מורי צוואר הרחם מורנה השתלת מודל באמצעות שינוי שאינו תפר שיטה השרוול

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול של הטרוסקסואלים השתלת אבי העורקים בעכברים באמצעות שימוש בטכניקת השרוול שאינו תפר במודל מורטין הצווארי. מודל זה יכול לשמש כדי ללמוד את הפתולוגיה הבסיסית של השתלת האלופתיה כרונית (קו) והוא יכול לעזור להעריך סוכנים רפואיים חדשים כדי למנוע את הקמתה.

Abstract

עם המבוא של פרוטוקולים מדכאים חיסוני חזק, מקדמות נפרדות אפשריות במניעה וטיפול של פרקים דחייה חריפה. עם זאת, רק שיפור מינורי בתוצאות לטווח ארוך של איברים מוצקים מושתלים ניתן לצפות בעשורים האחרונים. בהקשר זה, השתלת האלופתיה כרונית (קו) עדיין מייצגת את הגורם המוביל לכשל איברים מאוחר בניתוחי לב, כליות וריאות.

עד כה, הפתוגנזה הבסיסית של התפתחות ה-קו לא ברור, המסביר מדוע אסטרטגיות הטיפול היעילות חסרות כרגע ומדגישים את הצורך במודלים ניסיוניים רלוונטיים כדי ללמוד את הפתופסיולוגיה הבסיסית המובילה ל . מערך קו הפרוטוקול הבא מתאר מודל הטרוההטרוסקסואלים הצוואר הרחם השתלת המודל באמצעות טכניקת שונה תפר השרוול. בטכניקה זו, קטע של העורקים הבית החזה הוא ממוקם בתוך העורק הראשי הנכון העורק. עם שימוש בטכניקת השרוול שאינו תפר, קל ללמוד ולאפשר מודל ניתן ליצור, למזער את הטרוגניות האפשרי של מיקרו מיקרוסטוסים כלי דם מסושמים.

Introduction

במהלך ששת העשורים האחרונים, השתלת איברים מוצק התפתחה מהליך ניסיוני לתקן של טיפול לטיפול של כשל איבר בשלב הסופי¹. בשל שיפור של סוכנים מיקרוביאלית, טכניקות כירורגי וקידום הגדודים מדכאים, שיעור ההצלחה המוקדמת של השתלת איברים מוצק הוגדלה באופן משמעותי במהלך העשורים האחרונים².

עם זאת, שיעורי ההישרדות לטווח ארוך לא השתפר באופן משמעותי באותו אופן³. התפתחות קו הוא הגורם העיקרי הגבלת הישרדות לטווח ארוך^4,5,6. פתולוגיה זו מתאפיינת היווצרות של שכבה מרכזית המורכבת של תאים שריר חלק, המוביל היצרות מתקדמת של הכלי ואת malperfusion ברציפות של האיבר המוצק מושתלים. ב השתלות לב המטופלים, נגעים קו ניתן לאבחן עד 75% מהחולים 3 שנים לאחר השתלת⁷.

. הפתופסולוגיה של קו-קו עדיין לא מובן לגמרי זה נראה קשור לגורמים אימונולוגיים ושאינם אימונולוגיים רבים, המובילים לנזק אנדותל עם הפעלה אנדותל הבאים בתפקוד בלתי מתפקדים⁸. עד כה, לא קיימת אפשרות טיפול סיבתי למניעת קו, ומדגיש את הצורך במודל בעל חיים קטן שהוא מהווה כדי ללמוד את היווצרות והטיפול הפוטנציאלי של קו.

עם שימוש במודלים השתלת אבי העורקים murine, קו כמו נגעים ניתן לראות 4 שבועות לאחר ההשתלה. נגעים אלה מורכבים בעיקר של תאי שריר וסקולריים חלקה, ובכך, דמוי הפתולוגיה האנושית. בגלל מגוון רחב של טרנסגניים לנקוש עכברים, השימוש במודלים העכבר בפתווגיות הקשורות להשתלות מציע הזדמנות ייחודית לזהות אפשרויות טיפוליות חדשות ולהבין את התפתחותם. בשל הקוטר הקטן של כלי הושתל עם זאת, השימוש במודלים העכבר משויך בדרך כלל עם עקומות למידה ארוכות ושיעור התחלתי בסיבוך גבוה⁹. עם המבוא של טכניקת השרוול שאינה תפר, החלק המאתגר ביותר של המבצע ניתן להקל וקוטר ההשקה נשמר באופן קבוע^10,11.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות החוק לרווחת בעלי חיים בגרמניה (טישלג). (AZ: 55.2-1-54-2532. Vet_02-80-2015).

1. דיור בעלי חיים

1. עבור ניסויים, השימוש זכר C57BL/6 ו-BALB/c עכברים במשקל 20-25 g עם C57BL/6 עכברים כמו חיות הנמען ועכברים BALB/c כמו חיות התורם.
2. לרכוש את בעלי החיים ואת הבית במתקן הפתוגן מכשול חינם, בהתאם הנחיות FELASA לניטור בריאות¹².
3. שמרו את העכברים בכלובים סטנדרטיים מסוג Makrolon עם חומר קינון העשרה. מספקים גישה למים מתוך המודעה ומגישים אוכל ביום/לילה במחזור של 12 שעות.
4. שמרו על טמפרטורת החדר ב -22 ± 2 ° c והלחות היחסית ב 55 ± 5%.

2. הכנת הנמען

1. ראשית, מורדם בעלי חיים של המטופל (C57BL/6) עם הזרקת הצפק של midazolam (5 מ"ג/ק"ג; 5 מ"ג/mL), medetomidin (0.5 מ"ג/ק"ג; 1 מ"ג/mL) ו פנטניל (0.05 מ"ג/ק"ג; 0.05 mg/mL).
   הערה: העומק הנכון של ההרדמה צריך להגיע ב5-10 דקות.
   1. לצבוט את הרגליים האחוריות עם מלקחיים כדי לבדוק רפלקסים כדי לאשר את עומק ההרדמה.
2. קליפ את כל השיער של האזור לרוחב צוואר הרחם עם קוצץ שיער חשמלי עבור בעלי חיים קטנים ולהחיל משחה אופטלמולוגית עם מטליות כותנה כדי למנוע את העיניים מייבוש במהלך ההליך.
3. מניחים את החיה בתנוחה פרקדן על משטח חימום מתחת למיקרוסקופ ולהקליט בעדינות את רגליה לשולחן הניתוח עם רצועות גבס רגישות לעור.
4. הטה את ראשו לאחור וקרצף את השדה הפעיל מספר פעמים עם אלכוהול.
5. לחתוך את העור מחתך הצוואר ללסת התחתונה הימנית עם מספריים קטנים.
6. הסירו את האונה התחתונה הימנית של בלוטת הלסת-התחתונה באמצעות כריתה דו קוטבית של כלי הקיבול וההסרה העוקבת עם מיקרו-מספריים.
7. הסר את שריר השריר הימני באמצעות קאטרי דו קוטבית של החלק העליון והתחתון ולאחר ההסרה עם מיקרו מספריים כדי לקבל גישה לעורק הראשי המשותף.
8. לגייס את העורק הראשי המשותף כמו באופן מוגזם ובלתי מקובל ככל האפשר על ידי משיכת רקמת החיבור שמסביב לגזרים עם מלקחיים עדינים.
9. לקשור שני 7-0 ליגטורות משי עם מרחק מינימלי בין כל אחד סביב באמצע העורק הראשי המשותף והעברה של עורק הראש המשותף עם מיקרו מספריים בסדר בין ליגטורות.
10. לעבור את הבית, להעביר את הקצה דרך השרוול ולתקן אותו עם מהדק עורק קטן.
    הערה: האזיקים ששימשו בהליך זה נחתכו עם מיקרומספריים מצינורות של פולאימיד עם קוטר חיצוני של 0.610 מ"מ ועובי דופן של 0.0254 מ"מ. האזיקים שהושלמו היו באורך של ~ 2 מ"מ עם חצי אחד, אשר משמש לתהליך סטירות להיות גליל מלא והחצי השני, אשר מהודק, להיות חצי גליל.
11. הסר את הקשירה עם מיקרו מספריים עדינים, קרוב לקשירה ככל האפשר, ולשטוף את לומן עם מלוחים heparinized (50 IU/mL) עם מחט של 30 גרם, תוך הקפדה לא לפגוע קירות כלי.
12. Distend לומן פתוח באמצעות מכשיר משובח כלי דם ו אוורט הגדם העורק על השרוול על ידי משיכת אותו בעדינות מעל צינור פוליאימיד.
13. מיד לתקן את העורק העורקי עם לולאה מראש בצורה רופפת 7-0 משי.
    הערה: באופן רופף לפני עניבה 4 7-0 לולאות משי עם קוטר של כ 1.5 מ"מ לפני הניתוח כדי להפוך את cuאזיא-ההליך חלקה וקלה.
14. בצע את אותו ההליך (2.10-2.13) בקצה השני של העורק הראשי.
15. הנח את בעל החיים המטופל בצד ולחות על השדה הפעיל עם תמיסת מלח עד שקטע אבי העורקים ההסבר.

3. מבצע תורם

1. הללו את עכבר התורם (BALB/c) באותה צורה של בעל החיים של המטופל.
   1. לצבוט את הרגליים האחוריות עם מלקחיים כדי לבדוק רפלקסים כדי לאשר הרדמה מספקת.
2. קליפ כל השיער של אזור הבטן והחזה עם קוצץ שיער חשמלי לבעלי חיים קטנים ולהחיל משחה אופטלמולוגית עם כותנה למנוע את העיניים מייבוש במהלך ההליך.
3. מניחים את החיה בתנוחה פרקדן על משטח חימום מתחת למיקרוסקופ ולהקליט בעדינות את רגליה לשולחן הניתוח עם רצועות גבס רגישות לעור.
4. קרצף את השדה הפעיל. מספר פעמים עם אלכוהול
5. לבצע כריתת בטן לפני האמצע עם מספריים קטנים לדחוף את המעיים מעט כלפי מעלה כדי לחשוף את המורד הנמוך קאווה (IVC).
6. הכנס את האובורד הנחותים (IVC) עם 1 מ ל של מלוחים heparinized באמצעות מחט של 30 גרם.
7. חותכים את אבי העורקים הבטני ואת IVC מתחת לעורקים כליות עם מספריים קטנים כדי לדימום את החיה התורמת. מקום באופן רופף לדחוס לתוך הבטן כדי לספוג את הדם.
8. לבצע כריתת המעי הדו של הצלעות עם מספריים להטות את קיר החזה הקדמי בגולגולת עם מלחציים כירורגיים כדי לחשוף את mediastinum.
9. חותכים את ה-IVC ואת הוושט ישירות מעל הסרעפת עם מיקרו מספריים.
10. הסר את הלב ואת הריאות על ידי הטיית אותם כלפי מעלה עם מלקחיים המחזיקים את IVC לחתוך/הוושט ולאחר מכן מיקוד אותם עם מיקרומספריים מהבסיס שלהם כדי לקבל גישה העורקים החזה בתוך mediastinum.
11. לגייס את העורקים החזי מתוך הרקמה המקיפה שלו על ידי משיכת את רקמת החיבור שמסביב ושומן עם מלקחיים עדינים תוך הקפדה לא לפגוע כל העורקים הבינקורסטל.
12. לצרוב את כל הענפים מן העורקים החזי עם מלקחיים הקאטרי דו קוטבית ו בבלו קטע אבי העורקים בין הסרעפת ואת קשת אבי העורקים באמצעות מיקרו מספריים.
13. ריקון קטע אבי העורקים המגורש עם מלוחים heparinized עם מחט של 30 גרם, תוך הקפדה לא לפגוע בקירות כלי, כדי להסיר דם שנותר או קרישים, ולהעביר את השתל לבעל החיים המטופל.
    הערה: מניחים באופן ישיר את שתל אבי העורקים במיקום הנכון בערך בנמען במהלך ההעברה. אם יש בעיות מבלבלות את הקצוות השונים של השתל בעלי חיים הנמען, ליגטורה רופף סביב הקצה המרוחק יכול לעזור.

4. השרשה

1. משוך את הקצה העליון של קטע אבי העורקים של התורם על השרוול האבובית על גבי העורק הראשי everted עם מלקחיים עדינים ומיד לתקן אותו עם לולאה מראש באופן רופף לפני 7-0 משי.
2. חתוך את החלק המרוחק של שתל אבי העורקים עם מיקרו מספריים כך אורך השתל מתאים את המרחק בין שתי האזיקים.
3. חזור על שלב 4.1 בקצה השני של העורקים עם השרוול השני כדי להשלים את ההשקה.
4. הסר את התפס המרוחק כדי לאפשר הסרת היתוך.
5. לאחר השגת הומוקיפאון, הסר את המלחציים האבובי כדי להשלים את ההשקה.
6. לבסוף, לסגור את הפצע עם 6-0 תפר רציף.

5. טיפול פוסט-פעיל

1. נטר את העכבר מקרוב את 6 השעות הראשונות לאחר הניתוח ולאחר מכן מספר פעמים ביום עבור 72 h הראשון לאחר ההשתלה כדי לזהות סיבוכים כלשהם באופן מיידי.
2. עבור כאבים בניתוח, להזריק את העכבר המושתלת עם בופרנורפין (0.05-0.1 מ"ג/ק"ג) תת-עורי ישירות לאחר ההשתלה ולאחר מכן כל 12 h עבור 72 h כדי לספק המתאים, לטווח ארוך כאבים.

6. הסברים לשתל אבי העורקים

1. מורדם החיה המושתלת עם הזרקה התוך הצפק של midazolam (5 מ"ג/ק"ג; 5 מ"ג/mL), medetomidin (0.5 מ"ג/ק"ג; 1 מ"ג/mL) ו פנטניל (0.05 מ"ג/ק"ג; 0.05 mg/mL) 4 שבועות לאחר ההשתלה.
   1. לצבוט את הרגליים האחוריות עם מלקחיים כדי לבדוק רפלקסים כדי לאשר הרדמה מספקת.
2. קליפ כל השיער של אזור הבטן, החזה וצוואר הרחם עם קוצץ שיער חשמלי עבור חיות קטנות.
3. מניחים את החיה בתנוחה פרקדן על משטח חימום מתחת למיקרוסקופ ולהקליט בעדינות את רגליה לשולחן הניתוח עם רצועות גבס רגישות לעור.
4. קרצף את השדה הפעיל. מספר פעמים עם אלכוהול
5. לבצע כריתת בטן לפני האמצע עם מספריים קטנים לדחוף את המעיים מעט כלפי מעלה כדי לחשוף את המורד הנמוך קאווה (IVC).
6. הכנס את האובורד הנחותים (IVC) עם 1 מ ל של מלוחים heparinized באמצעות מחט של 30 גרם.
7. חותכים את אבי העורקים הבטני ואת IVC מתחת לעורקים כליות עם מספריים קטנים כדי לדימום את החיה התורמת. מקום באופן רופף לדחוס לתוך הבטן כדי לספוג את הדם.
8. לבצע חתך העור מתוך חתך הצוואר לתוך הלסת התחתונה הימנית עם מספריים קטנים המתאימים לחתך העור שנעשו במהלך הליך ההשתלה.
9. לזהות את השתל השתלת אבי העורקים יחד עם השרוול הקרובים ביותר וקהה להסיר את כל הרקמה המקיפה עם מלקחיים.
10. באמצעות מיקרו מספריים, לחתוך דרך העורק הראשי המשותף והקרובים לשתל אבי העורקים עם האזיקים כדי לחקור את שתל אבי העורקים יחד עם שני השרוול הקצוות.
11. חותכים את קטע אבי העורקים במחצית ולשמר את הדגימות עבור ניתוחים נוספים (מקטעים קפואים, פרפין חלקים מוטבעים, הצמד חומר קפוא)^13,14.

תוצאות

במודל השתלת חוסר התאמה מלאה של MHC, ניתן לראות את השכבה 4 שבועות לאחר ההשתלה (איור 2). שכבה זו מורכבת בעיקר של תאי כלי דם חלק שרירים כמו כתמי אימונוהיסטולוגי עבור SM22 (סמן סלקטיבי עבור תאים בוגרים החלקה כלי דם) נחשף. כאמור בעבר, אלה תאים שריר וסקולריים חלקה הם pathognomonic לנגעים לראות ...

Discussion

השתלת האלופתיה כרונית היא הגורם העיקרי של אובדן השתל מאוחר לאחר השתלת איברים מוצק של הלב וכנראה הכליות והריאות האלושתלים⁸. עד כה, לא ניתן לפתח משטר תרפויטי מסיבתי על מנת למנוע היווצרות של קו.

הפתופסיולוגיה של קו הוא רב עצרת וכרוך היבטים אימונולוגיים ושאינם אימו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balb-c Mice (H2-d)	Charles River	Strain# 028	Donor animal
Bipolar cautery system	ERBE	ICC 50 / 20195-023	Bipolar cautery
C57BL/6J (H-2b)	Charles River	Strain# 027	Recipient animal
Halsey Needle Holders	FST	12501-12	Needle Holder
Halsted-Mosquito Forceps	AESCULAP	BH111R	Curved Clamp
Medical Polyimide Tubing	Nordson MEDICAL	141-0031	Cuff-Material
Micro Serrefines	FST	18055-04	Micro Vessel Clip
Micro-Adson Forceps (serrated)	FST	11018-12	Standard Forceps
Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps	FST	18057-14	Clipapplicator
S&T Forceps - SuperGrip Tips (Angled 45°)	S&T	00649-11	Fine Forceps
S&T Vessel Dilating Forceps - Angled 10° (Tip diameter 0.2 mm)	S&T	00125-11	Vesseldilatator
Schott VisiLED Set	Schott	MC 1500 / S80-55	Light
Stereoscopic microscope	ZEISS	SteREO Discovery.V8	Microscope
Student Fine Scissors / Surgical Scissors - Sharp-Blunt	FST	91460-11 / 14001-12	Standard Sissors
Vannas-Tübingen Spring Scissors (curved, 8.5 cm)	FST	15004-08	Microsissors (curved)
Vannas-Tübingen Spring Scissors (straight, 8.5 cm)	FST	15003-08	Microsissors (straight)