Modifiye Dikişsiz Manşet Tekniği Kullanılarak Murine Servikal Aort Transplantasyon Modeli

Özet

Burada servikal mürin modelinde sütür olmayan manşet tekniği ni kullanarak farelerde heterotopik aort transplantasyonu protokolünü salıyoruz. Bu model kronik allogreft vaskülopatinin (CAV) altta yatan patolojisini incelemek için kullanılabilir ve oluşumunu önlemek için yeni terapötik ajanların değerlendirilmesine yardımcı olabilir.

Özet

Güçlü immünsupresif protokollerin devreye girmesiyle akut ret ataklarının önlenmesi ve tedavisinde belirgin ilerlemeler mümkündür. Ancak, nakledilen katı organların uzun vadeli sonuçlarında son on yıllarda sadece küçük bir iyileşme gözlemlenebilir. Bu bağlamda kronik allogreft vaskülopati (CAV) kardiyak, renal ve pulmoner transplantasyonda geç organ yetmezliğinin en önemli nedenidir.

Şimdiye kadar, CAV gelişiminin altında yatan patogenezi belirsizliğini koruyor, etkili tedavi stratejilerinin neden şu anda eksik olduğunu açıklamak ta ve altta yatan patofizyolojiyi incelemek için ilgili deneysel modellere ihtiyaç duyulduğunu vurgulamak CAV oluşumu. Aşağıdaki protokol, modifiye edilmiş dikişsiz manşet tekniği kullanılarak bir murine heterotopik servikal aort transplantasyon modelini tanımlamaktadır. Bu teknikte, torasik aort bir segment sağ ortak karotis arter interpositioned. Dikişsiz manşet tekniğinin kullanımı ile, kolay öğrenilebilir ve tekrarlanabilir bir model oluşturulabilir, dikişli vasküler mikro anastomozların olası heterojenliği en aza indirerek.

Giriş

Son 60 yılda, katı organ nakli deneysel bir prosedürden son dönem organ^yetmezliğinin tedavisi için bir bakım standardına evrilmiştir 1. Antimikrobiyal ajanların iyileştirilmesi, cerrahi teknikler ve immünsupresif alaylarda ilerleme nedeniyle, katı organ naklinin erken başarı oranı son yıllarda önemli ölçüde artmıştır².

Ancak, uzun vadeli greft sağkalım oranları önemli ölçüde aynı şekilde iyileşmemiştir³. CAV gelişimi uzun süreli sağkalım sınırlayan önemli^{faktördür 4,5,6}. Bu patoloji, düz kas hücrelerinden oluşan konsantrik bir neointimal tabaka oluşumu ile karakterizedir, damar ın ilerleyici daralma ve nakledilen katı organın ardışık malperfüzyonyol. Kalp nakli alıcılarında, TRANSPLANTASYONdan 3 yıl sonra hastaların %75'inde CAV lezyonları teşhis edilebilir⁷.

CAV patofizyolojisi henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çok sayıda immünolojik ve immünolojik olmayan faktörler ile ilgili gibi görünüyor, sonraki endotel aktivasyonu ve disfonksiyon ile endotel hasarına yol açan⁸. Cav'ın oluşumunu ve potansiyel tedavisini incelemek için tekrarlanabilir küçük hayvan modeline ihtiyaç duyulduğunu vurgulayarak, CAV'nin önlenmesi için şimdiye kadar nedensel tedavi seçeneği bulunmamaktadır.

Murine aort transplantasyon modellerinin kullanımı ile transplantasyondan 4 hafta sonra cav benzeri lezyonlar görülebilir. Bu lezyonlar esas olarak vasküler düz kas hücrelerinden oluşur, bu nedenle, insan patolojisini andıran. Çok çeşitli transgenik ve nakavt fareler nedeniyle, nakil ile ilişkili patolojilerde fare modellerinin kullanımı yeni tedavi seçeneklerini belirlemek ve gelişimlerini anlamak için eşsiz bir fırsat sunar. Ancak nakledilen damarların küçük çapı nedeniyle, fare modellerinin kullanımı genellikle uzun öğrenme eğrileri ve ilk yüksek komplikasyon oranı ile ilişkilidir⁹. Dikişsiz manşet tekniğinin devreye girmesiyle operasyonun bu en zorlu kısmı kolaylaşabilir ve anastomozun çapı^10,11sabit tutulur.

Protokol

Tüm deneyler Alman hayvan refahı yasasının (TierSchG.) kurallarına göre yapılmıştır. (AZ: 55.2-1-54-2532.Vet_02-80-2015).

1. Hayvan muhafazası

1. Deneyler için, erkek C57BL/6 ve BALB/c fareleri 20-25 g ağırlığında C57BL/6 fareleri alıcı hayvanlar olarak, BALB/c farelerini ise donör hayvan olarak kullanın.
2. Sağlık izleme için FELASA yönergeleri uyarınca, bir bariyer patojen içermeyen tesiste hayvan ve ev satın alın¹².
3. Zenginleştirme malzemesi ile standart Makrolon kafeslerde fareler tutun. 12 saatlik bir gündüz/gece döngüsünde suya ve peletli yiyeceklere reklam libitum erişimi sağlayın.
4. Oda sıcaklığını 22 ± 2°C'de, bağıl nemi %55 ± %5'te koruyun.

2. Alıcı nın hazırlanması

1. İlk olarak, midazolam (5 mg/kg; 5 mg/mL), medetomidin (0.5 mg/kg; 1 mg/mL) ve fentanil (0.05 mg/kg; 0.05 mg/mL) intraperitoneal enjeksiyonu ile alıcı hayvanı (C57BL/6) anestezik.
   NOT: Anestezinin doğru derinliğine 5-10 dk içinde ulaşılmalıdır.
   1. Anestezi derinliğini doğrulamak için refleksleri kontrol etmek için forseps ile arka ayakları çimdik.
2. Küçük hayvanlar için elektrikli bir saç makası ile servikal lateral bölgenin tüm saç klip ve işlem sırasında kurumasını gözleri önlemek için pamuklu bez ile oftalmik merhem uygulayın.
3. Mikroskop altında bir ısıtma yastığı üzerinde bir supine pozisyonda hayvan yerleştirin ve yavaşça cilde duyarlı alçı şeritler ile ameliyat masasına bacaklarını bantlayın.
4. Başını geriye doğru eğve ameliyat alanını birkaç kez alkolle temizleyin.
5. Küçük makas ile sağ alt mandibula juguler kesi bir deri kesi olun.
6. Submandibular bezin sağ alt lob damar pedikül ve mikroskalsaz ile sonraki eksizyon bipolar cautery ile çıkarın.
7. Üst ve alt kısmı bipolar kateter ve mikroskassors ile sonraki eksizyon ile ortak karotis arter erişim elde etmek için sağ sternokleidomastoid kas çıkarın.
8. Çevredeki bağ dokusunu ince prupler ile ayırarak ortak karotis arteri mümkün olduğunca distal ve proksimal olarak harekete geçirin.
9. Ortak karotis arterin ortası etrafında her biri arasında en az mesafe ile iki 7-0 ipek ligatür kravat ve ligatürler arasında ince mikroskssors ile ortak karotis arter transect.
10. Proksimal geçirin, manşet yoluyla ligated uç ve küçük bir arter kelepçe ile düzeltmek.
    NOT: Bu işlemde kullanılan manşetler, poliimid tüplerinden 0.610 mm dış çapı ve 0.0254 mm duvar kalınlığı ile mikrosasörler ile kesilmiştir. Tamamlanmış manşetlerin bir yarısı ile ~2 mm uzunluğunda, hangi kelepçe işlemi için kullanılan, tam silindir ve diğer yarısı, hangi kelepçeli olmak, yarım silindir olmak.
11. Ligatürü mümkün olduğunca ligatüre yakın ince mikroskalatörlerle çıkarın ve lümeni 30 G iğneyle heparinize salin (50 IU/mL) ile yıkayın ve damar duvarlarına zarar vermemeye özen gösteriyor.
12. İnce vasküler dilatatörler kullanarak açık lümeni ayırın ve poliimid tüpün üzerine hafifçe çekerek karotis kütüğünün üzerine yerleştirin.
13. Hemen gevşek önceden bağlı 7-0 ipek döngü ile everted karotis düzeltmek.
    NOT: Ameliyat öncesi çapı yaklaşık 1,5 mm olan gevşek ön kravat 4 7-0 ipek döngüler kelepçeleme işlemini daha sorunsuz ve kolay hale getirmek için.
14. Karotis arterin diğer ucunda aynı işlemi (2.10-2.13) yapın.
15. Alıcı hayvanı bir kenara koyun ve aort segmenti ekilene kadar ameliyat alanını tuzlu su yla nemlendirin.

3. Donör operasyonu

1. Donör fareyi (BALB/c) alıcı hayvanla aynı şekilde anesthetize edin.
   1. Yeterli anestezi onaylamak için refleksleri kontrol etmek için forseps ile arka ayakları çimdik.
2. Küçük hayvanlar için elektrikli saç makası ile karın ve torasik bölgenin tüm saçlarını kırpın ve işlem sırasında gözlerin kurumasını önlemek için pamuklu bezlerle oftalmik merhem uygulayın.
3. Mikroskop altında bir ısıtma yastığı üzerinde bir supine pozisyonda hayvan yerleştirin ve yavaşça cilde duyarlı alçı şeritler ile ameliyat masasına bacaklarını bantlayın.
4. Ameliyat alanını birkaç kez alkolle temizleyin.
5. Küçük makas ile orta hat abdominal laparotomi yapın ve inferior vena kava (IVC) ortaya çıkarmak için biraz yukarı bağırsak itin.
6. 30 G iğne kullanarak 1 mL heparinize tuzlu su ile inferior vena kava (IVC) enjekte edin.
7. Donör hayvan exsanguinate küçük makas ile renal arterlerin altında abdominal aort ve IVC kesin. Gevşek kan emmek için karın içine bir kompres yerleştirin.
8. Makas ile kaburga ikili saptırma bir torakotomi yapmak ve mediasten ortaya çıkarmak için cerrahi bir kelepçe ile ön göğüs duvarı cranially tilt.
9. Mikrosksors ile diyafram ın hemen üzerinde IVC ve yemek borusu kesin.
10. Kesilen IVC/yemek borusunu tutan forceplarla yukarı doğru yatırarak kalbi ve akciğerleri çıkarın ve sonra da dorsal mediastendeki torasik aorta erişmek için tabanından mikrosiküllü olarak çıkarın.
11. Herhangi bir interkostal arterlere zarar vermemeye dikkat ederken çevreleyen bağ dokusu ve yağ ince forceps ile ayırarak çevresindeki dokudan torasik aort seferber.
12. Bipolar kapasitör forceps ile torasik aort tüm dalları cauterize ve mikroskalaz kullanarak diyafram ve aort kemer arasındaki aort segmentini çıkarmak.
13. 30 G iğne ile heparinize salin ile excisized aort segmentini flush, damar duvarlarına zarar vermemeye dikkat ederken, kalan kan veya pıhtıları kaldırmak için, ve alıcı hayvana greft transferi.
    NOT: Akort greftini doğrudan alıcının doğru pozisyonuna aktarın. Alıcı hayvanda greftin farklı uçlarını karıştıran sorunlar varsa, distal uç etrafında gevşek bir bağ yardımcı olabilir.

4. İmplantasyon

1. Donör aort segmentinin proksimal ucunu, ince çiller ile everted karotis arterin üstündeki proksimal manşetin üzerine çekin ve hemen önceden bağlanmış 7-0 ipek halkası ile düzeltin.
2. Distal, mikrosikül ile aort greftserbest ucunu böylece greft uzunluğu iki manşet arasındaki mesafe sığar kırpın.
3. Anastomoz tamamlamak için diğer manşet ile aort diğer ucunda adım 4.1 tekrarlayın.
4. Retrograd perfüzyona izin vermek için distal kelepçeyi çıkarın.
5. Hemostaz elde ettikten sonra, anastomoz tamamlamak için proksimal kelepçe kaldırın.
6. Son olarak, 6-0 sürekli dikiş ile yara kapatın.

5. Ameliyat sonrası bakım

1. Operasyondan sonra ilk 6 saat içinde fareyi yakından izleyin ve daha sonra transplantasyondan sonra ilk 72 saat için günde birkaç kez anında herhangi bir komplikasyon tespit etmek için.
2. Postoperatif analjezi için nakledilen fareye transplantasyondan hemen sonra buprenorfin (0.05-0.1 mg/kg) deri altına enjekte edin ve daha sonra her 12 saat 72 saat için uygun, uzun süreli analjezi sağlayın.

6. Aort greft açıklamaları

1. Transplantasyondan 4 hafta sonra nakledilen hayvanı intraperitoneal midazolam (5 mg/kg; 5 mg/mL), medetomidin (0.5 mg/kg; 1 mg/mL) ve fentanil (0.05 mg/kg; 0.05 mg/mL) intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezik.
   1. Yeterli anestezi onaylamak için refleksleri kontrol etmek için forseps ile arka ayakları çimdik.
2. Küçük hayvanlar için elektrikli saç makası ile karın, torasik ve servikal bölgenin tüm saç klip.
3. Mikroskop altında bir ısıtma yastığı üzerinde bir supine pozisyonda hayvan yerleştirin ve yavaşça cilde duyarlı alçı şeritler ile ameliyat masasına bacaklarını bantlayın.
4. Ameliyat alanını birkaç kez alkolle temizleyin.
5. Küçük makas ile orta hat abdominal laparotomi yapın ve inferior vena kava (IVC) ortaya çıkarmak için biraz yukarı bağırsak itin.
6. 30 G iğne kullanarak 1 mL heparinize tuzlu su ile inferior vena kava (IVC) enjekte edin.
7. Donör hayvan exsanguinate küçük makas ile renal arterlerin altında abdominal aort ve IVC kesin. Gevşek kan emmek için karın içine bir kompres yerleştirin.
8. Nakil işlemi sırasında yapılan deri kesisine karşılık gelen küçük makaslarla sağ alt mandibulaya kadar juguler kesiden bir deri kesisi yapın.
9. Nakledilen aort greftini distal ve proksimal manşet ile birlikte belirleyin ve protekps ile çevredeki dokuyu künt olarak çıkarın.
10. Mikrosksörler kullanarak, iki manşet uçları ile birlikte aort greft imal etmek için manşet ile aort grefti ile ortak karotis arter distal ve proksimal ile kesip.
11. Aort segmentini ikiye kesin ve numuneleri daha fazla analiz için koruyun (dondurulmuş bölümler, parafin gömülü kesitler, dondurulmuş malzemeyi koparın)^13,14.

Sonuçlar

Tam MHC-uyumsuzluk transplantasyonu modelinde, transplantasyondan 4 hafta sonra eşmerkezli neointimal tabaka görülebilir(Şekil 2). Bu tabaka öncelikle sm22 için immünohistolojik boyama olarak vasküler düz kas hücrelerinden oluşur (olgun vasküler düz kas hücreleri için seçici bir belirteç) ortaya. Daha önce de belirtildiği gibi, bu vasküler düz kas hücreleri kronik allograft vaskülopati görülen lezyonlar için patoognomonik vardır. Daha fazla analiz için, aort segme...

Tartışmalar

Kronik allogreft vaskülopati kalp ve muhtemel böbrek ve akciğer allogreftlerinin solid organ nakli sonrası geç greft kaybının başlıca nedenidir⁸. Cav oluşumunu önlemek için şimdiye kadar nedensel terapötik rejim geliştirilememiştir.

CAV patofizyolojisi multifaktöriyel ve immünolojik ve immünolojik olmayan yönleri içerir¹⁶. Transplantasyonda kemirgen modellerinin kullanımı, solid organ naklinde allogreft ret süreçlerinin a...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balb-c Mice (H2-d)	Charles River	Strain# 028	Donor animal
Bipolar cautery system	ERBE	ICC 50 / 20195-023	Bipolar cautery
C57BL/6J (H-2b)	Charles River	Strain# 027	Recipient animal
Halsey Needle Holders	FST	12501-12	Needle Holder
Halsted-Mosquito Forceps	AESCULAP	BH111R	Curved Clamp
Medical Polyimide Tubing	Nordson MEDICAL	141-0031	Cuff-Material
Micro Serrefines	FST	18055-04	Micro Vessel Clip
Micro-Adson Forceps (serrated)	FST	11018-12	Standard Forceps
Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps	FST	18057-14	Clipapplicator
S&T Forceps - SuperGrip Tips (Angled 45°)	S&T	00649-11	Fine Forceps
S&T Vessel Dilating Forceps - Angled 10° (Tip diameter 0.2 mm)	S&T	00125-11	Vesseldilatator
Schott VisiLED Set	Schott	MC 1500 / S80-55	Light
Stereoscopic microscope	ZEISS	SteREO Discovery.V8	Microscope
Student Fine Scissors / Surgical Scissors - Sharp-Blunt	FST	91460-11 / 14001-12	Standard Sissors
Vannas-Tübingen Spring Scissors (curved, 8.5 cm)	FST	15004-08	Microsissors (curved)
Vannas-Tübingen Spring Scissors (straight, 8.5 cm)	FST	15003-08	Microsissors (straight)