מיצוי הקורטיזול של החדקן פין ואת עצם הלסת מטריצות

Summary

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול להפקת קורטיזול מן הסנפיר ואת עצם הלסת של מינים חדקניים. פין והלסת רמות קורטיזול נבדקו נוסף על ידי השוואת שני ממיסים כביסה ואחריו אליסה assays. מחקר זה מנווט את הכדאיות של עצם הלסת קורטיזול כמו אינדיקטור מתח הרומן.

Abstract

מטרות מחקר זה היו לפתח טכניקה להפקת קורטיזול מתוך סנפירים חדקניים באמצעות שני ממיסים כביסה (מים איזופנול) ולכמת את כל ההבדלים רמות קורטיזול סנפיר בין שלושה המינים העיקריים חדקניים. סנפירים נקצרו מ 19 sturgeons הוקרב כולל שבעה בלוגה (huso huso), שבעה סיבירי (acipenser baerii), ו חמש סרומגה (א. stellatus). הsturgeons הועלו בחוות איראניות במשך שנתיים (2017-2018), וניתוח הוצאת קורטיזול נערך בדרום קוריאה (ינואר-פברואר 2019). ג'ווונז מ 5 ה. huso שימשו גם להפקת קורטיזול. הנתונים נותחו באמצעות הליך המודל הליניארי (GLM) הכללי בסביבת SAS. מקדמי הווריאציה הפנים והבין-שונות של וריאציה היו 14.15 ו-7.70, בהתאמה. בקצרה, שיטת החילוץ קורטיזול מעורב כביסה את הדגימות (300 ± 10 מ"ג) עם 3 מ ל של ממס (מים באולטרטהורים ו איזופנול) פעמיים, סיבוב ב 80 rpm עבור 2.5 דקות, ייבוש האוויר הדגימות שנשטפו בטמפרטורת החדר (22-28 ° c) במשך 7 ימים, ייבוש נוסף דגימות באמצעות מקצף חרוז ב 50 Hz עבור 32 דקות ושחיקה אותם אבקה, החלת 1.5 mL מתנול לאבקה מיובש (75 ± 5 מ"ג), וסיבוב איטי (40 rpm) עבור 18 h בטמפרטורת החדר עם ערבוב רציפה. בעקבות החילוץ, דגימות היו centrifuged (9,500 x g עבור 10 דקות), ו-1 mL supernatant הועבר צינור מיקרוצנטריפוגה חדש (1.5 mL), הדגירה ב 38 ° צ' כדי להתאדות את מתנול, וניתח באמצעות האנזים מקושר אנזימים מחובר בדיקות (אליסה) . הבדלים לא נצפו ברמות הקורטיזול סנפיר בין מינים או בתוך סנפיר והלסת רמות קורטיזול בין שטיפת ממיסים. התוצאות של מחקר זה להפגין כי מטריצה הלסת החדקן הוא מחוון מתח אלטרנטיבי מבטיח מטריצות מוצק.

Introduction

קורטיזול הוא מחוון אמין של מתח בעלי חיים. מיצוי הקורטיזול מספק מסגרת תקפה לחוקרים לניטור רמות הלחץ ודפוסים כלליים של התוקפים. לדוגמה, מחקרים קודמים ניהלו אימות מתודולוגי של מדידות קורטיזול שיער באמצעות שיטות שונות בבני אדם^1,2, קופים^3,4, בקר⁵, כבשים⁶, ו דג זהב^7,8. במינים של דגים, מדידות קורטיזול בתוך מטריצות כגון קשקשים, ריר העור, צואה, ו⁹ דם הוכחו לספק מידע על בריאות הדגים. כאשר דגימת דם היא בעייתית או קשקשים חסרים, מטריצות חלופיות עבור חילוץ קורטיזול נחוצים. בדגים, מטריצות חלופיות יכולות לכלול את עצם הלסת, רקמה קשה הדומה להשן האנושית¹⁰.

הפיתוח של מטריצות חדשות וטכניקות מאומת כדי לקבוע את רמות הלחץ של דגים הוא עניין מיוחד לתעשיית הקוויאר, שם חדקן יכול לחוות חשיפה ממושכת לגורמי הלחץ הסביבתי¹¹. לא ניתן לקבוע את מין החידקן לפני גיל שנתיים, ולחדקן אין קשקשים. בגלל הקורטיזול בהדרגה מצטבר מטריצות מוצק בשלב הצמיחה^2,7,12, לטווח ארוך הצטברות קורטיזול נתונים מתוך מטריצות קשות כגון סנפירים ובעצמות הלסת יכול לספק תובנה לחץ רמות בשלבי צמיחה שונים. לעומת זאת, רמות הקורטיזול של דם לספק תמונה של רמות הלחץ בזמן המוות ולא יכול במדויק לייצג לחץ במהלך הגידול לטווח ארוך^13,14. עם הגוברת התחרות בשוק הקוויאר, גישות חדשות כדי לשפר את תנאי הלחץ לייצור של ביצים בריאות בין מינים חדקניים במהלך הגידול לטווח ארוך (8-12 שנים או יותר) הם אזור חשוב יותר ויותר של מחקר. בשל העלות הגבוהה של חדקן, דגימות שנקטפו יקרים מאוד ($ 8000-15000 לכל דג בוגר בהתאם למינים ולשלב הצמיחה), גורם מגביל עבור פרויקטים מחקר. עם זאת, התפתחות הטכניקה המתאימה להפקת קורטיזול מן הסנפירים החדקניים והלסת יכול להיות שימושית באופן מלא הן מערכות חקלאיות דגים בדגים בר כדי לשפר את האיכות והקציר של ביצי חדקן עבור הצריכה ו שימור.

כמו גם מתן תוצאות אמינות⁶, הבחירה של טכניקה מתאימה לחילוץ קורטיזול היא בעלת חשיבות קריטית כדי להבטיח כי תרכובות אחרות הקיימות במטריקס במהלך הכנת המדגם לא לבלבל את התפוקה, אשר עשוי להוביל ל תוצאות לא עקביות. זה חשוב באותה מידה לקבוע אם הפין ואת הלסת רמות קורטיזול מושפעים רמות ההורמונים במים המקיפים. היימבורה ואח '¹⁵ הציע כי מספר גורמים עשויים להשפיע על רמות קורטיזול כולל גיל, מין, הריון, העונה, צבע¹², אזור הגוף שממנו הקורטיזול מחולץ¹⁶. עם זאת, מידע קטן זמין על ההשפעות של כביסה ממיסים על הפקת קורטיזול בתוך מטריצות הגוף דגים⁸, ואף אחד על ההשפעות האלה בחדקן, למעט ביצים חדקן¹⁷.

למרות ניתוח רמות קורטיזול בסיסית מן הסנפירים והלסת של החידקן דורש כי הדגים להיות מורדמים, גישה זו אינה כרוכה הטכניקות פולשני הדרושים לדגימת דם ב חדקן חי. הדגימות פין ואת עצם הלסת נאספים בקלות, והפקת מרקמות אלה ניתן לבצע במהירות. באופן דומה, חילוץ הורמון וניתוח הם פשוטים ודורשים ציוד מיוחד קטן.

במחקר זה, אנו מציגים טכניקה חדשה ומיושם בקלות עבור החילוץ, כביסה, ונחישות של קורטיזול מן הדגים סנפירים והלסת, במטרה לקבוע אם רמות הקורטיזול נמדד מטריצות אלה ניתן להשתמש באופן אמין כמתח אינדיקטורים. היתרונות של טכניקה זו כוללים גישה קלה ולא פולשנית⁸ , פחות וריאציה נתונים, פלט אמין^1,6,8,17; הטכניקה מתאימה למינים של דגים ללא קשקשים כגון חדקן. הטכניקה דורשת טבח של הדג, מבחר של ממיסים כביסה המתאים^2,4, שחיקה נכונה של דגימות^3,5, מקצועי מקושר אנזימים מקושרים בדיקות (אליסה) יישום^5,7, וידע נרחב של התאגדות של מקורות קורטיזול לתוך מטריצות מוצק⁶.

התחלנו שני ממיסים שונים כביסה (מים באולטרסאונד ואיזופנול) כדי להשיג רמות קורטיזול בסיס של סנפירים מ שלושה מינים חדקניים: בלוגה (huso huso), סיבירי (acipenser baerii), ו סבראגה (א. סטאטוס ), בתנאים סביבתיים סטנדרטיים לכל מין. ג'ווונז של ה. huso היו גם שימשו כדי להעריך את הלחץ בחדקן. זהו המחקר הראשון למדוד רמות קורטיזול ב חדקן ג'ווונז. תוצאות מחקר זה יספק נתונים קורטיזול השוואתי עבור מינים חדקניים בשלב הצמיחה המוקדמת (~ 1 שנה) לפני קביעת מין.

Protocol

ההליכים הניסיוניים והשיטות הבאות אושרו על ידי הרשות לרווחת בעלי חיים והאתיקה של האוניברסיטה הלאומית של קנגוון, צ'אנצ'צ, הרפובליקה של קוריאה.

1. אוסף פין

1. ללכוד את החדקן בעדינות באמצעות רשת כדי למזער את הפציעה והלחץ.
2. שטפו בזהירות את הדג במים מתוקים ולאחר מכן נגבו את משטח הגוף עם מגבת ספיגה לפני המתת החסד.
3. הכה את ראש הדג בעזרת פטיש פלסטי שהדג המום או מאבד את ההכרה. . תסיר את הראש בעזרת סכין
4. מדוד את משקל הגוף (גר') ואורך (ס מ).
5. לאחר המתת חסד, לאסוף דגימות סנפיר ידי חיתוך קרוב ככל הגוף ככל האפשר באמצעות מספריים כירורגי מעוקר.
   הערה: מגבות ספיגה בודדות שאינן ממוחזרות חייבות לשמש עבור כל דג. סטטיסטיקה תיאורית עבור המינים המשמשים במחקר זה היו כדלקמן: בלוגה חדקן (H. huso): גיל = 18 ± 2.1 חודשים, משקל גוף = 2,700 ± 300 g, ואת אורך הגוף = 55 ± 5 ס מ; חדקן סיבירי (A. baerii): גיל = 9.6 ± 2.4 חודשים, משקל גוף = 1,750 ± 250 g, ואורך הגוף = 45 ± 5 ס מ; סקן סארגגה (A. stellatus): גיל = 14 ± 1.3 חודשים, משקל גוף = 1,000 ± 100 g, ואת אורך הגוף = 65 ± 5 ס מ.

2. הכנת סנפיר להפקת קורטיזול

1. מניחים את דגימות סנפיר (מדגם אחד לכל רקמה: ~ 3 g) על נייר מעבדה במשקל (107 מ"מ × 210 מ"מ) ויבש בטמפרטורת החדר כמה ימים עד יבש.
2. לעטוף דגימות בגיליונות של רדיד אלומיניום, המקום בשקיות פלסטיק מתויג, ולהעביר למעבדה.
3. החנות דגימות במקרר לשימוש נוסף, כולל כביסה, הפקת קורטיזול, ייבוש, וניתוח אליסה (איור 2).

3. ניתוח קורטיזול של פין

1. כיול את קנה המידה האנליטי הדיגיטלי (דיוק: 0.0001) ושקול 300 ± 10 מ"ג דגימות עם נייר שקילה על המחבת בקנה מידה.
2. . שטוף את הדגימות
   1. העבר כל אחת מהדוגמאות לצינור פוליפרופילן מדגם 15 L. הוסף 3 מ ל של איזופנול לכל צינור באמצעות מ5,000 μL ערוץ יחיד.
   2. לסובב את הצינורות ב 80 rpm עבור 2.5 דקות לשטוף את הקורטיזול ולהסיר כל זיהום חיצוני פוטנציאלי. חזור על הליך זה פעמיים.
   3. האוויר יבש את הדגימות שנשטפו בטמפרטורת החדר (22-28 ° c) במשך 7 ימים.
   4. חזור על הליך הכביסה באמצעות מים באולטרטהורים כסוכן הכביסה.
3. לחלץ את עצם הלסת מרקמת הגוף באמצעות מלקחיים חיתוך עצמות. החל את שלבים 1.5-3.2.4 לדגימות עצם הלסת.
4. שקול out (75 ± 5 מ"ג) מיובש סנפיר או דגימות עצם הלסת לטחון באמצעות מקצף חרוז ב 50 הרץ עבור 32 דקות.
   1. לספק 1.5 mL של מתנול לתוך צינור כל המכיל אבקה סנפיר או עצם הלסת באמצעות מ1000 μL. מניחים את הדגימות על מסובבי צינור בסיבוב איטי (40 rpm) עבור 18 h בטמפרטורת החדר כדי לחלץ קורטיזול עם ערבוב רציפה.
5. בעקבות חילוץ קורטיזול, צנטריפוגה את הדגימות ב 9,500 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה, לאסוף את השכבה האורגנית העליון המכיל קורטיזול (1 מ ל) מכל מדגם ומניחים אותו לתוך צינור נפרד 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה.
   1. מייבשים את הדגימות על ידי דגירה ב 38 ° צ' כדי להתאדות מתנול. שמור את דגימות הקורטיזול שחולצו תחת מכסה המנוע בלילה כדי לאפשר מתנול להתפזר.
      הערה: השכבה המכילה קורטיזול היא בדרך כלל בצבע צהבהב.

4. פין זיהוי קורטיזול

1. הפשרה של הסנפיר היבש או דגימות עצם הלסת בטמפרטורת החדר עבור 1.5 h לפני שימוש בערכת אליסה.
2. הוסף 400 μL של מאגר פוספט, מערבולת, ו צנטריפוגה ב 1,500 x g עבור 15 דקות.
3. הפעל כל אחת מהדוגמאות (25 μL) בשכפול כדי לשפר את רמת הדיוק והמהימנות של התיקון. הסר נתונים כלשהם מחוץ לעקומה הסטנדרטית כגבולות.
4. להגדיר קורא מיקרו לוחית 450 ננומטר, ואז להגדיר μg dL^-1 ולקרוא את הדחיסות האופטית של הצלחת.
   1. השתמש בתוכנת המיקרו-לוחית עם התאמה של עקומת רגרסיה לא ליניארית בעלת ארבעה פרמטרים. להמיר את רמות הקורטיזול של דגימות שהתקבלו מהתוכנה לתוך pg mg^-1 באמצעות המשוואה הבאה:
      F = 10, 000E (A/B) (C/D),
      כאשר F = הערך הסופי של רמת הקורטיזול של סנפיר (pg mg^-1), E = אמצעי האחסון (mL) של מאגר הנתונים המשמש ליצור מחדש את התמצית היבשים, A = הריכוז (Μg dL^-1) המסופק על ידי פלט הספק, B = המשקל (mg) של הסנפיר נתון לתוספת מטר, C = אמצעי האחסון (mL) של מתנול הוסיף אבקת סנפיר, ו D = אמצעי האחסון (mL) של מתנול התאושש מן התמצית ולאחר מכן התייבש³.

5. אנליזה סטטיסטית

1. חלק כל דוגמה לשני תתי-דגימות לפני הליך הכביסה ולאחר מכן הפעל בשכפול במהלך הטיפול בערכת ה-אליסה (2 × 2 = 4 תצפיות לכל מדגם) כדי לשפר את העוצמה של הבדיקה והמהימנות של התוצאות.
2. השוו בין ההשפעות של שני ממיסים הכביסה והאינטראקציות שלהם על ידי החלת המודל הליניארי הכללי (GLM) בסביבת התוכנה של SAS לנתוני המדידה¹⁸.
3. בדיקת ההבדלים בין האמצעים באמצעות מבחן של Tukey ברמת משמעות של p < 0.05. קבל 0.05 < p < 0.10 כהוכחה לנטייה ולא כהפרש משמעותי.

תוצאות

שהוצגו הציג את הטכניקה מיצוי הקורטיזול שפותחה ואושרה במחקר זה באמצעות שלושה מינים חדקניים. רמות הקורטיזול הושגו באמצעות מים באולטרטהור ו איזופנול כמו ממיסים הכביסה הושוו (איור 2). הקורטיזול משנת H. huso ג'ווונז נבדק כדי לקבוע אם הלסת החדקניים יכול לשמש ?...

Discussion

חדקניים נקרא לפעמים "מאובן חי" כי זה הציג עיבודים מעטים במהלך אלפי שנים האחרונות. הסוג החדקן מכיל 27 מינים המייצרים קוויאר; עם זאת, שלושה מינים (בלוגה, baerii, ו סברוגה) לייצר את רוב האספקה הגלובלית של קוויאר. החדקניים חשופים לדיג יתר ולהפרעות בסביבתם הטבעית ולכן הם בסכנת הכחדה אנושות יותר מ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposal latex surgical gloves	Ansell	63754090
Platform scale-electronic weighing 100kg	Baskoolnikoo	101 EM
Serological pipette to deliver up to 24 mL	Becton Dickinson Falcon	35-7550
Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters	BioTek	8041000
Reagent reservoirs	BrandTech	703459
Zipper storage plastic bag	Cleanwrap	30cm x100m
Isopropyl alcohol	Daejung chemicals & Metals	5035-4400
Methyl alcohol	Daejung chemicals & Metals	5558-4100
Tube rotator- MX-RL-Pro	DLAB Scientific	824-222217777
Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL	Eppendorf Research Plus	M21518D
Precision pipette to deliver 15 and 25 μL	Eppendorf Research Plus	R25623C
Weighing paper (107 x 210 mm)	Fisherbrand	09-898-12B
Bead beater, 50/60 Hz 2A	GeneReach Biotechnology Corp	tp0088
Plate rotator with orbit capable of 500 rpm	Hangzhou Miu Instrument	MU-E30-1044
Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL	Hyundai Micro	H20050
Fume hood	Kwang Dong Industrial	KD 901-22128175
Micro-centrifuge capable of 1500 x g	Labo Gene	9.900.900.729
Mini vortex mixer	LMS	VTX-3000L
Lotte aluminum foil roll	Lotte Aluminum	B0722X5FK5
Digital scale	Mettler Toledo	ME204
Ultrapure water	MDM	MDM-0110
Pipette tips	Neptune Scientific	REF 2100.N
Large fish net	Pond H2O	Hoz135
Salivary cortisol kit	Salimetrics	1-3002-4
Bone cutting forceps	Sankyo	26-188A
Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL	VITLAB	18A68756
Towel	Yuhan Kimberly	1707921546
Tissue paper (107 × 210)	Yuhan Kimberly	41117