Извлечение кортизола из осетровых плавников и челюстных матрис

Резюме

В этом исследовании мы представляем протокол для извлечения кортизола из плавника и челюстной кости видов осетровых. Уровни фин и кортизола челюстной кости были дополнительно изучены путем сравнения двух стиральных растворителей, за которыми следуют анализы ELISA. Это исследование пилотировало осуществимость кортизола челюсти в качестве нового индикатора стресса.

Аннотация

Целью данного исследования было разработать методику извлечения кортизола из осетровых плавников с использованием двух стиральных растворителей (вода и изопропанол) и количественно определить любые различия в уровнях фин кортизола между тремя основными видами осетровых. Фины были собраны из 19 жертвенных осетровых, включая семь белуги(Huso huso),семь сибирских (Acipenser baerii), и пять севруга (A. stellatus). Осетровые были выращены на иранских фермах в течение 2 лет (2017-2018 гг.), а анализ добычи кортизола проводился в Корее (январь-февраль 2019 года). Челюсти из пяти H. huso также использовались для извлечения кортизола. Данные анализировались с помощью общей процедуры линейной модели (GLM) в среде SAS. Коэффициенты вариации внутри- и меж-асса составили соответственно 14,15 и 7,70. Короче говоря, метод извлечения кортизола включал мытье образцов (300 и 10 мг) с 3 мл растворителя (ультрачистая вода и изопропанол) дважды, вращение при 80 об/мин в течение 2,5 мин, высыхание промытых образцов при комнатной температуре (22-28 градусов по Цельсию) в течение 7 дней, дальнейшую сушку образцы с использованием бисера бисера на 50 Гц в течение 32 минут и измельчения их в порошок, применяя 1,5 мл метанола к сушеным порошка (75 х 5 мг), и медленное вращение (40 об/мин) в течение 18 н.ч. при комнатной температуре с непрерывным смешиванием. После извлечения, образцы были центрифугированы (9500 х г в течение 10 мин), и 1 мл супернатанта был перенесен в новую микроцентрифугую трубку (1,5 мл), инкубировали при 38 градусах Цельсия, чтобы испарить метанол, и проанализированы с помощью фермента связанных иммуносорбент анализа (ELISA) . Никаких различий в уровнях кортизола фина среди видов или в плавники и челюстной кости кортизола уровнях между мытья растворителей. Результаты этого исследования показывают, что матрица челюстной кости осетровых является перспективным альтернативным индикатором стресса для твердых матриц.

Введение

Кортизол является надежным индикатором стресса животных. Извлечение кортизола обеспечивает действительную основу для исследователей для мониторинга уровней стресса и общих закономерностей в стрессорах. Например, предыдущие исследования провели методологическую проверку измерений кортизола волос с использованием различных методов у людей^1,2, обезьян^{ы 3,4,}крупного рогатого скота^5,овец^6,и золотая рыбка^7,8. В видах рыб, кортизол измерения в матрицах, таких как весы, слизь кожи, кала, и кровь⁹ было показано, чтобы обеспечить информацию о здоровье рыбы. Когда отбор проб крови является проблематичным или весы отсутствуют, альтернативные матрицы для извлечения кортизола необходимы. В рыбе, альтернативные матрицы могут включать челюстную кость, твердую ткань, похожую на человеческий зуб¹⁰.

Разработка новых матриц и проверенных методов определения уровня стресса рыбы представляет особый интерес для икры промышленности, где осетр может испытывать длительное воздействие факторов экологического стресса¹¹. Пол осетровых не может быть определен до 2 лет, а у осетровых нет чешуи. Потому что кортизол постепенно накапливается в твердых матриц во время стадии роста^2,7,12, долгосрочные данные накопления кортизола из твердых матриц, таких как плавники и челюстные кости могут обеспечить понимание стресса на разных стадиях роста. В отличие от этого, уровни кортизола в крови обеспечивают снимок уровня стресса во время смерти и не может точно представлять стресс во время длительных условий воспитания^13,14. С ростом конкуренции на рынке икры все более важной областью исследований становятся новые подходы к улучшению стрессовых условий для производства более здоровых яиц среди видов осетровых при длительном выращивании (8-12 лет и более лет). Из-за высокой стоимости осетровых, собранные образцы являются чрезвычайно дорогостоящими ($ 8000-15000 за взрослую рыбу в зависимости от видов и стадии роста), ограничивающим фактором для научно-исследовательских проектов. Однако разработка соответствующего метода извлечения кортизола из осетровых плавников и челюстных костей может быть с пользой применена как к системам рыбоводства, так и к дикой рыбе для улучшения качества и сбора осетровых яиц как для потребления, так и для потребления Сохранения.

Помимо предоставления надежных результатов⁶, выбор соответствующего метода извлечения кортизола имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы другие соединения, присутствующие в матрице во время подготовки образца, не смужают выход, что может привести к противоречивые результаты. Не менее важно определить, влияют ли уровень плавника и кортизола челюстной кости уровень гормонов в окружающей воде. Хаймбюрге и др.¹⁵ предположили, что ряд факторов может повлиять на уровень кортизола, включая возраст, пол, беременность, сезон, цвет¹², и область тела, из которой кортизол извлекается¹⁶. Тем не менее, мало информации имеется о влиянии стирки растворителей на добычу кортизола в матрицах тела рыб⁸, и ни на эти эффекты у осетровых, за исключением осетровых яиц¹⁷.

Хотя анализ базовых уровней кортизола из плавников и челюстных костей осетровых требует, чтобы рыба была усыплена, этот подход не влечет за собой инвазивных методов, необходимых для взятия проб крови у живого осетра. Образцы фин и челюстной кости легко собираются, и извлечение из этих тканей может быть выполнено быстро. Аналогичным образом, экстракция гормонов и анализ являются простыми и требуют мало специализированного оборудования.

В этом исследовании мы представляем новую и легко применяемую технику для извлечения, мытья и определения кортизола из рыбных плавников и челюстных костей, с целью определения того, могут ли уровни кортизола, измеренные из этих матриц, надежно использоваться в качестве стресса Показатели. Преимущества этого метода включают простой и неинвазивный подход^8, меньше вариации данных, и надежный выход^1,6,8,17; этот метод применим к видам рыб без чешуи, такой как осетр. Техника требует забоя рыбы, выбора соответствующих растворителей для мытья^2,4,правильной шлифовки образцов^3,5,профессионального ферментосвязанного иммуносорбента (ELISA) применение^5,7, и обширные знания о включении источников кортизола в твердые матрицы⁶.

Мы применили два различных растворителя стирки (ультрачистая вода и изопропанол) для получения базального кортизола в плавниках от трех видов осетровых: белуги (Huso huso), Сибирский (Acipenser baerii), и sevruga (A. stellatus ), в стандартных условиях окружающей среды для каждого вида. Челюсти H. huso также использовались для оценки стресса у осетровых. Это первое исследование для измерения уровня кортизола в осетровых челюстных костях. Результаты этого исследования позволят предоставить сравнительные данные кортизола для видов осетровых на ранней стадии роста (1 год) до определения пола.

протокол

Следующие экспериментальные процедуры и методы были одобрены Управлением по защите и этике животных Национального университета Канвондо, Чунчхон, Республика Корея.

1. Фин коллекция

1. Захват осетровых осторожно с помощью сети, чтобы свести к минимуму травмы и стресс.
2. Тщательно промыть рыбу пресной водой, а затем протрите поверхность тела абсорбирующим полотенцем перед эвтаназии.
3. Ударить по голове рыбы с помощью пластикового молотка так, чтобы рыба была ошеломлена или потеряла сознание. Снимите голову ножом.
4. Измерьте массу тела (г) и длину (см).
5. После эвтаназии соберите образцы плавника, разрезая как можно ближе к телу с помощью стерилизованных хирургических ножниц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Индивидуальные, не переработанные абсорбирующими полотенцами должны быть использованы для каждой рыбы. Описательная статистика по видам, использованным в данном исследовании, была следующей: белуга осетр (H. huso): возраст No 18 и 2,1 месяца, масса тела - 2700 и 300 г, а длина тела - 55 и 5 см; Сибирский осетр(A. baerii): возраст 9,6 и 2,4 месяца, масса тела - 1750 и 250 г, а длина тела - 45 и 5 см; севруга осетр(A. stellatus): возраст No 14 и 1,3 месяца, вес тела - 1000 и 100 г, а длина тела - 65 и 5 см.

2. Подготовка финдля извлечения кортизола

1. Поместите образцы плавника (один образец на ткань: 3 г) на лабораторную бумагу для взвешивания (107 мм и 210 мм) и высушите при комнатной температуре в течение нескольких дней до высыхания.
2. Оберните образцы в листы алюминиевой фольги, поместите в маркированные полиэтиленовые пакеты и перенесите в лабораторию.
3. Храните образцы в холодильнике для дальнейшего использования, включая мойку, извлечение кортизола, сушку и анализ ELISA(рисунок 2).

3. Анализ фин кортизола

1. Откалибровать цифровую аналитическую шкалу (точность: 0.0001) и взвесить 300 и 10 мг образцов с вешной бумагой на сковороде шкалы.
2. Вымойте образцы.
   1. Перенесите каждый образец в 15 л конической полипропиленовой трубки. Добавьте 3 мл изопропанола к каждой трубке, используя одноканальный пипетку мощностью 5000 л.
   2. Поверните трубки при 80 об/мин в течение 2,5 мин, чтобы промыть кортизол и удалить любое потенциальное внешнее загрязнение. Повторите эту процедуру дважды.
   3. Воздушно-сухие промытые образцы при комнатной температуре (22-28 градусов по Цельсию) в течение 7 дней.
   4. Повторите процедуру мытья, используя ультрачистую воду в качестве стирального средства.
3. Извлеките челюстную кость из ткани тела с помощью костяных щипцы. Нанесите шаги 1.5-3.2.4 на образцы челюстной кости.
4. Взвесьте (75 х 5 мг) сушеные образцы плавника или челюстной кости и измельчите с помощью бисера на 50 Гц в течение 32 мин.
   1. Доставьте 1,5 мл метанола в каждую трубку, содержащую порошковый плавник или челюстную кость с помощью 1000-й пипетки. Поместите образцы на трубчатый ротатор при медленном вращении (40 об/мин) в течение 18 ч при комнатной температуре для извлечения кортизола с непрерывным смешиванием.
5. После извлечения кортизола, центрифуга образцов на 9500 х г в течение 10 минут при комнатной температуре. После центрифугации соберите верхний органический слой, содержащий кортизол (1 мл) из каждого образца и поместите его в отдельную микроцентрифугную трубку размером 1,5 мл.
   1. Высушите образцы инкубации при 38 градусах Цельсия, чтобы испарять метанол. Держите извлеченные образцы кортизола под дымом капот на ночь, чтобы метанол рассеяться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кортизол-содержащий слой, как правило, желтоватого цвета.

4. Обнаружение фин кортизола

1. Отморозка сушеных плавников или образцов челюстной кости при комнатной температуре 1,5 ч до использования комплекта ELISA.
2. Добавьте 400 л фосфатного буфера, вихря и центрифуги при 1500 х г в течение 15 мин.
3. Запустите каждый образец (25 л) в дублировать, чтобы улучшить точность и надежность анализов. Удалите любые данные за пределами стандартной кривой в качестве выбросов.
4. Установите микроплитустого считывателя до 450 нм, затем установите мкг dL^-1 и прочитайте оптическую плотность пластины.
   1. Используйте программное обеспечение микроплиты с четырехпарал-нелинейной кривой регрессии. Преобразуйте уровни кортизола в образцах, полученных из программного обеспечения, в pg mg^-1 с помощью следующего уравнения:
      F 10,000E (A/B) (C/D),
      где F - окончательное значение уровня кортизола плавника в (pg mg^-1), E - объем (мл) буфера асссе, используемого для воссоздания высушенного экстракта, А - концентрация (мкг dL^-1),предусмотренная выходом асссе, B - вес (мг) плавника, подвергаемый дополнительному стека, C - объем (мл) метанола, добавленного в порошковый плавник, и D - объем (мЛ) метанола, извлеченного из экстракта и впоследствии высохшего³.

5.Статистический анализ

1. Разделите каждый образец на два подобразца до процедуры стирки, а затем запустите дубликат во время анализа комплекта ELISA (2 - 2 и 4 наблюдения за образцом) для повышения мощности теста и надежности результатов.
2. Сравните эффекты двух стиральных растворителей и их взаимодействия, применяя общую линейную модель (GLM) процедуру в среде программного обеспечения SAS к данным измерений¹⁸.
3. Различия в тестах между средствами, использующими тест Tukey, на уровне значимости p qlt; 0.05. Примите 0,05 зл/ р/с; 0,10 как свидетельство тенденции, а не как существенную разницу.

Результаты

Представленная методика извлечения кортизола была разработана и подтверждена в данном исследовании с использованием трех видов осетровых. Уровни кортизола, полученные с помощью ультрачистой воды и изопропанола, как стиральные растворители были сопоставлены

Обсуждение

Осетр иногда называют "живой ископаемого", потому что он показал несколько адаптаций на протяжении последних тысячелетий. Осетровый род Acipenser содержит 27 видов, которые производят икру; однако, три вида (белуга, баэрии и севруга) производят большую часть мирового предложения икры. Ос...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposal latex surgical gloves	Ansell	63754090
Platform scale-electronic weighing 100kg	Baskoolnikoo	101 EM
Serological pipette to deliver up to 24 mL	Becton Dickinson Falcon	35-7550
Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters	BioTek	8041000
Reagent reservoirs	BrandTech	703459
Zipper storage plastic bag	Cleanwrap	30cm x100m
Isopropyl alcohol	Daejung chemicals & Metals	5035-4400
Methyl alcohol	Daejung chemicals & Metals	5558-4100
Tube rotator- MX-RL-Pro	DLAB Scientific	824-222217777
Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL	Eppendorf Research Plus	M21518D
Precision pipette to deliver 15 and 25 μL	Eppendorf Research Plus	R25623C
Weighing paper (107 x 210 mm)	Fisherbrand	09-898-12B
Bead beater, 50/60 Hz 2A	GeneReach Biotechnology Corp	tp0088
Plate rotator with orbit capable of 500 rpm	Hangzhou Miu Instrument	MU-E30-1044
Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL	Hyundai Micro	H20050
Fume hood	Kwang Dong Industrial	KD 901-22128175
Micro-centrifuge capable of 1500 x g	Labo Gene	9.900.900.729
Mini vortex mixer	LMS	VTX-3000L
Lotte aluminum foil roll	Lotte Aluminum	B0722X5FK5
Digital scale	Mettler Toledo	ME204
Ultrapure water	MDM	MDM-0110
Pipette tips	Neptune Scientific	REF 2100.N
Large fish net	Pond H2O	Hoz135
Salivary cortisol kit	Salimetrics	1-3002-4
Bone cutting forceps	Sankyo	26-188A
Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL	VITLAB	18A68756
Towel	Yuhan Kimberly	1707921546
Tissue paper (107 × 210)	Yuhan Kimberly	41117