Modèle de transplantation aortique cervicale de Murine utilisant une technique modifiée de manchette de non-suture

Résumé

Ici, nous présentons un protocole de la transplantation aortique hétérotopique chez les souris utilisant la technique de manchette de non-suture dans un modèle murin cervical. Ce modèle peut être utilisé pour étudier la pathologie sous-jacente de la vasculopathie chronique d'allogreffe (CAV) et peut aider à évaluer de nouveaux agents thérapeutiques afin de prévenir sa formation.

Résumé

Avec l'introduction de protocoles immunosuppresseurs puissants, des progrès distincts sont possibles dans la prévention et la thérapie des épisodes aigus de rejet. Cependant, seulement l'amélioration mineure des résultats à long terme des organes solides transplantés a pu être observée au cours des dernières décennies. Dans ce contexte, la vasculopathie chronique d'allograft (CAV) représente toujours la cause principale de l'échec tardif d'organe dans la transplantation cardiaque, rénale et pulmonaire.

Jusqu'à présent, la pathogénie sous-jacente du développement des CAV demeure floue, expliquant pourquoi les stratégies de traitement efficaces sont actuellement manquantes et mettant l'accent sur la nécessité de modèles expérimentaux pertinents afin d'étudier la pathophysiologie sous-jacente menant à Formation CAV. Le protocole suivant décrit un modèle hétérotopique de transplantation aortique cervicale murine utilisant une technique modifiée de manchette de non-suture. Dans cette technique, un segment de l'aorte thoracique est interpositionné dans l'artère carotide commune droite. Avec l'utilisation de la technique de manchette non-suture, un modèle facile à apprendre et reproductible peut être établi, minimisant l'hétérogénéité possible des micro anastomoses vasculaires sutured.

Introduction

Au cours des six dernières décennies, la transplantation d'organes solides est passée d'une procédure expérimentale à une norme de soins pour le traitement de l'insuffisance d'organes en phase finale¹. En raison de l'amélioration des agents antimicrobiens, des techniques chirurgicales et de l'avancement dans les régiments immunosuppresseurs, le taux de réussite précoce de la transplantation d'organes solides a considérablement augmenté au cours des dernières décennies².

Cependant, les taux de survie à long terme de greffe ne se sont pas sensiblement améliorés de la même manière³. Le développement de CAV est le principal facteur limitant la survie à long terme^4,5,6. Cette pathologie est caractérisée par la formation d'une couche néointimale concentrique composée de cellules musculaires lisses, conduisant à un rétrécissement progressif du vaisseau et une malperfusion consécutive de l'organe solide transplanté. Chez les receveurs de greffes cardiaques, les lésions de CAV peuvent être diagnostiquées dans jusqu'à 75% de patients 3 ans après la transplantation^7.

La physiopathologie du CAV n'est pas encore entièrement comprise. Il semble être lié à de nombreux facteurs immunologiques et non immunologiques, conduisant à des dommages endothéliaux avec l'activation endothéliale suivante et le dysfonctionnement⁸. Jusqu'à présent, il n'existe aucune option de traitement causal pour la prévention de la CAV, soulignant la nécessité d'un modèle reproductible des petits animaux afin d'étudier la formation et la thérapie potentielle de cav.

Avec l'utilisation des modèles de transplantation aortique murine, les lésions de CAV comme peuvent être vues 4 semaines après transplantation. Ces lésions se composent principalement des cellules lisses vasculaires de muscle, ainsi ressemblant à la pathologie humaine. En raison d'une grande variété de souris transgéniques et assomées, l'utilisation de modèles de souris dans les pathologies associées à la transplantation offre une occasion unique d'identifier de nouvelles options thérapeutiques et de comprendre leur développement. En raison du petit diamètre des vaisseaux transplantés cependant, l'utilisation de modèles de souris est généralement associée à de longues courbes d'apprentissage et un taux de complication élevé initial⁹. Avec l'introduction de la technique de manchette non-suture, cette partie la plus difficile de l'opération peut être facilitée et le diamètre de l'anastomose est maintenu constant^10,11.

Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives de la loi allemande sur le bien-être animal (TierSchG.) (AZ: 55.2-1-54-2532.Vet_02-80-2015).

1. Logement pour animaux

1. Pour les expériences, utilisez des souris mâles C57BL/6 et BALB/c pesant 20-25 g avec des souris C57BL/6 comme animaux receveurs et des souris BALB/c comme animaux donneurs.
2. Acheter les animaux et la maison dans une installation exempte d'agents pathogènes, conformément aux lignes directrices felASA pour la surveillance de la santé¹².
3. Gardez les souris dans des cages Makrolon standard avec du matériel de nidance d'enrichissement. Fournir un accès ad libitum à l'eau et aux granulés à un cycle jour/nuit de 12 h.
4. Maintenir la température ambiante à 22 o2 oC et l'humidité relative à 55 à 5 %.

2. Préparation du receveur

1. Tout d'abord, anesthésier l'animal receveur (C57BL/6) avec une injection intrapéritonéale de midazolam (5 mg/kg; 5 mg/mL), de médetomidine (0,5 mg/kg; 1 mg/mL) et de fentanyl (0,05 mg/kg; 0,05 mg/mL).
   REMARQUE: La profondeur correcte de l'anesthésie doit être atteinte en 5-10 min.
   1. Pincez les pieds postérieurs avec des forceps pour vérifier les réflexes pour confirmer la profondeur de l'anesthésie.
2. Clip tous les cheveux de la région latérale cervicale avec une tondeuse à cheveux électrique pour les petits animaux et appliquer onduleur ophtalmique avec des cotons-tiges pour empêcher les yeux de se dessécher pendant la procédure.
3. Placez l'animal en position de supine sur un coussin chauffant sous le microscope et collez doucement ses jambes à la table d'opération avec des bandes de plâtre sensibles à la peau.
4. Inclinez sa tête en arrière et frottez le champ opératoire plusieurs fois avec de l'alcool.
5. Faire une incision de la peau de l'incision jugulaire à la mandibule inférieure droite avec de petits ciseaux.
6. Enlever le lobe inférieur droit de la glande submandibulaire par cautérisation bipolaire du pédicle du vaisseau et excision subséquente avec des microscissors.
7. Enlever le muscle sternocleidomastoid droit par l'intermédiaire de la cautérisation bipolaire de la partie supérieure et inférieure et l'excision suivante avec des microscissors pour accéder à l'artère carotide commune.
8. Mobiliser l'artère carotide commune aussi loin distally et proximally que possible en tirant le tissu conjonctif environnant à part avec des forceps fins.
9. Attachez deux ligatures de soie 7-0 avec une distance minimale entre chacun e au milieu de l'artère carotide commune et transectez l'artère carotide commune avec de fines microcise entre les ligatures.
10. Passer l'extrémité proximale et ligatée à travers le brassard et le fixer avec une petite pince d'artère.
    REMARQUE : Les poignets qui ont été employés dans cette procédure ont été coupés avec des microscissors des tubes de polyimide avec un diamètre externe de 0.610 millimètres et une épaisseur de mur de 0.0254 millimètres. Les poignets terminés avaient une longueur de 2 mm avec une moitié, qui est utilisé pour le processus de manchette, étant un cylindre complet et l'autre moitié, qui est serré, étant un demi-cylindre.
11. Retirer la ligature avec de fines microscissors, aussi près de la ligature que possible, et rincer le lumen avec de la solution saline héparinisée (50 UI/mL) avec une aiguille de 30 G, tout en prenant soin de ne pas endommager les parois du navire.
12. Distendre le lumen ouvert à l'aide de dilatateurs vasculaires fins et evert la souche carotide sur le brassard en tirant doucement sur le tube de polyimide.
13. Fixer immédiatement la carotide everted avec une boucle de soie lâchement pré-lié 7-0.
    REMARQUE : Pré-attacher lâchement 4 boucles de soie 7-0 avec un diamètre d'environ 1,5 mm avant la chirurgie pour rendre le mechon-procédure plus lisse et plus facile.
14. Effectuer la même procédure (2.10-2.13) à l'autre extrémité de l'artère carotide.
15. Mettre l'animal receveur de côté et hydrater le champ opératoire avec saline jusqu'à ce que le segment aortique soit explanté.

3. Opération des donateurs

1. Anesthésiez la souris donneuse (BALB/c) de la même manière que l'animal receveur.
   1. Pincez les pieds postérieurs avec des forceps pour vérifier s'il y a des réflexes pour confirmer une anesthésie suffisante.
2. Clip tous les cheveux de la région abdominale et thoracique avec une tondeuse à cheveux électrique pour les petits animaux et appliquer onduleur ophtalmique avec des cotons-tiges pour empêcher les yeux de se dessécher pendant la procédure.
3. Placez l'animal en position de supine sur un coussin chauffant sous le microscope et collez doucement ses jambes à la table d'opération avec des bandes de plâtre sensibles à la peau.
4. Frotter le champ opératoire plusieurs fois avec de l'alcool.
5. Effectuer une laparotomie abdominale de milieu de ligne avec de petits ciseaux et pousser les intestins légèrement vers le haut pour exposer le cava de veine inférieure (IVC).
6. Injecter le veau cava inférieur (IVC) avec 1 ml de saline héparinisée à l'aide d'une aiguille de 30 G.
7. Couper l'aorte abdominale et l'IVC sous les artères rénales avec de petits ciseaux pour exsanguiner l'animal donneur. Placez lâchement une compresse dans l'abdomen pour absorber le sang.
8. Effectuer une thoracotomie à la diversion bilatérale des côtes avec des ciseaux et incliner la paroi thoracique antérieure cranially avec une pince chirurgicale pour exposer le mediastinum.
9. Couper l'IVC et l'œsophage directement au-dessus du diaphragme avec des microscissors.
10. Retirez le cœur et les poumons en les inclinant vers le haut avec des forceps tenant la coupe IVC/oesophage, puis en les excisant avec des microscissors de leur base pour accéder à l'aorte thoracique dans le médistinum dorsal.
11. Mobilisez l'aorte thoracique de son tissu environnant en détachant le tissu conjonctif environnant et la graisse avec des forceps fins tout en prenant soin de ne pas endommager les artères intercostales.
12. Catériser toutes les branches de l'aorte thoracique avec des forceps de cautérisation bipolaires et exciser le segment aortique entre le diaphragme et l'arc aortique à l'aide de microscissors.
13. Rincer le segment aortique excisé avec une saline héparinisée avec une aiguille de 30 G, tout en prenant soin de ne pas endommager les parois des vaisseaux, d'enlever le sang ou les caillots restants, et de transférer la greffe à l'animal receveur.
    REMARQUE : Placez directement la greffe aortique dans la position à peu près droite dans le receveur pendant le transfert. S'il y a des problèmes confondant les différentes extrémités de la greffe dans l'animal destinataire, une ligature lâche autour de l'extrémité distale pourrait aider.

4. Implantation

1. Tirez l'extrémité proximale du segment aortique de distributeur au-dessus du brassard proximal sur le dessus de l'artère carotide everted avec les forceps fins et fixez-le immédiatement avec une boucle de soie lâchement pré-liée 7-0.
2. Couper l'extrémité distale et libre de la greffe aortique avec des microscissors de sorte que la longueur de greffe s'adapte à la distance entre les deux poignets.
3. Répétez l'étape 4.1 à l'autre extrémité de l'aorte avec l'autre brassard pour compléter l'anastomose.
4. Retirer la pince distale pour permettre la perfusion rétrograde.
5. Après avoir atteint l'hémostase, retirez la pince proximale pour compléter l'anastomose.
6. Enfin, fermez la plaie avec une suture continue de 6-0.

5. Soins postopératoires

1. Surveillez la souris de près dans les 6 premiers h après l'opération, puis plusieurs fois par jour pendant les 72 premières heures après la transplantation pour détecter les complications instantanément.
2. Pour l'analgésie postopératoire, injectez la souris transplantée avec de la buprénorphine (0,05-0,1 mg/kg) sous-cutanée directement après la transplantation, puis toutes les 12 h pendant 72 h pour fournir une analgésie appropriée et à long terme.

6. Explications de greffe aortique

1. Anesthésiez l'animal transplanté avec une injection intrapéritonéale de midazolam (5 mg/kg; 5 mg/mL), de médétomicine (0,5 mg/kg; 1 mg/mL) et de fentanyl (0,05 mg/kg; 0,05 mg/mL) 4 semaines après la transplantation.
   1. Pincez les pieds postérieurs avec des forceps pour vérifier s'il y a des réflexes pour confirmer une anesthésie suffisante.
2. Clip tous les cheveux de la région abdominale, thoracique et cervicale avec une tondeuse à cheveux électrique pour les petits animaux.
3. Placez l'animal en position de supine sur un coussin chauffant sous le microscope et collez doucement ses jambes à la table d'opération avec des bandes de plâtre sensibles à la peau.
4. Frotter le champ opératoire plusieurs fois avec de l'alcool.
5. Effectuer une laparotomie abdominale de milieu de ligne avec de petits ciseaux et pousser les intestins légèrement vers le haut pour exposer le cava de veine inférieure (IVC).
6. Injecter le veau cava inférieur (IVC) avec 1 ml de saline héparinisée à l'aide d'une aiguille de 30 G.
7. Couper l'aorte abdominale et l'IVC sous les artères rénales avec de petits ciseaux pour exsanguiner l'animal donneur. Placez lâchement une compresse dans l'abdomen pour absorber le sang.
8. Faire une incision de la peau de l'incision jugulaire à la mandibule inférieure droite avec de petits ciseaux correspondant à l'incision de la peau faite au cours de la procédure de transplantation.
9. Identifiez la greffe aortique transplantée avec le brassard distal et proximal et enlevez tout tissu environnant avec des forceps.
10. À l'aide de microscissors, couper à travers l'artère carotide commune distale et proximale à la greffe aortique avec les poignets afin d'explanter la greffe aortique avec les deux extrémités de manchette.
11. Couper le segment aortique en deux et conserver les spécimens pour d'autres analyses (sections congelées, sections encastrées de paraffine, matériau^{congelé) 13,14}.

Résultats

Dans le modèle de transplantation entièrement MHC-inmatch, une couche néointimale concentrique peut être vue 4 semaines après la transplantation (figure 2). Cette couche se compose principalement des cellules musculaires lisses vasculaires comme coloration immunohistologique pour SM22 (un marqueur sélectif pour les cellules musculaires lisses vasculaires mûres) indiquée. Comme indiqué précédemment, ces cellules musculaires lisses vasculaires sont pathognomoniques pour des lésions...

Discussion

La vasculopathie chronique d'allograft est la cause principale de la perte en retard de greffe après la transplantation pleine d'organe du coeur et les allogreffes rénales et pulmonaires probables^8. Jusqu'ici, aucun régime thérapeutique causal n'a pu être développé afin d'empêcher la formation de CAV.

La physiopathologie du CAV est multifactorielle et implique des aspects immunologiques et non immunologiques¹⁶. L'utilisation de modèles d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balb-c Mice (H2-d)	Charles River	Strain# 028	Donor animal
Bipolar cautery system	ERBE	ICC 50 / 20195-023	Bipolar cautery
C57BL/6J (H-2b)	Charles River	Strain# 027	Recipient animal
Halsey Needle Holders	FST	12501-12	Needle Holder
Halsted-Mosquito Forceps	AESCULAP	BH111R	Curved Clamp
Medical Polyimide Tubing	Nordson MEDICAL	141-0031	Cuff-Material
Micro Serrefines	FST	18055-04	Micro Vessel Clip
Micro-Adson Forceps (serrated)	FST	11018-12	Standard Forceps
Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps	FST	18057-14	Clipapplicator
S&T Forceps - SuperGrip Tips (Angled 45°)	S&T	00649-11	Fine Forceps
S&T Vessel Dilating Forceps - Angled 10° (Tip diameter 0.2 mm)	S&T	00125-11	Vesseldilatator
Schott VisiLED Set	Schott	MC 1500 / S80-55	Light
Stereoscopic microscope	ZEISS	SteREO Discovery.V8	Microscope
Student Fine Scissors / Surgical Scissors - Sharp-Blunt	FST	91460-11 / 14001-12	Standard Sissors
Vannas-Tübingen Spring Scissors (curved, 8.5 cm)	FST	15004-08	Microsissors (curved)
Vannas-Tübingen Spring Scissors (straight, 8.5 cm)	FST	15003-08	Microsissors (straight)