Murine цервикальной аорты трансплантации модель с использованием модифицированных non-Suture манжеты Техника

Резюме

Здесь мы представляем протокол гетеротопной аортальной трансплантации у мышей с использованием техники не-шовной манжеты в модели шейки матки. Эта модель может быть использована для изучения основной патологии хронической аллотрансплантата васкулопатии (CAV) и может помочь оценить новые терапевтические агенты, с тем чтобы предотвратить его образование.

Аннотация

С введением мощных иммуносупрессивных протоколов возможны различные достижения в профилактике и терапии острых эпизодов отторжения. Однако за последние десятилетия можно было наблюдать лишь незначительное улучшение долгосрочных результатов трансплантации твердых органов. В этом контексте, хроническая аллотрансплантат васкулопатия (CAV) по-прежнему представляет собой ведущую причину поздней органной недостаточности в сердечной, почечной и легочной трансплантации.

До сих пор, основной патогенез развития CAV остается неясным, объясняя, почему эффективные стратегии лечения в настоящее время отсутствует и подчеркивая необходимость соответствующих экспериментальных моделей для того, чтобы изучить основные патофизиологии, ведущие к Формирование CAV. Следующий протокол описывает модель гетеротопической аорты шейки матки с использованием модифицированной техники, не присущей манжете. В этом методе, сегмент грудной аорты находится в неправильном общей сонной артерии. С помощью техники не-сутур манжеты, легко учиться и воспроизводимой модели может быть установлен, сводя к минимуму возможную неоднородность зашесущих сосудистых микро анастомозов.

Введение

За последние шесть десятилетий, сплошная трансплантация органов превратилась из экспериментальной процедуры в стандарт ухода за лечением конечной стадии органной недостаточности¹. В связи с улучшением противомикробных препаратов, хирургических методов и продвижения в иммуносупрессивных полков, ранний показатель успеха трансплантации твердых органов значительно возросли за последние десятилетия².

Тем не менее, долгосрочные показатели выживаемости трансплантата не значительно улучшились таким же образом³. Развитие CAV является основным фактором, ограничивающим долгосрочное выживание^4,5,6. Эта патология характеризуется образованием концентрического неоистимного слоя, состоящего из гладких мышечных клеток, что приводит к постепенному сужению сосуда и последовательному мальперфузии пересаженного твердого органа. У реципиентов пересадки сердца, CAV поражения могут быть диагностированы в до 75% пациентов 3 лет после трансплантации⁷.

Патофизиология CAV еще не до конца понятна. Это, кажется, связано с многочисленными иммунологическими и неиммунологическими факторами, приводящими к эндотелиальным повреждениям с последующей эндотелиальной активацией и дисфункцией^8. До сих пор не существует варианта причинно-следственной связи для профилактики CAV, подчеркивая необходимость воспроизводимой модели малых животных для изучения формирования и потенциальной терапии CAV.

С использованием моделей трансплантации аорты, CAV, как поражения можно увидеть 4 недели после трансплантации. Эти поражения состоят в основном из сосудистых гладких мышечных клеток, тем самым, напоминающих патологию человека. Из-за широкого спектра трансгенных и нокаут мышей, использование моделей мыши в трансплантации связанных патологий предлагает уникальную возможность определить новые терапевтические варианты и понять их развитие. Из-за малого диаметра пересаженных сосудов, однако, использование моделей мыши обычно ассоциируется с длинными кривыми обучения и первоначальный высокий уровень осложнений⁹. С введением не-шов манжеты техники, эта самая сложная часть операции может быть облегчена и диаметр анастомоза сохраняется постоянно^10,11.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Немецкого закона о защите животных (TierSchG.) (АЗ: 55.2-1-54-2532.Vet_02-80-2015).

1. Приют для животных

1. Для экспериментов используйте мышей C57BL/6 и BALB/c весом 20-25 г с мышами C57BL/6 в качестве животных-реципиентов и мышей BALB/c в качестве животных-доноров.
2. Покупка животных и дом в барьерных патогенных объектов, в соответствии с руководящими принципами FELASA для мониторинга здоровья¹².
3. Держите мышей в стандартных клетках Макролона с обогащением вложенного материала. Обеспечить доступ к воде и пеллетным продуктам питания в дневном/ночном цикле 12 ч.
4. Поддерживайте комнатную температуру на уровне 22 и 2 градусов по Цельсию, а относительная влажность - 55 и 5%.

2. Подготовка получателя

1. Во-первых, анестезировать животное-реципиент (C57BL/6) с интраперитонеальной инъекцией мидазолама (5 мг/кг; 5 мг/мл), медетомидина (0,5 мг/кг; 1 мг/мл) и фентанила (0,05 мг/кг; 0,05 мг/мл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная глубина анестезии должна быть достигнута в 5-10 мин.
   1. Pinch задние ноги с щипками, чтобы проверить на рефлексы, чтобы подтвердить глубину анестезии.
2. Закрепите все волосы боковой области шейки матки электрическим клипером для мелких животных и нанесите офтальмологическую мазь ватными тампонами, чтобы предотвратить высыхание глаз во время процедуры.
3. Поместите животное в положение на спине на грелку под микроскопом и аккуратно засуните его ноги к операционному столу с чувствительной полоской штукатурки.
4. Наклоните голову назад и скраб оперативного поля несколько раз с алкоголем.
5. Сделайте разрез кожи от яремного разреза к правой нижней нижней нижней челюсти с небольшими ножницами.
6. Удалите правую нижнюю часть подчелюстной железы через биполярную сетора педикюра и последующее иссечение с помощью микроскисоров.
7. Удалите правую стерноклеидомастоидную мышцу через биполярную каутерию верхней и нижней части и последующее иссечение с помощью микроскиссоров, чтобы получить доступ к общей сонной артерии.
8. Мобилизовать общую сонную артерию как можно дальше дистально и проксимально, потянув окружающие соединительной ткани друг от друга с тонкими щипками.
9. Свяжите две 7-0 шелковые лигатуры с минимальным расстоянием между каждой вокруг середины общей сонной артерии и трансектировать общую сонную артерию с тонкими микроскрицами между лигатурами.
10. Пройдите проксимальный, ligated конец через манжету и исправить его с небольшой зажим артерии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Манжеты, которые были использованы в этой процедуре были вырезаны с микросциссорами из труб полиимидов с внешним диаметром 0,610 мм и толщиной стены 0,0254 мм. Завершенные манжеты имели длину 2 мм с одной половиной, которая используется для манжеты процесса, будучи полный цилиндр, а другая половина, которая зажата, будучи полуцилиндром.
11. Удалите лигатуру с тонкой микросциссоров, как можно ближе к лигатуре, как это возможно, и промыть просвет с гепарина солий (50 МЕ / мл) с иглой 30 G, в то время как забота, чтобы не повредить стенки сосуда.
12. Растягивайте открытый просвет с помощью мелких сосудистых расширителей и всегда сонной пень над манжетой, потянув его мягко над полиимидной трубки.
13. Немедленно исправить вечно йонотид с слабо предварительно связали 7-0 шелковой петли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Свободно предварительно связать 4 7-0 шелковые петли диаметром около 1,5 мм до операции, чтобы сделать манжеты процедуры гладкой и легче.
14. Выполните ту же процедуру (2.10-2.13) на другом конце сонной артерии.
15. Установите получателя животных в сторону и увлажнить оперативное поле с солевым раствором до тех пор, пока аорты сегмента explanted.

3. Операция донора

1. Анестезия донорской мыши (BALB/c) таким же образом, как животное-реципиент.
   1. Pinch задние ноги с щипцы, чтобы проверить на рефлексы, чтобы подтвердить достаточную анестезию.
2. Закрепите все волосы брюшной и грудной области электрическим клипером для мелких животных и нанесите офтальмологическую мазь ватными тампонами, чтобы предотвратить высыхание глаз во время процедуры.
3. Поместите животное в положение на спине на грелку под микроскопом и аккуратно засуните его ноги к операционному столу с чувствительной полоской штукатурки.
4. Несколько раз скраб оперативного поля с алкоголем.
5. Выполните полынь брюшной лапаротомии с небольшими ножницами и нажмите кишечник немного вверх, чтобы разоблачить нижней полы вены (IVC).
6. Введите нижнюю полину вены (IVC) с 1 мл гепаринизационного солира с помощью иглы 30 G.
7. Вырежьте брюшную аорту и IVC ниже почечных артерий с небольшими ножницами, чтобы exsanguinate донора животных. Свободно поместите компресс в брюшную полость, чтобы впитать кровь.
8. Выполните торакотомию при двусторонней диверсии ребер ножницами и наклоните переднюю грудную стенку краниально хирургическим зажимом, чтобы разоблачить средостение.
9. Вырезать IVC и пищевод непосредственно над диафрагмой с микросцисорами.
10. Удалите сердце и легкие, наклоняя их вверх с щипками проведения сократить IVC / пищевода, а затем excising их с микросциссорами из их базы, чтобы получить доступ к грудной аорты в сердечных mediastinum.
11. Мобилизуйте грудную аорту из окружающих тканей, потянув за собой окружающую соединительную ткань и жир тонкими щипками, стараясь не повредить межреберные артерии.
12. Каутеризируйте все ветви из грудной аорты с биполярными щипцы каутери и акциза аорты сегмента между диафрагмой и аортальной арки с помощью микроскисоров.
13. Промыть вырезанный аортированный сегмент с гепарина сольник с иглой 30 G, при этом заботясь, чтобы не повредить стенки сосуда, чтобы удалить оставшиеся крови или сгустки, и передать трансплантата для получателя животного.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Непосредственно поместите аортачный трансплантат в примерно нужном положении получателя во время передачи. Если Есть проблемы, запутанные различные концы трансплантата в получателя животных, свободные лигатуры вокруг дистального конца может помочь.

4. Имплантация

1. Потяните проксимальный конец донорского аортального сегмента над проксимальной манжетой поверх вечной сонной артерии с тонкими щипками и немедленно зафиксируйте ее слабо завязанной 7-0 шелковой петлей.
2. Обрезать дистальный, свободный конец аортального трансплантата с микросциссорами так, чтобы длина трансплантата соответствовала расстоянию между двумя манжетами.
3. Повторите шаг 4.1 на другом конце аорты с другой манжетой, чтобы завершить анастомоз.
4. Удалите дистальный зажим, чтобы ретроградная перфузия.
5. После достижения гемостаза, удалить проксимальный зажим для завершения анастомоз.
6. Наконец, закройте рану 6-0 непрерывным швом.

5. Послеоперационный уход

1. Мониторинг мыши тесно в первые 6 ч после операции, а затем несколько раз в день в течение первых 72 ч после трансплантации, чтобы обнаружить любые осложнения мгновенно.
2. Для послеоперационной обезболивании вводят пересаженную мышь с бупренорфином (0,05-0,1 мг/кг) непосредственно после трансплантации, а затем каждые 12 ч в течение 72 ч, чтобы обеспечить соответствующую долгосрочную обезболивание.

6. Объяснения аорты трансплантата

1. Анестезия пересаженного животного с интраперитонеальной инъекцией мидазолама (5 мг/кг; 5 мг/мл), мететомидина (0,5 мг/кг; 1 мг/мл) и фентанила (0,05 мг/кг; 0,05 мг/мл) 4 недели после трансплантации.
   1. Pinch задние ноги с щипцы, чтобы проверить на рефлексы, чтобы подтвердить достаточную анестезию.
2. Закрепите все волосы брюшной, грудной и шейной области электрическим клипера для мелких животных.
3. Поместите животное в положение на спине на грелку под микроскопом и аккуратно засуните его ноги к операционному столу с чувствительной полоской штукатурки.
4. Несколько раз скраб оперативного поля с алкоголем.
5. Выполните полынь брюшной лапаротомии с небольшими ножницами и нажмите кишечник немного вверх, чтобы разоблачить нижней полы вены (IVC).
6. Введите нижнюю полину вены (IVC) с 1 мл гепаринизационного солира с помощью иглы 30 G.
7. Вырежьте брюшную аорту и IVC ниже почечных артерий с небольшими ножницами, чтобы exsanguinate донора животных. Свободно поместите компресс в брюшную полость, чтобы впитать кровь.
8. Сделайте разрез кожи от яремного разреза к правой нижней нижней нижней челюсти с небольшими ножницами, соответствующими разрезу кожи, сделанному во время процедуры пересадки.
9. Определите пересаженный аортальный трансплантат вместе с дистальной и проксимальной манжетой и тупой удалить любые окружающие ткани с помощью щипц.
10. Используя микросциссоры, прорезать общую сонной артерии дистальной и проксимальной к аортальной трансплантата с манжетами, чтобы высадить аортальный трансплантат вместе с двумя концами манжеты.
11. Разрежьте аортатический сегмент пополам и сохраните образцы для дальнейшего анализа (замороженные секции, парафиновые встроенные секции, оснастки замороженный материал)^13,14.

Результаты

В полностью MHC-несоответствие трансплантации модели, концентрический неоинтимальный слой можно увидеть 4 недели после трансплантации (Рисунок 2). Этот слой состоит в основном из сосудистых гладких мышечных клеток, как иммуногистологическое окрашивание для SM22 (селектив?...

Обсуждение

Хроническая аллотрансплантат васкулопатия является основной причиной поздней потери трансплантата после трансплантации твердых органов сердца и, вероятно, почек и легких аллотрансплантатов⁸. До сих пор не может быть разработан апогеонный терапевтический режим для пред?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balb-c Mice (H2-d)	Charles River	Strain# 028	Donor animal
Bipolar cautery system	ERBE	ICC 50 / 20195-023	Bipolar cautery
C57BL/6J (H-2b)	Charles River	Strain# 027	Recipient animal
Halsey Needle Holders	FST	12501-12	Needle Holder
Halsted-Mosquito Forceps	AESCULAP	BH111R	Curved Clamp
Medical Polyimide Tubing	Nordson MEDICAL	141-0031	Cuff-Material
Micro Serrefines	FST	18055-04	Micro Vessel Clip
Micro-Adson Forceps (serrated)	FST	11018-12	Standard Forceps
Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps	FST	18057-14	Clipapplicator
S&T Forceps - SuperGrip Tips (Angled 45°)	S&T	00649-11	Fine Forceps
S&T Vessel Dilating Forceps - Angled 10° (Tip diameter 0.2 mm)	S&T	00125-11	Vesseldilatator
Schott VisiLED Set	Schott	MC 1500 / S80-55	Light
Stereoscopic microscope	ZEISS	SteREO Discovery.V8	Microscope
Student Fine Scissors / Surgical Scissors - Sharp-Blunt	FST	91460-11 / 14001-12	Standard Sissors
Vannas-Tübingen Spring Scissors (curved, 8.5 cm)	FST	15004-08	Microsissors (curved)
Vannas-Tübingen Spring Scissors (straight, 8.5 cm)	FST	15003-08	Microsissors (straight)