철갑상어 지느러미와 턱뼈 매트릭스에서 코티솔 추출

요약

이 연구에서는, 우리는 철갑상어 종의 지느러미와 턱뼈에서 코티솔 추출을 위한 프로토콜을 제시합니다. 지느러미와 턱뼈 코티솔 수준은 ELISA 검소에 선행된 2개의 세척 용매를 비교하여 더 조사되었습니다. 이 연구는 새로운 스트레스 지표로 턱뼈 코티솔의 타당성을 시험.

초록

이 연구의 목적은 두 개의 세척 용매 (물과 이소 프로판올)를 사용하여 철갑상어 지느러미에서 코티솔을 추출하는 기술을 개발하고 세 가지 주요 외과 의사 종 중 지느러미 코티솔 수준의 차이를 정량화하는 것입니다. 지느러미는 벨루가7개(후소후소),시베리아 7개(아시펜서바에리이),세브루가 5개(A.stellatus)등 19척의 희생된 철갑상어에서 수확되었다. 철갑상어는 이란 농장에서 2년(2017-2018년)에 자랐으며, 코티솔 추출 분석은 한국에서(2019년 1월~2월) 실시되었습니다. 5 H. 후소에서 턱뼈는 또한 코티솔 추출에 사용되었다. 데이터는 SAS 환경에서 의 일반 선형 모델(GLM) 프로시저를 사용하여 분석하였다. 변이의 인트라-및 인터-분석 계수는 각각 14.15 및 7.70이었다. 간단히, 코티솔 추출 기술은 용매 (초순수 및 이소프로판올)의 3 mL로 시료 (300 ± 10 mg)를 두 번 세척하고, 80rpm에서 2.5 분 동안 회전하고, 7 일 동안 실온 (22-28 °C)에서 세척 된 샘플을 공기 건조하고, 추가 건조를 포함했습니다. 50 Hz에서 비드 비터를 사용하여 32 분 동안 시료를 분말로 분쇄하고 건조 된 분말 (75 ± 5 mg)에 1.5 mL 메탄올을 적용하고, 연속 혼합으로 실온에서 18 시간 동안 느린 회전 (40 rpm)을 적용합니다. 추출 후, 샘플을 원심분리(10분 동안 9,500 x g)하고, 1 mL 상급제를 새로운 미세원심지 튜브(1.5 mL)로 옮겼고, 메탄올을 증발시키기 위해 38°C에서 배양하고, 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA)을 통해 분석하였다. . 종 사이 핀 코 티 솔 수준에서 또는 세척 용매 사이 지 느 러 미와 턱뼈 코 티 솔 수준에서 차이가 관찰 되었다. 이 연구의 결과는 철갑상어 턱뼈 매트릭스가 단단한 행렬에 유망한 대체 응력 지표이다는 것을 보여줍니다.

서문

코티솔은 동물의 스트레스를 신뢰할 수 있는 지표입니다. 코 티 솔 추출 스트레스 수준에 스트레스 수준 및 일반적인 패턴을 모니터링 하는 연구원에 대 한 유효한 프레임 워크를 제공 합니다. 예를 들어, 이전 연구는 인간^1,2,원숭이^3,4,가축^5,양^6,및 다양한 방법을 사용하여 모발 코티솔 측정의 방법론적 검증을 수행하였다. 금붕어^7,8. 물고기 종에서, 비늘 등 매트릭스에서 코 티 솔 측정, 피부 점액, 대변, 그리고 혈액⁹ 물고기 건강에 대 한 정보를 제공 하기 위해 표시 되었습니다. 혈액 샘플링이 문제가 있거나 비늘이 부족할 때, 코티솔 추출을 위한 대체 매트릭스가 필요합니다. 물고기에서, 대체 행렬은 턱뼈, 인간의 치아와 유사한 단단한 조직을 포함할 수^있다(10).

생선 스트레스 수준을 결정하는 새로운 행렬 및 검증 된 기술의 개발은 외과 의사가 환경 스트레스 요인에 장기간 노출을 경험할 수있는 캐비어 산업에 특히 관심이 있습니다^11. 철갑상어의 성별은 2 세 이전에 결정 될 수 없으며 외과 의사는 비늘이 없습니다. 코티솔은 성장^{단계2, 7,12}동안 고체 행렬에 점차 적으로 축적하기 때문에 지느러미와 턱뼈와 같은 단단한 매트릭스의 장기 코티솔 축적 데이터는 스트레스에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 다른 성장 단계에서 수준. 대조적으로, 혈액 코티솔 수준은 죽음의 시간에 긴장 수준의 스냅 샷을 제공하고 정확하게 장기 양육 조건 동안 스트레스를 나타낼 수 없습니다^13,14. 캐비어 시장에서 경쟁이 치열해짐에 따라 장기 사육 기간(8-12년 이상)동안 철갑상어 종중 건강한 계란 생산을 위한 스트레스 조건을 개선하기 위한 새로운 접근법이 점점 더 중요한 연구 분야입니다. 철갑상어의 높은 비용으로 인해, 수확 된 샘플은 매우 비용이 많이 듭니다 (종과 성장 단계에 따라 성숙한 물고기 당 $ 8,000-15,000), 연구 프로젝트의 제한 요소. 그러나, 철갑상어 지느러미와 턱뼈에서 코티솔 추출을 위한 적절한 기술의 개발은 양식과 소비를 위한 철갑상어 계란의 수확을 향상시키기 위하여 어류 양식 시스템 및 야생 물고기에 둘 다 유용하게 적용될 수 있었습니다 보존.

신뢰할 수있는 결과^6을제공 할뿐만 아니라 적절한 코티솔 추출 기술을 선택하는 것은 시료 준비 중에 매트릭스에 존재하는 다른 화합물이 출력을 혼동하지 않도록하는 것이 매우 중요합니다. 일치하지 않는 결과. 지느러미와 턱뼈 코티솔 수치가 주변 물의 호르몬 수치에 영향을 받는지 여부를 결정하는 것이 똑같이 중요합니다. Heimbürge 외¹⁵ 요인의 숫자는 나이 포함 하 여 코 티 솔 수준에 영향을 미칠 수 있습니다 제안, 성별, 임신, 시즌, 색상^12,그리고 코 티 솔 추출 되는 신체 영역^16. 그러나, 생선 체내에서 코티솔 추출에 대한 용매 세척의 효과에 대한 정보는 거의^없으며,철갑상어 계란^17을제외하고는 철갑상어에서 이러한 효과에 대해서는 전혀 알 수 없다.

철갑상어의 지느러미와 턱뼈에서 기준선 코티솔 수준을 분석하는 것은 물고기를 안락사시켜야 하지만, 이 접근법은 살아있는 외과 의사에서 혈액 샘플링에 필요한 침습적 기술을 수반하지 않습니다. 지느러미 및 턱뼈 샘플은 쉽게 수집되며 이러한 조직에서 추출하면 신속하게 수행 할 수 있습니다. 마찬가지로, 호르몬 추출 및 분석간단 하 고 거의 전문된 장비를 필요로.

이 연구에서는, 우리는 이 행렬에서 측정된 코티솔 수준이 응력으로 안정적으로 사용될 수 있는지 여부를 결정하는 것을 목표로, 물고기 지느러미및 턱뼈에서 코티솔의 추출, 세척 및 측정을 위한 새롭고 쉽게 적용된 기술을 제시합니다. 지표. 이 기술의 장점은 쉽고 비 침습적^{인 8} 접근 법, 적은 데이터 변화 및 신뢰할 수있는 출력^1,6,8,17을포함한다; 이 기술은 철갑상어와 같은 비늘이없는 물고기 종에 적용 할 수 있습니다. 이 기술은 물고기의 도살, 적절한 세척용매의 선택^2,4,샘플^{3, 5,}전문 효소 연결 면역 흡착 분석 (ELISA)의 적절한 연삭을 필요로한다. 응용 프로그램^5,7, 고체 행렬에 코티솔 소스의 통합의 광범위한 지식⁶.

두 개의 다른 세척 용매 (초순수 및 이소 프로판올)를 적용하여 세 가지 철갑상어 종에서 지느러미의 기저 코티솔 수준을 얻었습니다 : 벨루가(후소 후소),시베리아(Acipenser baerii),그리고 세브루가(A. stellatus) ), 각 종에 대한 표준 환경 조건하에서. H. huso의 턱뼈는 또한 외과 의사에 있는 응력 평가하기 위하여 이용되었습니다. 이것은 철갑상어 턱뼈에 있는 코티솔 수준을 측정하는 첫번째 연구 결과입니다. 이 연구의 결과는 초기 성장 단계에서 철갑상어 종에 대한 비교 코티솔 데이터를 제공 할 것입니다 (~ 1 년) 섹스 결정 하기 전에.

프로토콜

다음 실험 절차와 방법은 강원대학교 춘천대학교 동물복지윤리청의 승인을 받았습니다.

1. 핀 컬렉션

1. 그물을 사용하여 철갑상어를 부드럽게 캡처하여 부상과 스트레스를 최소화하십시오.
2. 생선을 깨끗한 물로 조심스럽게 헹구고 안락사 전에 흡수성 수건으로 몸 표면을 닦아냅니다.
3. 물고기가 기절하거나 의식을 잃게되도록 플라스틱 망치를 사용하여 물고기의 머리를 명중. 칼을 사용하여 머리를 제거합니다.
4. 체중(g)과 길이(cm)를 측정합니다.
5. 안락사 후, 멸균 수술 가위를 사용하여 가능한 한 몸에 가깝게 절단하여 지느러미 샘플을 수집합니다.
   참고: 각 생선에 대해 재활용되지 않은 흡수성 수건을 사용해야 합니다. 본 연구에서 사용된 종에 대한 설명 통계는 다음과 같다: 벨루가 철갑상어(H. huso):연령 = 18±2.1 개월, 체중 = 2,700±300 g, 및 체길이 = 55±5 cm; 시베리아철갑상어(A. baerii):나이 = 9.6±2.4개월, 체중 = 1,750±250 g, 및 체길이 = 45±5 cm; 세브루가 철갑상어(A. 스텔라투스):나이 = 14 ± 1.3 개월, 체중 = 1,000 ± 100g, 몸 길이 = 65 ± 5 cm.

2. 코티솔 추출을위한 핀 준비

1. 핀 샘플(티슈당 샘플 1개: ~3g)을 실험실 계량 용지(107mm × 210mm)에 놓고 건조될 때까지 며칠 동안 실온에서 건조시십시오.
2. 샘플을 알루미늄 호일 시트에 싸서 라벨이 부착된 비닐 봉지에 담아 실험실로 옮김을 옮김을 합니다.
3. 세척, 코티솔 추출, 건조 및 ELISA 분석을 포함하여 추가 사용을 위해 냉장고에 샘플을 저장합니다(그림2).

3. 핀 코티솔 분석

1. 디지털 분석 스케일(정확도: 0.0001)을 교정하고 스케일 팬의 계량 용지로 300±10 mg 샘플을 계량합니다.
2. 샘플을 씻으시다.
   1. 각 샘플을 15L 원엽 폴리프로필렌 튜브로 옮김. 5,000 μL 단일 채널 파이펫을 사용하여 각 튜브에 3 mL의 이소프로판올을 추가합니다.
   2. 코티솔을 씻어 내고 잠재적 인 외부 오염을 제거하기 위해 2.5 분 동안 80rpm에서 튜브를 돌십시오. 이 절차를 두 번 반복합니다.
   3. 세척된 시료를 실온(22-28°C)에서 7일 동안 공기 건조시켰다.
   4. 세척제로 초순수를 사용하여 세척 절차를 반복합니다.
3. 뼈 절단 집게를 사용하여 신체 조직에서 턱뼈를 추출합니다. 턱뼈 샘플에 단계 1.5-3.2.4를 적용합니다.
4. 32분 동안 50Hz에서 비드 비터를 사용하여 말린 지느러미 또는 턱뼈 샘플을 계량(75±5 mg)합니다.
   1. 100 μL 파이펫을 사용하여 분말 핀 또는 턱뼈를 함유한 각 튜브에 1.5 mL의 메탄올을 전달합니다. 샘플을 튜브 회전자(40rpm)에서 실온에서 18시간 동안 천천히 회전하여 코티솔을 추출하여 연속 혼합합니다.
5. 코티솔 추출 후, 실온에서 10 분 동안 9,500 x g의 샘플을 원심 분리합니다. 원심 분리 후, 각 샘플에서 코티솔 (1 mL)을 함유 한 상부 유기 층을 수집하고 별도의 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브에 넣습니다.
   1. 메탄올을 증발시키기 위해 38°C에서 인큐베이션하여 시료를 건조시다. 추출된 코티솔 샘플을 하룻밤 동안 연기 후드 아래에 보관하여 메탄올이 소멸되도록 합니다.
      참고 : 코티솔 함유 층은 일반적으로 색상이 황색입니다.

4. 핀 코티솔 검출

1. ELISA 키트를 사용하기 전에 건조된 지느러미 또는 턱뼈 샘플을 실온에서 1.5시간 동안 해동합니다.
2. 15분 동안 1,500 x g에 인산염 완충제, 소용돌이 및 원심분리기를 400 μL 추가합니다.
3. 분석 정확도와 신뢰성을 향상시키기 위해 중복으로 각 샘플 (25 μL)을 실행합니다. 표준 곡선 외부의 데이터를 이상값으로 제거합니다.
4. 마이크로플레이트 리더를 450 nm로 설정한 다음, μg^dL-1로 설정하고 플레이트의 광학 밀도를 판독한다.
   1. 4매개변수 비선형 회귀 곡선 맞춤이 있는 마이크로플레이트 소프트웨어를 사용합니다. 다음 방정식을 사용하여 소프트웨어에서 얻은 샘플의 코티솔 수준을 pg mg^-1로 변환합니다.
      F = 10,000E(A/B) (C/D),
      여기서 F=핀 코티솔 수준의 최종 값(pg^mg-1),E=건조 추출물을 재구성하는 데 사용되는 분석 버퍼의 부피(mL), A=분석 출력에 의해 제공되는 농도(μg^dL-1),B=추가 를 실시한 핀의 중량(mg)을 ction, C =분말 핀에 첨가된 메탄올의 부피(mL)를, D=메탄올의 부피(mL)를 추출물로부터 회수한 후^{이어서 건조시켰다 3.}

5.통계분석

1. 세척 절차 전에 각 샘플을 두 개의 하위 샘플로 나눈 다음 ELISA 키트 분석(샘플당 2 × 2 = 4 관측값) 동안 중복으로 실행하여 테스트의 힘과 결과의 신뢰성을 향상시킵니다.
2. SAS 소프트웨어 환경에서 일반 선형 모델(GLM) 절차를 측정^{데이터(18)에}적용하여 두 세척 용매와 이들의 상호작용의 효과를 비교한다.
3. p & 0.05의 유의 수준에서 Tukey의 테스트를 사용하는 수단 간의 테스트 차이. 0.05

결과

제시된 지느러미 코티솔 추출 기술은 3개의 철갑상어 종을 사용하여 이 연구에서 개발되고 확인되었습니다. 세척 용매로서 초순수 및 이소프로판올을 사용하여 얻은 코티솔 수준을 비교하였다(도2). H. huso 턱뼈에서 코티솔은 철갑상어 턱뼈가 지느러미에 대한 대체 매트릭스로 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 검사되었습니다. 세척 용?...

토론

철갑상어는 지난 천년 동안 몇 가지 적응을 전시했기 때문에 때때로 "살아있는 화석"이라고합니다. 철갑상어 속 Acipenser는 캐비어를 생산하는 27 종을 포함; 그러나, 세 종 (벨루가, baerii, 세브루가) 글로벌 캐비어 공급의 대부분을 생산하고 있습니다. 철갑상어는 자연 서식지에서 의 외낚시와 간섭에 취약하기 때문에 다른 어떤 종보다도 더 심각한 멸종 위기에 처해 있습니다. 철갑상어는 1억...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposal latex surgical gloves	Ansell	63754090
Platform scale-electronic weighing 100kg	Baskoolnikoo	101 EM
Serological pipette to deliver up to 24 mL	Becton Dickinson Falcon	35-7550
Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters	BioTek	8041000
Reagent reservoirs	BrandTech	703459
Zipper storage plastic bag	Cleanwrap	30cm x100m
Isopropyl alcohol	Daejung chemicals & Metals	5035-4400
Methyl alcohol	Daejung chemicals & Metals	5558-4100
Tube rotator- MX-RL-Pro	DLAB Scientific	824-222217777
Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL	Eppendorf Research Plus	M21518D
Precision pipette to deliver 15 and 25 μL	Eppendorf Research Plus	R25623C
Weighing paper (107 x 210 mm)	Fisherbrand	09-898-12B
Bead beater, 50/60 Hz 2A	GeneReach Biotechnology Corp	tp0088
Plate rotator with orbit capable of 500 rpm	Hangzhou Miu Instrument	MU-E30-1044
Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL	Hyundai Micro	H20050
Fume hood	Kwang Dong Industrial	KD 901-22128175
Micro-centrifuge capable of 1500 x g	Labo Gene	9.900.900.729
Mini vortex mixer	LMS	VTX-3000L
Lotte aluminum foil roll	Lotte Aluminum	B0722X5FK5
Digital scale	Mettler Toledo	ME204
Ultrapure water	MDM	MDM-0110
Pipette tips	Neptune Scientific	REF 2100.N
Large fish net	Pond H2O	Hoz135
Salivary cortisol kit	Salimetrics	1-3002-4
Bone cutting forceps	Sankyo	26-188A
Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL	VITLAB	18A68756
Towel	Yuhan Kimberly	1707921546
Tissue paper (107 × 210)	Yuhan Kimberly	41117