Mersin Balığı Fin ve Çene Kemiği Matrislerinden Kortizol Ekstraksiyonu

Özet

Bu çalışmada mersin balığı türlerinin yüzgeci nden ve çene kemiğinden kortizol çıkarılması için bir protokol sunmuz. Fin ve çene kemiği kortizol düzeyleri, ELISA tahlilleri ile takip eden iki yıkama çözücüsi karşılaştırılarak daha fazla incelendi. Bu çalışma, yeni bir stres göstergesi olarak çene kemiği kortizol fizibilite pilot.

Özet

Bu çalışmanın amacı, iki yıkama çözücüsi (su ve izopropanol) kullanarak mersin balığı yüzgeçlerinden kortizol çıkarılması için bir teknik geliştirmek ve üç ana mersin balığı türü arasında fin kortizol düzeylerindeki farklılıkları ölçmektir. Yüzgeçler yedi beluga(Huso huso),yedi Sibirya(Acipenser baerii)ve beş sevruga(A. stellatus)olmak üzere 19 kurban mersin balığından hasat edilmiştir. Mersin balıkları İran çiftliklerinde 2 yıl (2017-2018) yetiştirildi ve Güney Kore'de kortizol ekstraksiyon analizi yapıldı (Ocak-Şubat 2019). Beş H. huso çene kemikleri de kortizol ekstraksiyonu için kullanılmıştır. Veriler SAS ortamında genel doğrusal model (GLM) yordamı kullanılarak analiz edildi. Varyasyonun intra-ve inter-assay katsayıları sırasıyla 14.15 ve 7.70 idi. Kısaca kortizol ekstraksiyon tekniği, numunelerin (300 ± 10 mg) 3 mL çözücü (ultrasaf su ve izopropanol) ile iki kez yıkanması, 80 rpm'de 2,5 dakika boyunca döndürülmesi, yıkanmış numunelerin oda sıcaklığında (22-28 °C) 7 gün boyunca havayla kurutulması, daha fazla kuruma 32 dakika boyunca 50 Hz'de boncuk çırpıcı kullanan ve toz haline getirerek kurutulmuş totoya 1,5 mL metanol (75 ± 5 mg) ve oda sıcaklığında 18 saat boyunca yavaş döndürme (40 rpm) sürekli karıştırma ile. Ekstraksiyondan sonra numuneler santrifüj (10 dk için 9.500 x g) ve 1 mL supernatant yeni bir mikrosantrifüj tüpüne (1.5 mL) aktarıldı, metanolbuharlaştırmak için 38 °C'de inkübe edildi ve enzime bağlı immünosorbent analizi (ELISA) ile analiz edildi. . Yüzgeç kortizol düzeylerinde türler arasında veya yıkama çözücüleri arasında yüzgeç ve çene kemiği kortizol düzeylerinde fark gözlenmedi. Bu çalışmanın sonuçları mersin balığı çene kemiği matrisinin katı matrisler için umut verici bir alternatif stres göstergesi olduğunu göstermektedir.

Giriş

Kortizol hayvan stresinin güvenilir bir göstergesidir. Kortizol ekstraksiyon stres düzeyleri ve stres genel desenleri izlemek için araştırmacılar için geçerli bir çerçeve sağlar. Örneğin, önceki çalışmalarda insanlarda çeşitli yöntemler kullanarak saç kortizol ölçümleri metodolojik doğrulama yaptık^1,2, maymunlar^3,4, sığır⁵, koyun⁶, ve japon balığı^7,8. Balık türlerinde pul, deri mukusu, dışkı ve kan⁹ gibi matrislerde kortizol ölçümlerinin balık sağlığı hakkında bilgi sağladığı gösterilmiştir. Kan örneklemesi sorunlu olduğunda veya pullar eksik olduğunda kortizol ekstraksiyonu için alternatif matrislere ihtiyaç vardır. Balıklarda, alternatif matrisler çene kemiği içerebilir, insan diş benzer sert bir doku¹⁰.

Balık stres düzeylerini belirlemek için yeni matrislerin ve doğrulanmış tekniklerin geliştirilmesi, mersin balığının çevresel stres faktörlerine uzun süre maruz kalarak karşılaşabileceği havyar endüstrisinin özellikle ilgisini çekiyor^11. Mersin balığının cinsiyeti 2 yaşından önce belirlenemez ve mersin balığının pulu yoktur. Kortizol yavaş yavaş büyüme aşamasında katı matrisler birikir çünkü^2,7,12, yüzgeçleri ve çene kemikleri gibi sert matrisler uzun vadeli kortizol birikimi verileri stres içine anlayış sağlayabilir farklı büyüme aşamalarında düzeyleri. Buna karşılık, kan kortizol düzeyleri ölüm sırasında stres düzeylerinin bir anlık sağlamak ve doğru uzun vadeli yetiştirme koşulları sırasında stres temsil edemez^13,14. Havyar pazarında artan rekabet ile, uzun vadeli yetiştirme sırasında mersin balığı türleri arasında sağlıklı yumurta üretimi için stres koşullarını iyileştirmek için yeni yaklaşımlar (8-12 yıl veya daha uzun) araştırma giderek daha önemli bir alandır. Mersin balığının yüksek maliyeti nedeniyle, hasat edilen numuneler son derece pahalıdır (türlere ve büyüme aşamasına bağlı olarak olgun balık başına 8.000-15.000 $), araştırma projeleri için sınırlayıcı bir faktördür. Ancak, mersin balığı yüzgeçleri ve çene kemiklerinden kortizol ekstraksiyonu için uygun bir tekniğin geliştirilmesi, hem balık yetiştiriciliği sistemlerine hem de yabani balıklarda hem tüketim hem de tüketim için mersin balığı yumurtalarının kalitesini ve hasatını iyileştirmek için yararlı bir şekilde uygulanabilir. Koruma.

Güvenilir sonuçlar sağlamanın yanı sıra^6,uygun bir kortizol ekstraksiyon tekniğinin seçilmesi, numune hazırlama sırasında matriste bulunan diğer bileşiklerin çıktıyı şaşırtmamasını sağlamak için kritik öneme sahiptir, bu da tutarsız sonuçlar. Yüzgeç ve çene kemiği kortizol düzeylerinin çevredeki sudaki hormon seviyelerinden etkilenip etkilenmediğini belirlemek de aynı derecede önemlidir. Heimbürge ve ark.^15, yaş, cinsiyet, gebelik, mevsim, renk¹²ve kortizol¹⁶ayıklanır vücut bölgesi de dahil olmak üzere bir dizi faktör kortizol düzeylerini etkileyebilir önerdi . Ancak, balık vücut matris8 kortizol ekstraksiyon solventler yıkama etkileri hakkında çok az bilgi mevcuttur^,ve mersin balığı bu etkileri üzerinde hiçbir, mersin balığı yumurta ları hariç¹⁷.

Mersin balığının yüzgeçlerinden ve çene kemiklerinden bazal kortizol düzeylerinin analiz edilmesi balıkların ötenaziye geçirilmelerini gerektirse de, bu yaklaşım canlı mersin balığında kan örneklemesi için gerekli invaziv teknikleri gerektirmez. Yüzgeç ve çene kemiği örnekleri kolayca toplanır ve bu dokulardan çıkarma işlemi hızla yapılabilir. Benzer şekilde, hormon ekstraksiyon ve analiz basit ve biraz özel ekipman gerektirir.

Bu çalışmada, balık yüzgeçlerinden ve çene kemiklerinden kortizol çıkarılması, yıkanması ve tayini için yeni ve kolay uygulanan bir teknik sunmaktayız, bu matrislerden ölçülen kortizol düzeylerinin stres olarak güvenilir bir şekilde kullanılıp kullanılamayacağı saptanmak amacıyla Gösterge. Bu tekniğin avantajları kolay ve non-invaziv⁸ yaklaşım, daha az veri varyasyonu ve güvenilir çıkış^1,6,8,17; bu teknik mersin balığı gibi pulsuz balık türleri için geçerlidir. Bu teknik, balığın kesilmesini, uygun yıkama çözücülerinin seçimi^2,4, numunelerin uygun şekilde öğütülmesi^3,5, profesyonel enzime bağlı immünosorbent test (ELISA) gerektirir. uygulama^5,7, ve katı matrisler içine kortizol kaynaklarının dahil geniş bilgi⁶.

Beluga (Huso huso), Sibirya (Acipenser baerii), ve sevruga (A. stellatus ), her tür için standart çevre koşulları altında. H. huso çene kemikleri de mersin balığı stresdeğerlendirmek için kullanılmıştır. Bu, mersin balığı çene kemiklerindeki kortizol düzeylerini ölçen ilk çalışmadır. Bu çalışmanın sonuçları, cinsiyet belirlemeden önce erken büyüme aşamasında (~1 yıl) mersin balığı türleri için karşılaştırmalı kortizol verileri sağlayacaktır.

Protokol

Aşağıdaki deneysel prosedürler ve yöntemler Kangwon Ulusal Üniversitesi, Chuncheon, Kore Cumhuriyeti Hayvan Refahı ve Etik Kurumu tarafından onaylanmıştır.

1. Fin koleksiyonu

1. Yaralanma ve stresi en aza indirmek için bir ağ kullanarak yavaşça mersin balığı yakalayın.
2. Balığı tatlı suyla dikkatlice durulayın ve ötenaziden önce vücut yüzeyini emici bir havluyla silin.
3. Balık sersemlemiş ya da bilincini kaybeder gibi plastik bir çekiç kullanarak balık kafasına vurmak. Bir bıçak kullanarak başını çıkarın.
4. Vücut ağırlığını (g) ve uzunluğu (cm) ölçün.
5. Ötenaziden sonra, sterilize cerrahi makas kullanarak vücuda mümkün olduğunca yakın keserek yüzgeç örnekleri toplayın.
   NOT: Her balık için bireysel, geri dönüşümsüz emici havlular kullanılmalıdır. Bu çalışmada kullanılan türler için tanımlayıcı istatistikler aşağıdaki gibidir: beluga mersin balığı (H. huso): yaş = 18 ± 2.1 ay, vücut ağırlığı = 2.700 ± 300 g ve vücut uzunluğu = 55 ± 5 cm; Sibirya mersin balığı (A. baerii): yaş = 9.6 ± 2.4 ay, vücut ağırlığı = 1.750 ± 250 g ve vücut uzunluğu = 45 ± 5 cm; sevruga mersin balığı (A. stellatus): yaş = 14 ± 1.3 ay, vücut ağırlığı = 1.000 ± 100 g ve vücut uzunluğu = 65 ± 5 cm.

2. Kortizol ekstraksiyonu için fin hazırlığı

1. Yüzgeç numunelerini (doku başına bir örnek: ~3 g) laboratuvar tartım kağıdına (107 mm × 210 mm) yerleştirin ve kuruyana kadar birkaç gün oda sıcaklığında kurulayın.
2. Alüminyum folyo levhalar halinde sarın, etiketli plastik torbalar yerleştirin ve laboratuvara aktarın.
3. Yıkama, kortizol ekstraksiyonu, kurutma ve ELISA analizi dahil olmak üzere numuneleri daha fazla kullanım için buzdolabında saklayın(Şekil 2).

3. Fin kortizol analizi

1. Dijital analitik teraziyi (doğruluk: 0.0001) kalibre edin ve 300 ± 10 mg numuneyi ölçek tavasına tartım kağıdıyla tartın.
2. Örnekleri yıkayın.
   1. Her numuneyi 15 L konik polipropilen tüpe aktarın. 5.000 μL tek kanallı pipet kullanarak her tüpe 3 mL isopropanol ekleyin.
   2. Kortizol yıkamak ve herhangi bir potansiyel dış kontaminasyon kaldırmak için 2,5 dakika için 80 rpm tüpleri döndürün. Bu yordamı iki kez tekrarlayın.
   3. Yıkanmış numuneleri 7 gün boyunca oda sıcaklığında (22-28 °C) hava kurutun.
   4. Yıkama maddesi olarak ultra saf su kullanarak yıkama işlemini tekrarlayın.
3. Kemik kesme forceps kullanarak vücut dokusundan çene kemiği ayıklayın. Çene kemiği örneklerine 1.5-3.2.4 adımlarını uygulayın.
4. Tartın (75 ± 5 mg) kurutulmuş yüzgeç veya çene kemiği örnekleri ve 32 dakika için 50 Hz bir boncuk çırpıcı kullanarak öğütün.
   1. 1000 μL'lik bir pipet kullanarak toz yüzgeç veya çene kemiği içeren her tüpe 1,5 mL metanol verin. Sürekli karıştırma ile kortizol ayıklamak için oda sıcaklığında 18 saat için yavaş rotasyon (40 rpm) bir tüp rotator üzerinde örnekleri yerleştirin.
5. Kortizol ekstraksiyonundan sonra numuneleri oda sıcaklığında 10 dk boyunca 9.500 x g'de santrifüj edin. Santrifüjden sonra, her numuneden kortizol (1 mL) içeren üst organik katmanı toplayın ve ayrı bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
   1. Metanol buharlaştırmak için 38 °C'de kuluçka ile örnekleri kurutun. Metanol dağıtmak için izin vermek için bir gecede bir duman kaput altında çıkarılan kortizol örnekleri tutun.
      NOT: Kortizol içeren tabaka genellikle sarımsı renklidir.

4. Fin kortizol tespiti

1. ELISA kitini kullanmadan önce kurutulmuş yüzgeç veya çene kemiği örneklerini oda sıcaklığında 1,5 saat eritin.
2. 15 dakika boyunca 1.500 x g'de 400 μL fosfat tamponu, girdap ve santrifüj ekleyin.
3. Test doğruluğunu ve güvenilirliğini artırmak için her numuneyi (25°L) yinelenen olarak çalıştırın. Standart eğrinin dışındaki verileri aykırı olarak kaldırın.
4. Bir mikroplaka okuyucuyu 450 nm'ye ayarlayın, ardından μg dL^-1 olarak ayarlayın ve plakanın optik yoğunluğunu okuyun.
   1. Dört parametreli doğrusal olmayan regresyon eğrisine uyan mikroplaka yazılımını kullanın. Yazılımdan elde edilen örneklerin kortizol düzeylerini aşağıdaki denklemi kullanarak pg^-1'e dönüştürün:
      F = 10.000E (A/B) (C/D),
      nerede F = fin kortizol seviyesinin nihai değeri (pg mg^-1), E = kurutulmuş ekstresi yeniden oluşturmak için kullanılan tahlil arabelleğinin hacmi (mL), A = konsantrasyon (μg dL^-1) tahlil çıkışı tarafından sağlanan, B = ekstra tabi fin ağırlığı (mg) ction, C = metanol hacmi (mL) toz yüzgeç eklendi ve D = metanol hacmi (mL) ekstresi kurtarıldı ve daha sonra aşağı kurudu³.

5.İstatistiksel analiz

1. Testin gücünü ve sonuçların güvenilirliğini artırmak için her numuneyi yıkama işleminden önce iki alt örneğe bölün ve elisa kiti testi (numune başına 2 × 2 = 4 gözlem) sırasında yinelenen olarak çalıştırın.
2. SAS yazılım ortamındaki genel doğrusal model (GLM) prosedürünü ölçüm verileri¹⁸ile uygulayarak iki yıkama çözücüsünün etkilerini ve etkileşimlerini karşılaştırın.
3. Tukey'in testini p < 0,05 anlamlı bir düzeyde kullanma araçları arasındaki farkları test edin. 0.05 < p < 0.10'u önemli bir fark olarak değil, bir eğilimin kanıtı olarak kabul edin.

Sonuçlar

Sunulan fin kortizol çıkarma tekniği geliştirildi ve bu çalışmada üç mersin balığı türü kullanılarak doğrulandı. Yıkama çözücüleri olarak ultrasaf su ve izopropanol kullanılarak elde edilen kortizol düzeyleri karşılaştırıldı(Şekil 2). H. huso çene kemiklerinden kortizol, mersin balığı çene kemiklerinin yüzgeçlere alternatif bir matris olarak kullanılıp kullanılamayacağı incelendi. Çözücü, mersin balığ?...

Tartışmalar

Mersin balığı bazen "yaşayan fosil" olarak adlandırılır, çünkü geçmiş bin yıl boyunca birkaç adaptasyon sergilemiştir. Mersin balığı cinsi Acipenser havyar üreten 27 tür içerir; ancak, üç tür (beluga, baerii ve sevruga) küresel havyar kaynağının çoğunu üretir. Mersin balığı aşırı avlanmaya ve doğal yaşam alanlarına müdahaleye karşı savunmasızdır ve bu nedenle diğer türlere göre daha kritik tehlike altındadır. Mersin balığı, 150 milyon yıldır var olan en eski...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposal latex surgical gloves	Ansell	63754090
Platform scale-electronic weighing 100kg	Baskoolnikoo	101 EM
Serological pipette to deliver up to 24 mL	Becton Dickinson Falcon	35-7550
Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters	BioTek	8041000
Reagent reservoirs	BrandTech	703459
Zipper storage plastic bag	Cleanwrap	30cm x100m
Isopropyl alcohol	Daejung chemicals & Metals	5035-4400
Methyl alcohol	Daejung chemicals & Metals	5558-4100
Tube rotator- MX-RL-Pro	DLAB Scientific	824-222217777
Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL	Eppendorf Research Plus	M21518D
Precision pipette to deliver 15 and 25 μL	Eppendorf Research Plus	R25623C
Weighing paper (107 x 210 mm)	Fisherbrand	09-898-12B
Bead beater, 50/60 Hz 2A	GeneReach Biotechnology Corp	tp0088
Plate rotator with orbit capable of 500 rpm	Hangzhou Miu Instrument	MU-E30-1044
Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL	Hyundai Micro	H20050
Fume hood	Kwang Dong Industrial	KD 901-22128175
Micro-centrifuge capable of 1500 x g	Labo Gene	9.900.900.729
Mini vortex mixer	LMS	VTX-3000L
Lotte aluminum foil roll	Lotte Aluminum	B0722X5FK5
Digital scale	Mettler Toledo	ME204
Ultrapure water	MDM	MDM-0110
Pipette tips	Neptune Scientific	REF 2100.N
Large fish net	Pond H2O	Hoz135
Salivary cortisol kit	Salimetrics	1-3002-4
Bone cutting forceps	Sankyo	26-188A
Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL	VITLAB	18A68756
Towel	Yuhan Kimberly	1707921546
Tissue paper (107 × 210)	Yuhan Kimberly	41117