Modello di trapianto aortico cervicale murine utilizzando una tecnica di manette non sutura modificata

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo di trapianto aortico eterotopico nei topi utilizzando la tecnica del bracciale non-suture in un modello di murino cervicale. Questo modello può essere utilizzato per studiare la patologia sottostante della vasculopatia allotrapianto cronica (CAV) e può aiutare a valutare nuovi agenti terapeutici al fine di prevenirne la formazione.

Abstract

Con l'introduzione di potenti protocolli immunosoppressivi, sono possibili progressi distinti nella prevenzione e nella terapia degli episodi di rigetto acuto. Tuttavia, negli ultimi decenni si è potuto osservare solo un lieve miglioramento dei risultati a lungo termine degli organi solidi trapiantati. In questo contesto, la vasculopatia cronica allotrapianto (CAV) rappresenta ancora la principale causa di insufficienza di organi tardiva nel trapianto cardiaco, renale e polmonare.

Finora, la patogenesi di fondo dello sviluppo di CAV rimane poco chiara, spiegando perché attualmente mancano strategie di trattamento efficaci e sottolineando la necessità di modelli sperimentali pertinenti al fine di studiare la fisiopatologia sottostante che porta a formazione di CAV. Il seguente protocollo descrive un modello di trapianto aortico cervicale eterotopico murno utilizzando una tecnica di polsino non sutura modificata. In questa tecnica, un segmento dell'aorta toracica è interposto nella giusta arteria carotide comune. Con l'uso della tecnica del bracciale non-sutura, è possibile stabilire un modello facile da imparare e riproducibile, riducendo al minimo la possibile eterogeneità delle microantomosi vascolari suturate.

Introduzione

Negli ultimi sei decenni, il trapianto di organi solidi si è evoluto da una procedura sperimentale a uno standard di cura per il trattamento del fallimento dell'organo allo stadio finale¹. A causa del miglioramento degli agenti antimicrobici, delle tecniche chirurgiche e dell'avanzamento nei reggimenti immunosoppressivi, il tasso di successo precoce del trapianto di organi solidi è aumentato significativamente negli ultimi decenni².

Tuttavia, i tassi di sopravvivenza all'innesto a lungo termine non sono migliorati in modo significativo nello stesso modo³. Lo sviluppo di CAV è il principale fattore che limita la sopravvivenza a lungo termine^4,5,6. Questa patologia è caratterizzata dalla formazione di uno strato neointimale concentrico costituito da cellule muscolari lisce, che porta al progressivo restringimento del vaso e alla perffusione consecutiva dell'organo solido trapiantato. Nei pazienti trapiantati di cuore, le lesioni CAV possono essere diagnosticate in fino al 75% dei pazienti 3 anni dopo il trapianto⁷.

La fisiofisiologia del CAV non è ancora del tutto compresa. Sembra essere correlato a numerosi fattori immunologici e non immunologici, che portano a danni endoteliali con conseguente attivazione endoteliale e disfunzione⁸. Finora non esiste alcuna opzione di trattamento causale per la prevenzione del CAV, sottolineando la necessità di un modello animale piccolo riproducibile al fine di studiare la formazione e la potenziale terapia del CAV.

Con l'uso di modelli di trapianto aortico murino, CAV come lesioni può essere visto 4 settimane dopo il trapianto. Queste lesioni sono costituite principalmente da cellule muscolari lisce vascolari, in tal modo, simile alla patologia umana. A causa di un'ampia varietà di topi transgenici e abbattuti, l'uso di modelli murini nelle patologie associate al trapianto offre un'opportunità unica per identificare nuove opzioni terapeutiche e comprenderne lo sviluppo. A causa del piccolo diametro dei vasi trapiantati, tuttavia, l'uso di modelli murini è comunemente associato a lunghe curve di apprendimento e un alto tasso di complicanza iniziale⁹. Con l'introduzione della tecnica del bracciale non-sutura, questa parte più impegnativa dell'operazione può essere facilitata e il diametro dell'anastomosi è mantenuto costante^10,11.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati effettuati secondo le linee guida del German Animal Welfare Act (TierSchG.) 55,2-1-54-2532.Vet_02-80-2015).

1. Alloggi per animali

1. Per gli esperimenti, utilizzare topi maschi C57BL/6 e BALB/c del peso di 20-25 g con topi C57BL/6 come animali ricitati e topi BALB/c come animali donatori.
2. Acquistare gli animali e la casa in una barriera senza agenti patogeni, in conformità con le linee guida FELASA per il monitoraggio sanitario¹².
3. Conservare i topi in gabbie Di Makrolon standard con materiale di nidificazione di arricchimento. Fornire l'accesso ad libitum all'acqua e al cibo pelleta in un ciclo giorno/notte di 12 h.
4. Mantenere la temperatura ambiente a 22 x 2 gradi centigradi e l'umidità relativa a 55 x il 5%.

2. Preparazione del destinatario

1. In primo luogo, anestesizzare l'animale ricevente (C57BL/6) con un'iniezione intraperitoneale di midazolam (5 mg/kg; 5 mg/mL), medetomidina (0,5 mg/kg; 1 mg/mL) e fentanil (0,05 mg/kg; 0,05 mg/mL).
   NOTA: La corretta profondità dell'anestesia deve essere raggiunta in 5-10 min.
   1. Pizzicare i piedi posteriori con pinze per verificare la presenza di riflessi per confermare la profondità dell'anestesia.
2. Agganciare tutti i capelli della regione laterale cervicale con un tagliacapelli elettrico per piccoli animali e applicare unguento oftalmico con tamponi di cotone per evitare che gli occhi si asciughino durante la procedura.
3. Posizionare l'animale in posizione supina su un pad di riscaldamento sotto il microscopio e nastro delicatamente le gambe al tavolo operatorio con strisce di gesso sensibili alla pelle.
4. Inclinare la testa indietro e strofinare il campo operativo più volte con l'alcol.
5. Fare un'incisione cutanea dall'incisione giugulare alla mandibile inferiore destra con piccole forbici.
6. Rimuovere il lobo inferiore destro della ghiandola submandibolare tramite cavolo bipolare del pedicle del vaso e la successiva escissione con microscissor.
7. Rimuovere il muscolo sternocleidomastoid e destro tramite cautery bipolare della parte superiore e inferiore e successive escissione con microscisors per ottenere l'accesso all'arteria carotide comune.
8. Mobilitare l'arteria carotide comune nel modo più distally e proximally possibile, allontanando il tessuto connettivo circostante con pinze fini.
9. Legare due legature di seta 7-0 con una distanza minima tra ciascuna intorno al centro dell'arteria carotide comune e transetto l'arteria carotide comune con microscufficiori fini tra le legature.
10. Passare l'estremità prossimale e ligate attraverso il bracciale e fissarlo con un piccolo morsetto dell'arteria.
    NOTA: I polsini utilizzati in questa procedura sono stati tagliati con microscognitori da tubi di poliimide con un diametro esterno di 0,610 mm e uno spessore della parete di 0,0254 mm. I polsini completati avevano una lunghezza di 2 mm con una metà, che viene utilizzata per il processo di ammanettatura, essendo un cilindro pieno e l'altra metà, che è bloccata, essendo un mezzo cilindro.
11. Rimuovere la legatura con microscissors fine, il più vicino possibile alla legatura, e lavare il lume con salina eparainizzata (50 IU/mL) con un ago da 30 G, facendo attenzione a non danneggiare le pareti del vaso.
12. Distendere il lume aperto utilizzando sottili dilatatori vascolari ed evert il ceppo carotide sopra il polsino tirandolo delicatamente sopra il tubo di poliimide.
13. Fissare immediatamente la carotide eversata con un anello di seta 7-0 liberamente prelegato.
    NOTA: Pre-legare liberamente 4 7-0 anelli di seta con un diametro di circa 1,5 mm prima dell'intervento chirurgico per rendere la procedura di ammanettatura più liscia e più facile.
14. Eseguire la stessa procedura (2.10-2.13) all'altra estremità dell'arteria carotide.
15. Mettere da parte l'animale ricevente e idratare il campo operativo con salina fino a quando il segmento aortico non viene espiantato.

3. Operazione donatore

1. Anestesizzare il topo donatore (BALB/c) nello stesso modo dell'animale ricevente.
   1. Pizzicare i piedi posteriori con pinze per verificare la presenza di riflessi per confermare l'anestesia sufficiente.
2. Agganciare tutti i capelli della regione addominale e toracica con un tagliacapelli elettrico per piccoli animali e applicare unguento oftalmico con tamponi di cotone per evitare che gli occhi si asciughino durante la procedura.
3. Posizionare l'animale in posizione supina su un pad di riscaldamento sotto il microscopio e nastro delicatamente le gambe al tavolo operatorio con strisce di gesso sensibili alla pelle.
4. Scrub il campo operativo più volte con l'alcol.
5. Eseguire una laparotomia addominale midline con piccole forbici e spingere l'intestino leggermente verso l'alto per esporre la vena cava inferiore (IVC).
6. Iniettare la vena cava inferiore (IVC) con 1 mL di salina eparinizzata utilizzando un ago da 30 G.
7. Tagliare l'aorta addominale e IVC sotto le arterie renali con piccole forbici per essanguinare l'animale donatore. Mettere liberamente un impacco nell'addome per assorbire il sangue.
8. Eseguire una toracotomia alla deviazione bilaterale delle costole con le forbici e inclinare la parete anteriore del torace cranicamente con un morsetto chirurgico per esporre il mediastino.
9. Tagliare l'IVC e l'esofago direttamente sopra il diaframma con microscissors.
10. Rimuovere il cuore e i polmoni inclinandoli verso l'alto con pinze che tengono il taglio IVC/esofago e poi eccitarli con microscisors dalla loro base per ottenere l'accesso all'aorta toracica nel mediastinum dorsale.
11. Mobilitare l'aorta toracico dal tessuto circostante separando il tessuto connettivo circostante e il grasso con pinze fini facendo attenzione a non danneggiare le arterie intercostali.
12. Cauterizza tutti i rami dell'aorta toracica con pinze cauteriche bipolari e accisa il segmento aortico tra il diaframma e l'arco aortico usando microscisor.
13. Sciacquare il segmento aortico asciso con salina eparinizzata con un ago da 30 G, facendo attenzione a non danneggiare le pareti del vaso, a rimuovere il sangue o i coaguli rimanenti e trasferire l'innesto all'animale ricevente.
    NOTA: Posizionare direttamente l'innesto aortico nella posizione approssimativamente corretta nel destinatario durante il trasferimento. Se ci sono problemi a confondere le diverse estremità dell'innesto nell'animale ricevente, una legatura allentata intorno all'estremità distale potrebbe aiutare.

4. Impianto

1. Tirare l'estremità prossimale del segmento aortico del donatore sopra il bracciale prossimale sopra l'arteria carotide eversata con pinze fini e fissarla immediatamente con un anello di seta 7-0 vagamente pre-legato.
2. Tagliare l'estremità libera e distale dell'innesto aortico con microscissors in modo che la lunghezza dell'innesto si adatti alla distanza tra i due polsini.
3. Ripetere il passaggio 4.1 sull'altra estremità dell'aorta con l'altro polsino per completare l'anastomosi.
4. Rimuovere il morsetto distale per consentire la perfusione retrograda.
5. Dopo aver raggiunto l'emostasi, rimuovere il morsetto prossimale per completare l'anastomosi.
6. Infine, chiudere la ferita con 6-0 sutura continua.

5. Assistenza postoperatoria

1. Monitorare attentamente il mouse nelle prime 6 h dopo l'operazione e poi più volte al giorno per le prime 72 h dopo il trapianto per rilevare eventuali complicazioni istantaneamente.
2. Per l'analgesia postoperatoria, iniettare il topo trapiantato con buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) sottocutaneamente direttamente dopo il trapianto e quindi ogni 12 h per 72 h per fornire un'adeguata analgesia a lungo termine.

6. Spiegazioni per innesto aortico

1. Anestesizzare l'animale trapiantato con un'iniezione intraperitale di midazolam (5 mg/kg; 5 mg/mL), medetomidina (0,5 mg/kg; 1 mg/mL) e fentanil (0,05 mg/kg; 0,05 mg/mL) 4 settimane dopo il trapianto.
   1. Pizzicare i piedi posteriori con pinze per verificare la presenza di riflessi per confermare l'anestesia sufficiente.
2. Aggancia tutti i capelli della regione addominale, toracica e cervicale con un tagliacapelli elettrico per piccoli animali.
3. Posizionare l'animale in posizione supina su un pad di riscaldamento sotto il microscopio e nastro delicatamente le gambe al tavolo operatorio con strisce di gesso sensibili alla pelle.
4. Scrub il campo operativo più volte con l'alcol.
5. Eseguire una laparotomia addominale midline con piccole forbici e spingere l'intestino leggermente verso l'alto per esporre la vena cava inferiore (IVC).
6. Iniettare la vena cava inferiore (IVC) con 1 mL di salina eparinizzata utilizzando un ago da 30 G.
7. Tagliare l'aorta addominale e IVC sotto le arterie renali con piccole forbici per essanguinare l'animale donatore. Mettere liberamente un impacco nell'addome per assorbire il sangue.
8. Fare un'incisione cutanea dall'incisione giugulare alla mandibola inferiore destra con piccole forbici corrispondenti all'incisione cutanea fatta durante la procedura di trapianto.
9. Identificare l'innesto aortico trapiantato insieme al polsino distale e prossimale e al smussato rimuovere qualsiasi tessuto circostante con pinze.
10. Utilizzando microscissors, tagliare l'arteria carotide comune distale e prossimale al trapianto aortico con i polsini al fine di espiantare l'innesto aortico insieme con le due estremità del polsino.
11. Tagliare il segmento aortico a metà e conservare gli esemplari per ulteriori analisi (sezioni congelate, sezioni incorporate di paraffina, materiale congelato a scatto)^13,14.

Risultati

Nel modello di trapianto completamente MHC-mismatch, uno strato neointimale concentrico può essere visto 4 settimane dopo il trapianto (Figura 2). Questo strato è costituito principalmente da cellule muscolari limpiche vascolari come colorazione immunoistologica per SM22 (un marcatore selettivo per le cellule muscolari lisce vascolari mature) rivelato. Come detto prima, queste cellule muscolari lisce vascolari sono patognominiche per le lesioni osservate nella vascolata cronica allotrapian...

Discussione

La vasculopatia allotrapianto cronica è la causa principale della perdita tardiva dell'innesto dopo il trapianto di organi solidi del cuore e probabilmente allotrapianti renali e polmonari⁸. Finora, non è stato possibile sviluppare alcun regime terapeutico causale al fine di prevenire la formazione di CAV.

La fisiofisiologia del CAV è multifattoriale e coinvolge gli aspetti immunologici e non immunologici¹⁶. L'uso di modelli di roditori nei tr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balb-c Mice (H2-d)	Charles River	Strain# 028	Donor animal
Bipolar cautery system	ERBE	ICC 50 / 20195-023	Bipolar cautery
C57BL/6J (H-2b)	Charles River	Strain# 027	Recipient animal
Halsey Needle Holders	FST	12501-12	Needle Holder
Halsted-Mosquito Forceps	AESCULAP	BH111R	Curved Clamp
Medical Polyimide Tubing	Nordson MEDICAL	141-0031	Cuff-Material
Micro Serrefines	FST	18055-04	Micro Vessel Clip
Micro-Adson Forceps (serrated)	FST	11018-12	Standard Forceps
Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps	FST	18057-14	Clipapplicator
S&T Forceps - SuperGrip Tips (Angled 45°)	S&T	00649-11	Fine Forceps
S&T Vessel Dilating Forceps - Angled 10° (Tip diameter 0.2 mm)	S&T	00125-11	Vesseldilatator
Schott VisiLED Set	Schott	MC 1500 / S80-55	Light
Stereoscopic microscope	ZEISS	SteREO Discovery.V8	Microscope
Student Fine Scissors / Surgical Scissors - Sharp-Blunt	FST	91460-11 / 14001-12	Standard Sissors
Vannas-Tübingen Spring Scissors (curved, 8.5 cm)	FST	15004-08	Microsissors (curved)
Vannas-Tübingen Spring Scissors (straight, 8.5 cm)	FST	15003-08	Microsissors (straight)