17; هذه التقنية تنطبق على أنواع الأسماك دون جداول مثل سمك الحفش. هذه التقنية تتطلب ذبح الأسماك، واختيار المذيبات الغسيلالمناسبة2،4،طحن السليم من العينات3،5،المهنية المرتبطة بالإنزيم فحص المناعية (ELISA) تطبيق5،7، ومعرفة واسعة من دمج مصادر الكورتيزول في المصفوفات الصلبة6.

طبقنا اثنين من المذيبات الغسيل مختلفة (المياه النقية جدا وisopropanol) للحصول على مستويات الكورتيزول القاعدية في زعانف من ثلاثة أنواع سمك الحفش: بيلوجا(هوسو هوسو)،سيبيريا(Acipenser baerii)،وسيفروغا(A. stellatus )، في ظل الظروف البيئية القياسية لكل نوع. كما تم استخدام عظام الفك من H. huso لتقييم الإجهاد في سمك الحفش. هذه هي أول دراسة لقياس مستويات الكورتيزول في عظام الفك الحفش. وسوف توفر نتائج هذه الدراسة بيانات الكورتيزول المقارنة لأنواع سمك الحفش في مرحلة النمو المبكر (~ 1 سنة) قبل تحديد الجنس.

Protocol

ووافقت هيئة رعاية الحيوان والأخلاق في جامعة كانغوون الوطنية، تشونتشون، جمهورية كوريا، على الإجراءات والأساليب التجريبية التالية.

1. جمع الزفية

  1. التقاط سمك الحفش بلطف باستخدام شبكة للحد من الإصابات والإجهاد.
  2. شطف الأسماك بعناية بالماء العذب ثم مسح سطح الجسم مع منشفة ماصة قبل القتل الرحيم.
  3. ضرب رأس السمكباستخدام مطرقة بلاستيكية بحيث يتم فاجأ الأسماك أو يفقد الوعي. إزالة الرأس باستخدام سكين.
  4. قياس وزن الجسم (ز) وطول (سم).
  5. بعد القتل الرحيم، وجمع عينات زمنة عن طريق قطع أقرب ما يمكن من الجسم باستخدام مقص الجراحية المعقمة.
    ملاحظة: يجب استخدام المناشف الماصة الفردية غير المعاد تدويرها لكل سمكة. وكانت الإحصاءات الوصفية للأنواع المستخدمة في هذه الدراسة على النحو التالي: سمك الحفش البيلوجا(H. huso):العمر = 18 ± 2.1 أشهر، وزن الجسم = 2700 ± 300 غرام، وطول الجسم = 55 ± 5 سم؛ سمك الحفش السيبيري(A. baerii):العمر = 9.6 ± 2.4 أشهر، وزن الجسم = 1750 ± 250 غرام، وطول الجسم = 45 ± 5 سم؛ سيفروغا سمك الحفش(A. stellatus):العمر = 14 ± 1.3 أشهر، وزن الجسم = 1000 ± 100 غرام، وطول الجسم = 65 ± 5 سم.

2. إعداد الزفين لاستخراج الكورتيزول

  1. ضع عينات الزفية (عينة واحدة لكل نسيج: حوالي 3 جم) على ورق وزن المختبر (107 مم × 210 مم) وجاف في درجة حرارة الغرفة لبضعة أيام حتى يجف.
  2. التفاف عينات في صفائح من رقائق الألومنيوم، ووضع هافيأكياس بلاستيكية المسمى، ونقلها إلى المختبر.
  3. تخزين العينات في الثلاجة لمزيد من الاستخدام، بما في ذلك الغسيل، واستخراج الكورتيزول، والتجفيف، وتحليل ELISA(الشكل 2).

3. تحليل الكورتيزول الزفية

  1. معايرة المقياس التحليلي الرقمي (الدقة: 0.0001) وتزن 300 ± 10 عينات ملغ مع ورقة وزنها على عموم مقياس.
  2. اغسل العينات
    1. نقل كل عينة في أنبوب البولي بروبلين مخروطي 15 L. إضافة 3 مل من إيزوبروبانول إلى كل أنبوب باستخدام ماصة قناة واحدة 5000 ميكرولتر.
    2. تدوير الأنابيب في 80 دورة في الدقيقة لمدة 2.5 دقيقة لغسل الكورتيزول وإزالة أي تلوث خارجي محتمل. كرر هذا الإجراء مرتين.
    3. الهواء الجاف العينات غسلها في درجة حرارة الغرفة (22-28 درجة مئوية) لمدة 7 أيام.
    4. كرر إجراء الغسيل باستخدام الماء النقي للغاية كعامل الغسيل.
  3. استخراج عظم الفك من أنسجة الجسم باستخدام ملقط قطع العظام. تطبيق الخطوات 1.5-3.2.4 على عينات عظم الفك.
  4. وزن (75 ± 5 ملغ) عينات الزمن المجفف أو عظم الفك وطحن باستخدام الخافق حبة في 50 هرتز لمدة 32 دقيقة.
    1. تسليم 1.5 مل من الميثانول في كل أنبوب يحتوي على زعانف مسحوق أو عظم الفك باستخدام ماصة 1000 درجة مئوية. ضع العينات على مدورة أنبوب في دوران بطيء (40 دورة في الدقيقة) لمدة 18 ساعة في درجة حرارة الغرفة لاستخراج الكورتيزول مع الخلط المستمر.
  5. بعد استخراج الكورتيزول، الطرد المركزي العينات في 9500 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي، جمع الطبقة العضوية العليا التي تحتوي على الكورتيزول (1 مل) من كل عينة ووضعها في أنبوب منفصل 1.5 مل الطرد المركزي.
    1. تجفيف العينات عن طريق الحضانة في 38 درجة مئوية لتبخر الميثانول. الحفاظ على عينات الكورتيزول المستخرجة تحت غطاء الدخان بين عشية وضحاها للسماح الميثانول لتبديد.
      ملاحظة: الطبقة التي تحتوي على الكورتيزول عادة ما تكون مصفرة في اللون.

4. كشف الكورتيزول الزفية

  1. إذابة عينات الزفين المجفف أو عظم الفك في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 ساعة قبل استخدام مجموعة ELISA.
  2. إضافة 400 درجة مئوية من الفوسفات العازلة، دوامة، والطرد المركزي في 1500 × ز لمدة 15 دقيقة.
  3. قم بتشغيل كل عينة (25 درجة مئوية) مكررة لتحسين دقة وموثوقية الدقة في الدقة. قم بإزالة أية بيانات خارج المنحنى القياسي كالقيم الخارجية.
  4. تعيين قارئ لوحة صغيرة إلى 450 نانومتر، ثم تعيين إلى درجة مئوية dL-1 وقراءة الكثافة البصرية لللوحة.
    1. استخدم برنامج الميكروبليت مع منحنى انحدار غير خطي ذو أربعة معلمات مناسب. تحويل مستويات الكورتيزول من العينات التي تم الحصول عليها من البرنامج إلى pg mg-1 باستخدام المعادلة التالية:
      واو = 000 10 هاء (ألف/باء) (جيم/دال)،
      حيث F = القيمة النهائية لمستوى الكورتيزول الزفية في (pg mg-1)،E = حجم (مل) من المخزن المؤقت اختبار المستخدمة لإعادة تشكيل استخراج المجففة، A = التركيز (μg dL-1)المقدمة من الناتج اختبار، B = الوزن (ملغ) من الزينة التي تخضع لإضافية ction, C = حجم (مل) من الميثانول المضافة إلى الزفون المجففة, و D = حجم (مل) من الميثانول تعافى من استخراج والمجففة في وقت لاحق أسفل3.

5. التحليل الإحصائي

  1. تقسيم كل عينة إلى عينتين فرعيتين قبل إجراء الغسيل ثم تشغيل في تكرار أثناء اختبار مجموعة ELISA (2 × 2 = 4 ملاحظات لكل عينة) لتحسين قوة الاختبار وموثوقية النتائج.
  2. مقارنة تأثيرات المذيبات الغسيل اثنين وتفاعلاتها عن طريق تطبيق إجراء النموذج الخطي العام (GLM) في بيئة البرمجيات SAS لبيانات القياس18.
  3. اختبار الاختلافات بين الوسائل باستخدام اختبار توكي على مستوى أهمية p < 0.05. قبول 0.05 < p < 0.10 كدليل على الميل بدلاً من أن يكون فرقاً كبيراً.

النتائج

وقد تم تطوير تقنية استخراج الكورتيزول الزفية المقدمة وتأكيدها في هذه الدراسة باستخدام ثلاثة أنواع من سمك الحفش. تم مقارنة مستويات الكورتيزول التي تم الحصول عليها باستخدام المياه النقية جدا وisopropanol كما تم مقارنة المذيبات الغسيل(الشكل 2). تم فحص الكورتيزول...

Discussion

ويطلق على سمك الحفش في بعض الأحيان "أحفوري حي" لأنه أظهر القليل من التعديلات على مدى آلاف السنين الماضية. يحتوي جنس سمك الحفش Acipenser على 27 نوعاً تنتج الكافيار. ومع ذلك، ثلاثة أنواع (بيلوجا، بايري، وسيفوروغا) تنتج معظم إمدادات الكافيار العالمية. وسمك الحفش معرض للإفراط في صيد الأسماك وال?...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنها.

Acknowledgements

وقد أُجري هذا العمل بدعم من برنامج البحوث التعاونية لتطوير العلوم والتكنولوجيا في مجال الزراعة (عنوان المشروع: تحليل تغير إنتاجية الماشية مع تغير المناخ، المشروع رقم. PJ012771)، إدارة التنمية الريفية، جمهورية كوريا. كما أن هذه الدراسة كانت مدعومة بمنحة (رقم. PJ01344604) من فريق التغذية الحيوانية وعلم وظائف الأعضاء، المعهد الوطني لعلوم الحيوان، RDA، سيول، جمهورية كوريا. وينوه المؤلفون بامتنان بالمدير التنفيذي لللفتة الفارسية محمد حسن سلمان زاده وفريقه، الذين قدموا أسماكاً من أنواع سمك الحفش الثلاثة التي تم فحصها في هذه الدراسة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Disposal latex surgical glovesAnsell63754090
Platform scale-electronic weighing 100kgBaskoolnikoo101 EM
Serological pipette to deliver up to 24 mLBecton Dickinson Falcon35-7550
Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filtersBioTek8041000
Reagent reservoirsBrandTech703459
Zipper storage plastic bag Cleanwrap30cm x100m
Isopropyl alcoholDaejung chemicals & Metals 5035-4400
Methyl alcoholDaejung chemicals & Metals 5558-4100
Tube rotator- MX-RL-ProDLAB Scientific 824-222217777
Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mLEppendorf Research PlusM21518D
  Precision pipette to deliver 15 and 25 μLEppendorf Research PlusR25623C
Weighing paper (107 x 210 mm)Fisherbrand09-898-12B
Bead beater, 50/60 Hz 2AGeneReach Biotechnology Corptp0088
Plate rotator with orbit capable of 500 rpmHangzhou Miu Instrument MU-E30-1044
Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mLHyundai Micro H20050
Fume hoodKwang Dong IndustrialKD 901-22128175
Micro-centrifuge capable of 1500 x gLabo Gene 9.900.900.729
Mini vortex mixerLMSVTX-3000L 
Lotte aluminum foil roll Lotte AluminumB0722X5FK5
Digital scaleMettler Toledo  ME204
Ultrapure waterMDMMDM-0110
Pipette tipsNeptune ScientificREF 2100.N
Large fish netPond H2OHoz135 
Salivary cortisol kitSalimetrics1-3002-4
Bone cutting forcepsSankyo26-188A
Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μLVITLAB18A68756
TowelYuhan Kimberly1707921546
Tissue paper (107 × 210)Yuhan Kimberly41117

References

  1. Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
  2. Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).
  3. Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
  4. Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).
  5. Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors. Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).
  6. Ghassemi Nejad, J., et al. Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction. Animal. 8, 128-132 (2014).
  7. Brossa, A. C. . Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. , (2018).
  8. Carbajal, A., et al. Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation. Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).
  9. Bertotto, D., et al. Alternative matrices for cortisol measurement in fish. Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).
  10. Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. Embedded dental cortisol content: a pilot study. Endocrinology & Metabolic Syndrome. 5, 240 (2016).
  11. Pankhurst, N. W. The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective. General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).
  12. Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions. Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).
  13. Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife. Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).
  14. Aerts, J., et al. Scales tell a story on the stress history of fish. PLoS One. 10, e0123411 (2015).
  15. Heimbürge, S., Kanitz, E., Otten, W. The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals. General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).
  16. Ghassemi Nejad, J., et al. Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone. Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).
  17. Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).
  18. SAS. 1999. . SAS. User's Guide (Version 8.01 Edition). , (1999).
  19. Barton, B. A. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).
  20. Ghassemi Nejad, J., et al. Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison. Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

151 ELISA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved