نموذج زرع الشريان الاورطي لعنق الرحم من murine باستخدام تقنيه الكفة المعدلة غير الخياطة

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لزرع الابهر غير المتجانس في الفئران باستخدام تقنيه الكفة غير الخياطة في نموذج murine عنق الرحم. ويمكن استخدام هذا النموذج لدراسة الامراض الاساسيه لاعتلال الاوعيه الدموية المزمنة الطعوم (CAV) ويمكن ان تساعد في تقييم العوامل العلاجية الجديدة من أجل منع تشكيلها.

Abstract

مع الأخذ ببروتوكولات مثبطه للمناعة قويه ، والتقدم المتميزة ممكنة في الوقاية والعلاج من نوبات الرفض الحاد. غير انه لم يتسن خلال العقود الماضية ملاحظه سوي تحسن طفيف في النتائج الطويلة الأجل للأعضاء الصلبة المزروعة. في هذا السياق ، لا يزال اعتلال الاوعيه الدموية المزمن (CAV) يمثل السبب الرئيسي لفشل الأعضاء المتاخر في زراعه القلب والكلي والرئة.

وحتى الآن ، لا يزال المرض الكامن وراء تطور CAV غير واضح ، موضحا سبب فقدان استراتيجيات العلاج الفعالة حاليا والتاكيد علي الحاجة إلى نماذج تجريبية ذات صله من أجل دراسة الفيزيولوجيا المرضية الكامنة التي تؤدي إلى تشكيل CAV. يصف البروتوكول التالي نموذجا لزرع الابهر العنقي غير المتجانس باستخدام تقنيه الكفة غير الخياطة المعدلة. في هذه التقنية ، يتم وضع شريحة من الابهر الصدري في الشريان السباتي المشترك الأيمن. مع استخدام تقنيه الكفة غير الخياطة ، يمكن إنشاء نموذج سهل التعلم والاستنساخ ، والتقليل إلى ادني حد ممكن من عدم تجانس الاوعيه الدموية المجهرية الصغيرة.

Introduction

علي مدي العقود الستة الماضية ، تطورت زراعه الأعضاء الصلبة من اجراء تجريبي إلى معيار الرعاية لعلاج فشل الجهاز في المرحلة النهائية¹. ونظرا لتحسن عوامل مضادات الميكروبات والتقنيات الجراحية والتقدم في الأفواج المثبطة للمناعة ، فان معدل النجاح المبكر لزراعه الأعضاء الصلبة قد ازداد بشكل ملحوظ علي مدي العقود الماضية².

غير ان معدلات البقاء علي قيد الحياة الطويلة الأجل لم تتحسن تحسنا كبيرا بنفس الطريقة³. تطوير CAV هو العامل الرئيسي الذي يحد من البقاء علي المدى الطويل^4,5,6. ويتميز هذا المرض من خلال تشكيل طبقه الورم العضوي المتمركزة التي تتكون من خلايا العضلات الملساء ، مما يؤدي إلى تضييق تدريجي للسفينة وسوء التغذية علي التوالي من الجهاز الصلبة المزروعة. في المتلقيين زرع القلب ، يمكن تشخيص آفات CAV في ما يصل إلى 75 ٪ من المرضي 3 سنوات بعد زرع⁷.

الفيزيولوجيا المرضية من CAV ليست مفهومه تماما حتى الآن. ويبدو ان تكون مرتبطة بالعديد من العوامل المناعية وغير المناعية ، مما يؤدي إلى تلف البطانية مع التنشيط البطانية اللاحقة والخلل الوظيفي⁸. حتى الآن ، لا يوجد خيار العلاج السببية للوقاية من CAV ، والتاكيد علي الحاجة إلى نموذج الحيوانية الصغيرة استنساخه من أجل دراسة تشكيل والعلاج المحتمل من CAV.

مع استخدام نماذج زرع الشريان الابهري ، CAV مثل آلافات يمكن ان ينظر اليها بعد 4 أسابيع من الزرع. هذه آلافات تتكون أساسا من خلايا العضلات الملساء الاوعيه الدموية ، التالي ، تشبه علم الامراض البشرية. بسبب مجموعه واسعه من الوراثية وضرب الفئران ، واستخدام نماذج الماوس في زرع الامراض المرتبطة يوفر فرصه فريدة لتحديد الخيارات العلاجية الجديدة وفهم تنميتها. بسبب القطر الصغير للسفن المزروعة ومع ذلك ، عاده ما يرتبط استخدام نماذج الماوس مع منحنيات التعلم الطويل ومعدل المضاعفات الاوليه العالية⁹. مع إدخال تقنيه الكفة غير خياطه ، ويمكن تسهيل هذا الجزء الأكثر تحديا من العملية والحفاظ علي قطر من اناستاموسيس ثابت^10،11.

Protocol

وأجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية لقانون رعاية الماشية المانيه (تيرشغ). (AZ: 55.2-1-54-2532. Vet_02-80-2015).

1-الإسكان الحيواني

1. للتجارب ، استخدم الذكور C57BL/6 و BALB/c الفئران وزنها 20-25 g مع C57BL/6 الفئران كما المتلقي الحيوانية والفئران BALB/c كالماشية المانحة.
2. شراء الماشية والمنزل في منشاه خاليه من العوامل المسببة للمرض ، وفقا للمبادئ التوجيهية FELASA لرصد الصحة¹².
3. الحفاظ علي الفئران في أقفاص Makrolon القياسية مع إثراء المواد التعشيش. توفير الوصول إلى المياه والمواد الغذائية المغلفة في يوم/ليله دوره من 12 ساعة.
4. الحفاظ علي درجه حرارة الغرفة في 22 ± 2 درجه مئوية والرطوبة النسبية في 55 ± 5 ٪.

2-اعداد المستفيدين

1. أولا ، تخدير الحيوانية المتلقية (C57BL/6) مع حقنه داخل الصفاق من ميدازولام (5 ملغم/كغ ؛ 5 ملغم/مل) ، medetomidin (0.5 ملغم/كغ ؛ 1 ملغم/مل) ، الفنتانيل (0.05 ملغم/كغ ؛ 0.05 ملغم/مل).
   ملاحظه: يجب الوصول إلى العمق الصحيح للتخدير في 5-10 دقيقه.
   1. قرصه القدمين الخلفية مع ملقط للتحقق من ردود الفعل لتاكيد عمق التخدير.
2. كليب كل شعر المنطقة الجانبية عنق الرحم مع مقص الشعر الكهربائية للحيوانات الصغيرة وتطبيق مرهم العيون مع مسحات القطن لمنع العينين من الجفاف اثناء العملية.
3. وضع الحيوانية في موقف ضعيف علي وساده التدفئة تحت المجهر والشريط بلطف ساقيه إلى طاوله التشغيل مع شرائط الجص الحساسة الجلد.
4. أماله راسه إلى الوراء وفرك الحقل المنطوق عده مرات مع الكحول.
5. اجراء شق الجلد من شق الوداجي إلى أسفل الفك السفلي الأيمن مع مقص صغير.
6. أزاله الفص السفلي الأيمن من الغدة الفكه عن طريق الحذر ثنائي القطب من عنله السفينة والختان اللاحق مع المقص المجهري.
7. قم بازاله العضلة الصحيحة من الجزء العلوي والسفلي والاستئصال اللاحق مع المقص المجهري للوصول إلى الشريان السباتي الشائع.
8. تعبئة الشريان السباتي المشترك باقصي ما يمكن من الانتفاخ والتقارب بقدر الإمكان عن طريق سحب النسيج الضام المحيطة بالاضافه إلى الملقط الناعم.
9. اربط اثنين من الاربطه الحريرية 7-0 مع الحد الأدنى من المسافة بين كل منهما حول منتصف الشريان السباتي المشترك والشريان السباتي المشترك مع المقص المجهري الدقيق بين الحروف المركبة.
10. تمرير القريب ، النهاية ligated من خلال الكفة وإصلاحه مع المشبك الشريان الصغيرة.
    ملاحظه: تم قطع الأصفاد التي تم استخدامها في هذا الاجراء مع المقص الصغير من أنابيب بوليميد مع القطر الخارجي من 0.610 ملم وسمك الجدار من 0.0254 مم. وكان الأصفاد المكتملة طول ~ 2 ملم مع نصف واحد ، والذي يستخدم لعمليه النفخ ، ويجري اسطوانه كامله والنصف الآخر ، والتي فرضت ، كونها نصف اسطوانه.
11. أزاله الاربطه مع المقص الدقيقة ، علي مقربه من الاربطه قدر الإمكان ، ومسح التجويف مع heparinized المالحة (50 وحده دوليه/مل) مع 30 G ابره ، في حين الحرص علي عدم الاضرار الجدران السفينة.
12. Distend التجويف مفتوحة باستخدام الموسعات الاوعيه الدموية الجميلة و إيفرت الجذع السباتي علي الكفة عن طريق سحب بلطف علي أنبوب بوليميد.
13. إصلاح الشريان السباتي علي الفور مع حلقه الحرير 7-0 المربوطة مسبقا فضفاضة.
    ملاحظه: فضفاضة قبل التعادل 4 7-0 الحلقات الحريرية مع قطر حوالي 1.5 مم قبل الجراحة لجعل النفخ-الاجراء أكثر سلاسة وأسهل.
14. تنفيذ نفس الاجراء (2.10-2.13) في الطرف الآخر من الشريان السباتي.
15. تعيين الحيوانية المتلقي جانبا وترطيب حقل المنطوق مع المالحة حتى يتم شرح الجزء الابهري.

3-عمليه المانحين

1. تخدير الماوس المتبرع (BALB/c) بنفس الطريقة التي الحيوانية المتلقي.
   1. قرصه القدمين الخلفية مع ملقط للتحقق من ردود الفعل لتاكيد التخدير الكافي.
2. قص جميع الشعر من منطقه البطن والصدر مع مقص الشعر الكهربائية للحيوانات الصغيرة وتطبيق مرهم العيون مع مسحات القطن لمنع العينين من الجفاف اثناء العملية.
3. وضع الحيوانية في موقف ضعيف علي وساده التدفئة تحت المجهر والشريط بلطف ساقيه إلى طاوله التشغيل مع شرائط الجص الحساسة الجلد.
4. فرك الحقل المنطوق عده مرات مع الكحول.
5. قم باجراء بضع البطن البطني بمقص صغير وادفع الأمعاء إلى اعلي قليلا للكشف عن الوريد الأجوف السفلي (IVC).
6. حقن الوريد الأجوف السفلي (IVC) مع 1 مل من المحلول الملحي heparinized باستخدام ابره 30 G.
7. قطع الابهر البطني و IVC تحت الشرايين الكلوية مع مقص صغير لإفراز الحيوانية المتبرعة. وضع بشكل فضفاض ضغط في البطن لامتصاص الدم.
8. اجراء بضع الصدر في تحويل الثنائية من الأضلاع مع مقص وأماله جدار القفص الصدري الامامي مع المشبك الجراحية لفضح المنصف.
9. قطع ال IVC والمريء مباشره فوق الحجاب الحاجز مع المقص الصغير.
10. أزاله القلب والرئتين عن طريق أماله لهم التصاعدي مع ملقط عقد قطع IVC/المريء ومن ثم الاعفاء منها مع المقص الصغير من قاعدتها للوصول إلى الشريان الابهر الصدري في المنصف الظهري.
11. تعبئة الشريان الابهر الصدري من الانسجه المحيطة به عن طريق سحب الانسجه الضامة المحيطة والدهون مع ملقط غرامه في حين يجري الحرص علي عدم تلف اي الشرايين الوربيه.
12. كوي جميع الفروع من الشريان الابهر الصدري مع ملقط الحذر ثنائي القطب والمكوس الجزء الابهر بين الحجاب الحاجز وقوس الابهر باستخدام المقص الصغير.
13. امسح الجزء الابهري المثير مع محلول ملحي heparinized بابره 30 جرام ، مع الحرص علي عدم اتلاف جدران الاوعيه ، وأزاله اي دم أو جلطات متبقية ، ونقل الطعم إلى الحيوانية المتلقية.
    ملاحظه: ضع الطعم الابهري مباشره في الموضع الصحيح تقريبا في المستلم اثناء النقل. إذا كان هناك مشاكل مربكه نهايات مختلفه من الطعم في الحيوانية المتلقية ، والاربطه فضفاضة حول نهاية البعيدة يمكن ان تساعد.

4-الغرس

1. اسحب الطرف القريب من الجزء الابهري المتبرع فوق الكفة القريبة علي راس الشريان السباتي الذي تمت معالجته بالملقط الدقيق وأصلحه علي الفور باستخدام حلقه حريريه غير مربوطه مسبقا 7-0.
2. تقليم البعيدة ، والنهاية الحرة لكسب الطعم الابهري مع المقص الصغير بحيث طول الطعم يناسب المسافة بين الأصفاد اثنين.
3. كرر الخطوة 4.1 علي الطرف الآخر من الشريان الابهر مع الكفة الأخرى لإكمال الانسمام.
4. قم بازاله المشبك البعيد للسماح بالترويه الارتجاعية.
5. بعد تحقيق الأرقاء ، وأزاله المشبك القريب لإكمال الانسمام.
6. وأخيرا ، إغلاق الجرح مع 6-0 خياطه مستمرة.

5. الرعاية بعد الجراحة

1. راقب الفاره بشكل وثيق في أول 6 ساعات بعد العملية ثم عده مرات في اليوم لأول 72 ساعة بعد الزرع للكشف عن اي مضاعفات علي الفور.
2. لتسكين بعد العملية الجراحية ، حقن الماوس المزروعة مع البوبرينورفين (0.05-0.1 مغ/كغ) جلد مباشره بعد الزرع ثم كل 12 ح ل 72 h لتوفير المناسبة ، وعلي المدى الطويل تسكين.

6. تفسيرات الطعم الابهري

1. تخدير الحيوانية المزروعة مع حقنه داخل الصفاق من ميدازولام (5 مغ/كغ; 5 مغ/مل), medetomidin (0.5 مغ/كغ; 1 مغ/مل) و الفنتانيل (0.05 ملغم/كغ; 0.05 ملغم/مل) 4 أسابيع بعد الزرع.
   1. قرصه القدمين الخلفية مع ملقط للتحقق من ردود الفعل لتاكيد التخدير الكافي.
2. قص جميع الشعر في منطقه البطن والصدر وعنق الرحم مع مقص الشعر الكهربائية للحيوانات الصغيرة.
3. وضع الحيوانية في موقف ضعيف علي وساده التدفئة تحت المجهر والشريط بلطف ساقيه إلى طاوله التشغيل مع شرائط الجص الحساسة الجلد.
4. فرك الحقل المنطوق عده مرات مع الكحول.
5. قم باجراء بضع البطن البطني بمقص صغير وادفع الأمعاء إلى اعلي قليلا للكشف عن الوريد الأجوف السفلي (IVC).
6. حقن الوريد الأجوف السفلي (IVC) مع 1 مل من المحلول الملحي heparinized باستخدام ابره 30 G.
7. قطع الابهر البطني و IVC تحت الشرايين الكلوية مع مقص صغير لإفراز الحيوانية المتبرعة. وضع بشكل فضفاض ضغط في البطن لامتصاص الدم.
8. اصنع شقا جلديا من الشق الوداجي إلى الفك السفلي الأيمن مع مقص صغير يقابل الشق الجلدي الذي تم اجراؤه اثناء عمليه الزرع.
9. حدد الطعم الابهري المزروع مع الكفة البعيدة والقريبة وقم بازاله اي نسيج محيط بالملقط.
10. باستخدام المقص الصغير ، تقطع من خلال الشريان السباتي المشترك البعيد والقريب إلى الطعم الابهري مع الأصفاد من أجل توضيح الطعم الابهري مع نهايات الكفة اثنين.
11. قطع الجزء الابهري في نصف والحفاظ علي العينات لمزيد من التحليلات (الأقسام المجمدة ، البارافين جزءا لا يتجزا من المواد المجمدة المفاجئة)^13،14.

النتائج

في نموذج الزرع غير المتوافق بالبالكامل ، يمكن رؤية طبقه نيومورال المتمركزة بعد 4 أسابيع من الزرع (الشكل 2). هذه الطبقة تتكون في المقام الأول من خلايا العضلات الملساء الاوعيه الدموية كما ايمونوهيستولوجيكال تلطيخ ل SM22 (علامة انتقائية لخلايا العضلات الملساء الوعائية الناضجة) ...

Discussion

اعتلال الاوعيه الدموية المزمنة الطعوم هو السبب الرئيسي لفقدان الطعم في وقت متاخر بعد زرع الأعضاء الصلبة من القلب والمحتملة الكلي والرئة الطعوم⁸. حتى الآن ، لا يمكن وضع نظام علاجي السببية من أجل منع تشكيل CAV.

الفيزيولوجيا المرضية لCAV متعددة العوامل وتنطوي علي ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balb-c Mice (H2-d)	Charles River	Strain# 028	Donor animal
Bipolar cautery system	ERBE	ICC 50 / 20195-023	Bipolar cautery
C57BL/6J (H-2b)	Charles River	Strain# 027	Recipient animal
Halsey Needle Holders	FST	12501-12	Needle Holder
Halsted-Mosquito Forceps	AESCULAP	BH111R	Curved Clamp
Medical Polyimide Tubing	Nordson MEDICAL	141-0031	Cuff-Material
Micro Serrefines	FST	18055-04	Micro Vessel Clip
Micro-Adson Forceps (serrated)	FST	11018-12	Standard Forceps
Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps	FST	18057-14	Clipapplicator
S&T Forceps - SuperGrip Tips (Angled 45°)	S&T	00649-11	Fine Forceps
S&T Vessel Dilating Forceps - Angled 10° (Tip diameter 0.2 mm)	S&T	00125-11	Vesseldilatator
Schott VisiLED Set	Schott	MC 1500 / S80-55	Light
Stereoscopic microscope	ZEISS	SteREO Discovery.V8	Microscope
Student Fine Scissors / Surgical Scissors - Sharp-Blunt	FST	91460-11 / 14001-12	Standard Sissors
Vannas-Tübingen Spring Scissors (curved, 8.5 cm)	FST	15004-08	Microsissors (curved)
Vannas-Tübingen Spring Scissors (straight, 8.5 cm)	FST	15003-08	Microsissors (straight)