Cortisol-Extraktion aus Störflossen und Kieferknochenmatrizen

Zusammenfassung

In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur Cortisolextraktion aus der Flosse und dem Kieferknochen von Störarten vor. Der Fin- und Kieferknochen-Cortisolspiegel wurde weiter untersucht, indem zwei Waschlösungsmittel mit anschließenden ELISA-Assays verglichen wurden. Diese Studie untersuchte die Durchführbarkeit von Kieferknochen-Cortisol als neuartigen Stressindikator.

Zusammenfassung

Ziel dieser Studie war es, eine Technik zur Extraktion von Cortisol aus Störflossen unter Verwendung von zwei Waschlösungsmitteln (Wasser und Isopropanol) zu entwickeln und unterschiede in den Fin-Cortisol-Spiegeln zwischen drei Hauptstörarten zu quantifizieren. Die Flossen wurden von 19 geopferten Stören geerntet, darunter sieben Beluga (Huso huso), sieben Sibirien (Acipenser baerii) und fünf sevruga (A. stellatus). Die Störe wurden in iranischen Farmen für 2 Jahre (2017-2018) aufgezogen, und Cortisol-Extraktionsanalyse wurde in Südkorea durchgeführt (Januar-Februar 2019). Kieferknochen aus fünf H. huso wurden auch zur Cortisolextraktion verwendet. Die Daten wurden mit dem allgemeinen linearen Modellverfahren (GLM) in der SAS-Umgebung analysiert. Die Intra- und Inter-Assay-Variationskoeffizienten betrugen 14,15 bzw. 7,70. Kurz gesagt, die Cortisol-Extraktionstechnik beinhaltete das Waschen der Proben (300 x 10 mg) mit 3 ml Lösungsmittel (Ultrarinduzess und Isopropanol) zweimal, Rotation bei 80 Umdrehungen für 2,5 min, Lufttrocknung der gewaschenen Proben bei Raumtemperatur (22-28 °C) für 7 Tage, weitere Trocknung die Proben mit einem Perlenschlag bei 50 Hz für 32 min und Schleifen sie in Pulver, auftragen 1,5 ml Methanol auf das getrocknete Pulver (75 x 5 mg), und langsame Rotation (40 Rpm) für 18 h bei Raumtemperatur mit kontinuierlichem Mischen. Nach der Extraktion wurden probenweise zentrifugiert (9.500 x g für 10 min), und 1 ml Überstand wurde in ein neues Mikrozentrifugenrohr (1,5 ml) übertragen, bei 38 °C inkubiert, um das Methanol zu verdampfen, und mittels enzymgebundenem Immunsorben-Assay (ELISA) analysiert. . Es wurden keine Unterschiede im Fin-Cortisol-Spiegel zwischen den Arten oder in den Fin- und Kieferknochen-Cortisolspiegeln zwischen Waschlösungsmitteln beobachtet. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Stör-Kieferknochenmatrix ein vielversprechender alternativer Spannungsindikator für feste Matrizen ist.

Einleitung

Cortisol ist ein zuverlässiger Indikator für tierischen Stress. Cortisol-Extraktion bietet einen gültigen Rahmen für Forscher, um Stressniveaus und allgemeine Muster in Stressoren zu überwachen. Zum Beispiel haben frühere Studien methodische Validierung von Haarcortisol-Messungen mit verschiedenen Methoden beim Menschen^{durchgeführt 1,2}, Affen^3,4, Rinder⁵, Schafe⁶, und Goldfisch^7,8. Bei Fischarten haben Cortisolmessungen in Matrizen wie Schuppen, Hautschleim, Kot und Blut⁹ gezeigt, dass sie Informationen über die Gesundheit von Fischen liefern. Wenn die Blutentnahme problematisch ist oder Schuppen fehlen, sind alternative Matrizen für die Cortisolextraktion erforderlich. Bei Fischen können alternative Matrizen den Kieferknochen enthalten, ein hartes Gewebe ähnlich dem menschlichen Zahn¹⁰.

Die Entwicklung neuer Matrizen und validierter Techniken zur Bestimmung des Fischstressniveaus ist für die Kaviarindustrie von besonderem Interesse, wo Störe eine längere Exposition gegenüber Umweltstressfaktoren erfahren können¹¹. Das Geschlecht von Stören kann nicht vor 2 Jahren bestimmt werden, und Stör haben keine Schuppen. Da sich Cortisol während der Wachstumsphase nach und nach in festen Matrizen ansammelt, könnten^7,12, Langzeit-Cortisolakkumulationsdaten von harten Matrizen wie Flossen und Kieferknochen Einen Einblick in Stress geben in verschiedenen Wachstumsstadien. Im Gegensatz dazu bieten die Cortisolspiegel im Blut eine Momentaufnahme des Stressniveaus zum Zeitpunkt des Todes und können Stress während der Langzeitpflege bedingungen nicht genau darstellen^13,14. Angesichts des zunehmenden Wettbewerbs auf dem Kaviarmarkt sind neue Ansätze zur Verbesserung der Stressbedingungen für die Produktion gesünderer Eier bei Störarten während der Langzeitaufzucht (8-12 Jahre oder länger) ein immer wichtigerer Forschungsbereich. Aufgrund der hohen Kosten für Störe sind geerntete Proben extrem kostspielig (8.000-15.000 DOLLAR pro ausgereiftem Fisch je nach Art und Wachstumsstadium), ein begrenzender Faktor für Forschungsprojekte. Die Entwicklung einer geeigneten Technik zur Cortisolextraktion aus Störflossen und Kieferknochen könnte jedoch sowohl auf Fischzuchtsysteme als auch auf Wildfische sinnvoll angewandt werden, um die Qualität und Ernte von Störeiern sowohl für den Verzehr als auch für die erhaltung.

Neben der Bereitstellung zuverlässiger Ergebnisse⁶ist die Auswahl einer geeigneten Cortisolextraktionstechnik von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, dass andere Verbindungen, die in der Matrix während der Probenvorbereitung vorhanden sind, den Output nicht verwirren, was zu inkonsistente Ergebnisse. Ebenso wichtig ist es zu bestimmen, ob der Gehalt an Flossen- und Kieferknochen-Cortisol durch Hormonspiegel im umgebenden Wasser beeinflusst wird. Heimbürge et al.¹⁵ schlugen vor, dass eine Reihe von Faktoren Cortisolspiegel beeinflussen können, einschließlich Alter, Geschlecht, Schwangerschaft, Jahreszeit, Farbe¹²und Körperregion, aus der Cortisol extrahiert wird¹⁶. Es liegen jedoch nur wenige Informationen über die Auswirkungen des Waschens von Lösungsmitteln auf die Cortisolextraktion in Fischkörpermatrizen^{8 vor,}und keine über diese Effekte bei Stören, mit Ausnahme von Störeiern¹⁷.

Obwohl die Analyse der Cortisolspiegel der Basisvon Fischen und Kieferknochen von Stören erfordert, dass die Fische eingeschläfert werden, beinhaltet dieser Ansatz nicht die invasiven Techniken, die für die Blutentnahme bei lebenden Stören erforderlich sind. Flossen- und Kieferknochenproben lassen sich leicht sammeln, und die Extraktion aus diesen Geweben kann schnell durchgeführt werden. In ähnlicher Weise, Hormonextraktion und Analyse sind einfach und erfordern wenig spezielle Ausrüstung.

In dieser Studie stellen wir eine neue und leicht anzuwendende Technik zur Extraktion, Zumwaschung und Bestimmung von Cortisol aus Fischflossen und Kieferknochen vor, mit dem Ziel, zu bestimmen, ob cortisolspiegel, die aus diesen Matrizen gemessen werden, zuverlässig als Spannung verwendet werden können. Indikatoren. Die Vorteile dieser Technik sind ein einfacher und nicht-invasiver^8-Ansatz, weniger Datenvariation und zuverlässige Ausgabe^1,6,8,17; die Technik ist auf Fischarten ohne Schuppen wie Stör anwendbar. Die Technik erfordert die Schlachtung der Fische, Auswahl der geeigneten Waschlösungsmittel^2,4, richtiges Schleifen der Proben^3,5, professionelle enzymgebundene Immunosorbent Assay (ELISA) Anwendung^5,7, und umfangreiche Kenntnisse der Einbeziehung von Cortisolquellen in feste Matrizen⁶.

Wir haben zwei verschiedene Waschlösungsmittel (Ultrarinrwasser und Isopropanol) angewendet, um Basalcortisolspiegel in Flossen von drei Störarten zu erhalten: beluga (Huso huso), Siberian (Acipenser baerii) und sevruga (A. stellatus ), unter den üblichen Umweltbedingungen für jede Art. Kieferknochen von H. huso wurden auch verwendet, um Stress in Stören zu bewerten. Dies ist die erste Studie, die Cortisolspiegel in Störkieferknochen misst. Die Ergebnisse dieser Studie werden vergleichende Cortisoldaten für Störarten im frühen Wachstumsstadium (1 Jahr) vor der Geschlechtsbestimmung liefern.

Protokoll

Die folgenden experimentellen Verfahren und Methoden wurden von der Animal Welfare and Ethics Authority der Kangwon National University, Chuncheon, Republik Korea, genehmigt.

1. Flossensammlung

1. Erfassen Sie den Stör sanft mit einem Netz, um Verletzungen und Stress zu minimieren.
2. Spülen Sie den Fisch vorsichtig mit frischem Wasser und wischen Sie dann die Körperoberfläche mit einem saugfähigen Handtuch vor der Euthanasie ab.
3. Schlagen Sie den Kopf des Fisches mit einem Plastikhammer so, dass der Fisch betäubt wird oder das Bewusstsein verliert. Entfernen Sie den Kopf mit einem Messer.
4. Messen Sie das Körpergewicht (g) und die Länge (cm).
5. Nach der Euthanasie sammeln Sie Flossenproben, indem Sie mit einer sterilisierten chirurgischen Schere so nah wie möglich am Körper schneiden.
   HINWEIS: Für jeden Fisch müssen individuelle, nicht recycelte saugfähige Handtücher verwendet werden. Die beschreibenden Statistiken für die in dieser Studie verwendeten Arten waren wie folgt: Beluga-Stör (H. huso): Alter = 18 x 2,1 Monate, Körpergewicht = 2.700 x 300 g und Körperlänge = 55 x 5 cm; Sibirischer Stör (A. baerii): Alter = 9,6 x 2,4 Monate, Körpergewicht = 1.750 x 250 g und Körperlänge = 45 x 5 cm; sevruga stör (A. stellatus): Alter = 14 x 1,3 Monate, Körpergewicht = 1.000 x 100 g, und Körperlänge = 65 x 5 cm.

2. Flossenpräparat zur Cortisolextraktion

1. Legen Sie die Flossenproben (eine Probe pro Gewebe: 3 g) auf Laborwägepapier (107 mm x 210 mm) und trocknen Sie sie bei Raumtemperatur für einige Tage bis zum Trocknen.
2. Proben in Aluminiumfolienfolien wickeln, in beschriftete Plastiktüten legen und ins Labor bringen.
3. Proben im Kühlschrank für die weitere Verwendung aufbewahren, einschließlich Waschen, Cortisolextraktion, Trocknung und ELISA-Analyse (Abbildung 2).

3. Fin Cortisol-Analyse

1. Kalibrieren Sie die digitale Analyseskala (Genauigkeit: 0,0001) und wiegen Sie 300 x 10 mg Proben mit Wägepapier auf der Waage.
2. Waschen Sie die Proben.
   1. Jede Probe in ein 15 L konisches Polypropylenrohr geben. Fügen Sie 3 ml Isopropanol zu jedem Rohr mit einer 5.000 l Einkanalpipette hinzu.
   2. Drehen Sie die Rohre bei 80 U/min für 2,5 min, um Cortisol auszuwaschen und mögliche äußere Verunreinigungen zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal.
   3. Die gewaschenen Proben 7 Tage lang bei Raumtemperatur (22-28 °C) lufttrocknen.
   4. Wiederholen Sie den Waschvorgang mit Reinstwasser als Waschmittel.
3. Extrahieren Sie den Kieferknochen aus dem Körpergewebe mit Knochenschneiden Zangen. Tragen Sie die Schritte 1.5-3.2.4 auf die Kieferknochenproben auf.
4. Abwägen (75 x 5 mg) getrocknete Flossen- oder Kieferknochenproben und 32 min mit einem Perlenschlag bei 50 Hz mahlen.
   1. 1,5 ml Methanol in jedes Rohr mit Pulverflossen- oder Kieferknochen mit einer 1000-L-Pipette liefern. Legen Sie die Proben bei langsamer Drehung (40 U/min) 18 h bei Raumtemperatur auf einen Rohrrotator, um Cortisol mit kontinuierlicher Durchmischung zu extrahieren.
5. Zentrifugieren Sie die Proben nach Cortisolextraktion bei 9.500 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation die obere organische Schicht, die Cortisol (1 ml) enthält, aus jeder Probe zu sammeln und in ein separates 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr zu geben.
   1. Trocknen Sie die Proben durch Inkubation bei 38 °C, um das Methanol zu verdampfen. Bewahren Sie die extrahierten Cortisolproben über Nacht unter einer Dunstabzugshaube auf, damit methanol ableiten kann.
      HINWEIS: Die Cortisol-haltige Schicht ist in der Regel gelblich gefärbt.

4. Fin Cortisol-Erkennung

1. Die getrockneten Flossen- oder Kieferknochenproben bei Raumtemperatur 1,5 h auftauen, bevor Sie das ELISA-Kit verwenden.
2. Fügen Sie 400 l Phosphatpuffer, Wirbel und Zentrifuge bei 1.500 x g für 15 min hinzu.
3. Führen Sie jede Probe (25 l) in zwei Duplikaten aus, um die Assay-Genauigkeit und -Zuverlässigkeit zu verbessern. Entfernen Sie alle Daten außerhalb der Standardkurve als Ausreißer.
4. Stellen Sie einen Mikroplattenleser auf 450 nm ein, dann auf g dL^-1 und lesen Sie die optische Dichte der Platte.
   1. Verwenden Sie die Mikroplattensoftware mit einer nichtlinearen Regressionskurve mit vier Parametern. Konvertieren Sie die Cortisolspiegel der aus der Software erhaltenen Proben in pg mg^-1 mit der folgenden Gleichung:
      F = 10.000E (A/B) (C/D),
      wobei F = der Endwert des Flossencortisolspiegels in (pg mg^-1), E = das Volumen (ml) des Assaypuffers, der zur Rekonstituierung des getrockneten Extrakts verwendet wird, A = die Durchdiendurchlage der Assay-Leistung , B = das Gewicht (mg) der Flosse, die extra Ction, C = das Volumen (ml) von Methanol, das der Pulverflosse zugesetzt wird, und D = das Volumen (ml) von Methanol, das aus dem Extrakt gewonnen und anschließend ausgetrocknet³.

5.Statistische Analyse

1. Teilen Sie jede Probe vor dem Waschvorgang in zwei Unterproben auf und werden Sie dann während des ELISA-Kit-Tests doppelt ausgeführt (2 x 2 = 4 Beobachtungen pro Probe), um die Leistung des Tests und die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu verbessern.
2. Vergleichen Sie die Auswirkungen der beiden Waschlösungsmittel und ihre Wechselwirkungen, indem Sie das allgemeine lineare Modellverfahren (GLM) in der SAS-Softwareumgebung auf die Messdaten¹⁸anwenden.
3. Testunterschiede zwischen Denbeinen mit Tukeys Test auf einem Signifikanzniveau von p < 0,05. Akzeptieren Sie 0,05 < p < 0,10 als Beweis für eine Tendenz und nicht als signifikanten Unterschied.

Ergebnisse

Die vorgestellte Fin Cortisol-Extraktionstechnik wurde in dieser Studie unter Verwendung von drei Störarten entwickelt und bestätigt. Die Cortisolspiegel, die mit Reinstwasser und Isopropanol als Waschlösungsmittel gewonnen wurden, wurden verglichen (Abbildung 2). Cortisol aus H. huso Kieferknochen wurde untersucht, um festzustellen, ob Störkieferknochen als alternative Matrix zu Flossen verwendet werden könnten. Die Auswirkungen des Waschens vo...

Diskussion

Stör wird manchmal als "lebendes Fossil" bezeichnet, weil es in den vergangenen Jahrtausenden nur wenige Anpassungen gezeigt hat. Die Störgattung Acipenser enthält 27 Arten, die Kaviar produzieren; jedoch produzieren drei Arten (Beluga, Baerii und Sevruga) den größten Teil des weltweiten Kaviarangebots. Störe sind anfällig für Überfischung und Einmischung in ihren natürlichen Lebensraum und sind daher stärker gefährdet als jede andere Artengruppe. Störe gehören zur ältesten Gruppe lebender Wirbelt...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposal latex surgical gloves	Ansell	63754090
Platform scale-electronic weighing 100kg	Baskoolnikoo	101 EM
Serological pipette to deliver up to 24 mL	Becton Dickinson Falcon	35-7550
Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters	BioTek	8041000
Reagent reservoirs	BrandTech	703459
Zipper storage plastic bag	Cleanwrap	30cm x100m
Isopropyl alcohol	Daejung chemicals & Metals	5035-4400
Methyl alcohol	Daejung chemicals & Metals	5558-4100
Tube rotator- MX-RL-Pro	DLAB Scientific	824-222217777
Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL	Eppendorf Research Plus	M21518D
Precision pipette to deliver 15 and 25 μL	Eppendorf Research Plus	R25623C
Weighing paper (107 x 210 mm)	Fisherbrand	09-898-12B
Bead beater, 50/60 Hz 2A	GeneReach Biotechnology Corp	tp0088
Plate rotator with orbit capable of 500 rpm	Hangzhou Miu Instrument	MU-E30-1044
Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL	Hyundai Micro	H20050
Fume hood	Kwang Dong Industrial	KD 901-22128175
Micro-centrifuge capable of 1500 x g	Labo Gene	9.900.900.729
Mini vortex mixer	LMS	VTX-3000L
Lotte aluminum foil roll	Lotte Aluminum	B0722X5FK5
Digital scale	Mettler Toledo	ME204
Ultrapure water	MDM	MDM-0110
Pipette tips	Neptune Scientific	REF 2100.N
Large fish net	Pond H2O	Hoz135
Salivary cortisol kit	Salimetrics	1-3002-4
Bone cutting forceps	Sankyo	26-188A
Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL	VITLAB	18A68756
Towel	Yuhan Kimberly	1707921546
Tissue paper (107 × 210)	Yuhan Kimberly	41117