Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم بروتوكول تعويض مكتبة RNA صغيرة مفصلة مع تحيز أقل من الأساليب القياسية وزيادة الحساسية لRNAs 2'-O-methyl. ويمكن اتباع هذا البروتوكول باستخدام الكواشف محلية الصنع لتوفير التكلفة أو استخدام مجموعات للراحة.

Abstract

وتتحدى قضايا التحيز أثناء إعداد المكتبة دراسة التقارير RNSالصغيرة (sRNAs) من قبل الجيل التالي من التسلسل. عدة أنواع من الحمض النووي الريبي مثل microRNAs النباتية (miRNAs) تحمل تعديل 2'-O-ميثيل (2'-OMe) في النيوكليوتيد اتّحدى 3. يضيف هذا التعديل صعوبة أخرى لأنه يمنع ربط المحول 3'. لقد أثبتنا في السابق أن الإصدارات المعدلة من بروتوكول 'TruSeq (TS)' لها تحيز أقل وأحدث تية محسنة لـ RNAs 2'-OMe. هنا نقوم بوصف بالتفصيل بروتوكول 'TS5'، الذي أظهر أفضل أداء عام. TS5 يمكن اتباعها إما باستخدام الكواشف محلية الصنع أو الكواشف من مجموعة TS، مع أداء متساو.

Introduction

وتشارك التقييمات RNSالصغيرة (sRNAs) في مراقبة تنوع العمليات البيولوجية1. عادة ما يتراوح حجم الـ sRNAs التنظيمية Eukaryotic بين 20 و30 nt؛ الأنواع الرئيسية الثلاثة هي microRNAs (ميرنا)، RNAs piwi التفاعل (بيرنا) وRNAs التدخل الصغيرة (siRNA). وقد تورطت مستويات التعبير ميرنا Aberrant في مجموعة متنوعة من الأمراض2. وهذا يؤكد أهمية miRNAs في الصحة والمرض والحاجة إلى أدوات بحث دقيقة وكمية للكشف عن sRNAs بشكل عام.

الجيل التالي من التسلسل (NGS) هو طريقة تستخدم على نطاق واسع لدراسة sRNAs. المزايا الرئيسية للـ NGS بالمقارنة مع النُهج الأخرى، مثل تقنيات PCR الكمية أو المصفوفة الدقيقة (qPCR)، هي أنها لا تحتاج إلى معرفة مسبقة بتسلسلات الحمض النووي الريبي، وبالتالي يمكن استخدامها لاكتشاف RNAs جديدة، وبالإضافة إلى ذلك فإنه يعاني من أقل من إشارة الخلفية وتأثيرات التشبع. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن الكشف عن الاختلافات النيوكليوتيد واحد ولها الإنتاجية أعلى من المصفوفات الدقيقة. ومع ذلك، فإن المنظمات غير الحكومية لديها أيضا بعض العيوب؛ تظل تكلفة تشغيل التسلسل مرتفعة نسبياً وقد تؤدي عملية الخطوات المتعددة المطلوبة لتحويل عينة إلى مكتبة للتسلسل إلى تحيزات. في عملية إعداد مكتبة sRNA نموذجية، يتم ربط محول 3 ' أولاً إلى sRNA (غالباً ما يتم تنقية هلام من إجمالي RNA) باستخدام نسخة مقتطعة من RNA ligase 2 (RNL2) ومحول preadenylated 3 ' (الشكل 1) في غياب ATP. وهذا يزيد من كفاءة الربط محول sRNA ويقلل من تشكيل ردود الفعل الجانبية مثل التعميم sRNA أو التعام. في وقت لاحق، يتم ربط محول 5 'بواسطة RNA ligase 1 (RNL1)، تليها النسخ العكسي (RT) وتضخيم PCR. كل هذه الخطوات قد إدخال التحيز3،4. وبالتالي، قد لا تعكس أرقام القراءة مستويات التعبير sRNA الفعلية مما يؤدي إلى أنماط التعبير الاصطناعية المعتمدة على الأسلوب. قد تكون sRNAs محددة إما ممثلة تمثيلاً زائداً أو ناقصاً في مكتبة، وقد تهرب sRNAs الممثلة تمثيلاً ناقصاً بشدة من الكشف. الوضع معقد بشكل خاص مع الميرنات النباتية، سيرنا في الحشرات والنباتات، وpiRNAs في الحشرات، الديدان الخيطية والثدييات، والتي النيوكليوتيد الطرفية 3 لديها 2'-O-ميثيل (2'-OMe) تعديل1. هذا التعديل يمنع بشدة 3 'ربط محول5،مما يجعل إعداد المكتبة لهذه الأنواع من RNA مهمة صعبة.

العمل السابق أظهر أن ربط محول يدخل التحيز خطيرة،وذلك بسبب آثار تسلسل RNA / هيكل6،7،8،9،10،11. خطوات المصب من ربط محول مثل النسخ العكسي وPCRلا تسهم بشكل كبير في التحيز6،11،12. التحيز الربط من المرجح يرجع ذلك إلى حقيقة أن جزيئات محول مع تسلسل معين سوف تتفاعل مع جزيئات sRNA في خليط التفاعل لتشكيل طيات مشتركة، التي قد تؤدي إما إلى تكوينات مواتية أو غير مواتية للربط(الشكل 2). وتشير البيانات الواردة من Sorefan وآخرون7 إلى أن RNL1 يفضل سياق واحد تقطعت بهم السبل، في حين أن RNL2 يفضل حبلا مزدوجة للربط. حقيقة أن يتم تحديد بنيات المحول/sRNA القابلة للطي بواسطة المحول المحدد وتسلسلات sRNA يفسر لماذا sRNA معينة هي الإفراط أو التمثيل الناقص مع مجموعة محول معينة. من المهم أيضاً ملاحظة أنه ضمن سلسلة من مكتبات sRNA لمقارنتها، يجب استخدام نفس تسلسلات المحول. في الواقع، وقد لوحظ سابقا أن تغيير المحولات عن طريق إدخال تسلسل الباركود مختلفة يغير ملامح ميرنا في تسلسل المكتبات9،13.

من المحتمل أن يؤدي عشوائية تسلسلات المحول بالقرب من تقاطع الربط إلى تقليل هذه التحيزات. Sorefan وزملاؤه7 تستخدم محولات مع 4 النيوكليوتيدات العشوائية في أطرافها، وعينت "عالية الوضوح" (HD) محولات، وأظهرت أن استخدام هذه المحولات يؤدي إلى المكتبات التي تعكس بشكل أفضل مستويات التعبير sRNA صحيح. وأكد عمل أحدث هذه الملاحظات وكشف أن المنطقة العشوائية لا تحتاج إلى أن تكون مجاورة لتقاطع الربط11. تم تسمية هذا النوع الجديد من المحولات محولات "MidRand". معاً، توضح هذه النتائج أن تصميم المحول المحسّن يمكن أن يقلل من التحيز.

بدلاً من تعديل المحولات، يمكن منع التحيز من خلال تحسين ظروف رد الفعل. البولي ايثيلين غليكول (PEG)، وهو عامل الازدحام الجزيئي الكلي المعروف لزيادة كفاءة الربط14، وقد ثبت للحد بشكل كبير من التحيز15،16. واستنادا إلى هذه النتائج، ظهرت عدة مجموعات "التحيز المنخفض" في السوق. وتشمل هذه المجموعات التي تستخدم PEG في ردود الفعل الربط، إما في تركيبة مع محولات الكلاسيكية أو محولات HD. مجموعات أخرى تجنب الربط تماما، واستخدام 3 'polyadenylation والتبديل قالب ل3 'و 5' إضافة محول، على التوالي12. في استراتيجية أخرى، يتبع ربط محول 3 'خطوة التعميم، وبالتالي حذف 5 ' ربط محول17.

في دراسة سابقة، بحثنا عن بروتوكول إعداد مكتبة sRNA مع أدنى مستويات ممكنة من التحيز وأفضل الكشف عن 2'-OMe RNAs12. اختبرنا بعض مجموعات "التحيز المنخفض" المذكورة أعلاه، والتي كان الكشف عن هادىر 2'-OMe RNAs أفضل من البروتوكول القياسي (TS). ولكن من المستغرب، على تعديل (استخدام محولات معشاة، PEG في ردود الفعل الربط وإزالة محول الزائدة 3 'عن طريق تنقية) هذا الأخير تفوق البروتوكولات الأخرى للكشف عن RNAs 2'-OMe. هنا، ونحن نصف بالتفصيل بروتوكول يستند إلى بروتوكول TS، 'TS5'، الذي كان أفضل الكشف العام من RNAs 2'-OMe. ويمكن اتباع البروتوكول باستخدام الكواشف من مجموعة TS وكاشف واحد من مجموعة 'Nf' أو، لتوفير المال، وذلك باستخدام الكواشف محلية الصنع، مع أداء متساو. كما نقدم بروتوكول مفصل لتنقية sRNA من الجيش الملكي النيبالي الكلي وإعداد محول 3 'preadenylated.

Protocol

1- عزل التقييمات RNAs الصغيرة

  1. استخراج الجيش الملكي النيبالي باستخدام الكواشف القائمة على الفينول أو أي طريقة أخرى. تحقق مما إذا كان الحمض النووي الريبي من نوعية جيدة.
  2. قبل تشغيل هلام TBE-اليوريا 15٪ (انظر جدول المواد)لمدة 15 دقيقة في 200 V.
  3. في حين أن الجل هو قبل تشغيل, مزيج 5-20 ميكروغرام من إجمالي RNA في حجم 5-15 درجة مئوية مع حجم متساو من صبغ تحميل formamide (انظر جدول المواد; 95% منزوع الأيونات formamide, 0.025% بروموفينول الأزرق, 0.025% xylene سيانول, 5 MM EDTA pH 8) في أنبوب PCR 200 درجة مئوية. وبالمثل، مزيج 10 درجة مئوية (200 نانوغرام) من سلم الحمض النووي الريبي الصغير (انظر جدول المواد)مع حجم متساو من صبغة التحميل فورماميد. حضانة لمدة 5 دقائق في 65 درجة مئوية في دراجة حرارية مع غطاء ساخن، ثم وضع الأنابيب على الفور على الجليد.
  4. تحميل سلم والعينة على نفس هلام مع حارة واحدة على الأقل بينهما وتشغيل في 200 V حتى الأزرق بروموفينول (الأزرق الداكن) قد هاجر حوالي ثلثي طول هلام (حوالي 40 دقيقة).
  5. إعداد نظام لelute الحمض النووي الريبي من هلام على النحو التالي: ثقب الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الصغيرة خالية من nuclease 0.5 مل مع إبرة قياس 21. ضع أنبوب 0.5 مل المثقوب في أنبوب الطرد المركزي الصغير 2 مل خالية من النوكليس.
  6. إزالة هلام، واحتضان في درجة حرارة الغرفة مع 3 ميكروغرام هلام حمض نووي وصمة عار (10،000 × التركيز؛ انظر جدول المواد)في 30 مل من الماء لمدة 10-15 دقيقة.
  7. عرض هلام على 'قارئ الظلام' عبر المضيء (فمن المستحسن بشدة لتجنب الأشعة فوق البنفسجية لأن هذا قد يضر الحمض النووي الريبي) وقطع الحمض النووي الريبي عينة بين 17 NT و 29 NT سلم العصابات. نقل قطعة هلام إلى أنبوب 0.5 مل من الخطوة 1.5.
  8. طرد مركزي أنبوب 0.5 مل في أنبوب 2 مل في جهاز طرد مركزي صغير في السرعة القصوى لمدة 2 دقيقة.
  9. إضافة 300 درجة مئوية من nuclease خالية 0.3 M NaCl إلى أنبوب 2 مل التي تحتوي على هلام سحقت وتناوب لمدة 2 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها (16 ساعة).
  10. نقل تعليق قطع هلام سحقت إلى عمود تدور (انظر جدول المواد)والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في السرعة القصوى في جهاز طرد مركزي صغير.
  11. إضافة 1 μL (20 ميكروغرام / ميكرولتر) من الجليكوجين (انظر جدول المواد)و 950 درجة مئوية من درجة حرارة الغرفة 100٪ الإيثانول. حضانة لمدة لا تقل عن 30 دقيقة عند -80 درجة مئوية.
  12. الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في السرعة القصوى في جهاز طرد مركزي صغير عند 4 درجة مئوية. إزالة supernatant، وغسل بيليه مع 800 درجة مئوية من البرد 80٪ الإيثانول. الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية، وإزالة بعناية كل supernatant. إعادة تعليق الحمض النووي الريبي بيليه في 15 ميكرولتر من المياه الخالية من nuclease. عادة، ~ 5-20 نانوغرام من الحمض النووي الريبي الصغيرة ينبغي استردادها، اعتمادا على كمية المدخلات مجموع RNA (~ 1 نانوغرام من RNA الصغيرة لكل 1 ميكروغرام من المدخلات مجموع RNA).
  13. الخطوة الإضافية الموصى بها: التحقق من كمية ونوعية sRNA المستردة (على سبيل المثال، عن طريق الكهربائي هلام الشعرية باستخدام مجموعة RNA صغيرة؛ انظر جدول المواد).

2. إعداد preadenylated 3 'HD محول

ملاحظة: تم preadenylation من محول HD 3 'بطريقة مماثلة للبروتوكول الذي وصفه تشن وآخرون18. لاحظ أنه يمكن طلب محول preadenylated مباشرة (/5rApp/ تعديل)، ولكن هذا مكلف جدا.

  1. ترتيب 5 'فوسفوريلاتيد، 3' منعت 3 'HD محول oligonucleotide. انظر الجدول 1 للاطلاع على التسلسل والتعديلات. لاحظ أن '3AmMO' هو 3 ' مجموعة المعدل الأميني، يمكن لمعظم الموردين إنتاج oligonucleotide مع هذا التعديل. تمييع في المياه الخالية من النوكل إلى 100 درجة مئوية.
  2. إعداد رد فعل 100 ميكرولتر يحتوي على الكواشف التالية: 10 ميكرولتر من القلة (100 درجة مئوية)، 10 ميكرولتر من T4 RNA ligase العازلة (10X)، 10 ميكرولتر من ATP (10 MM)، 40 ميكرولتر من 50٪ PEG8000، 5 ميكرولتر من T4 RNA ligase 1 (50 وحدة)، 25 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكل. الحضانة بين عشية وضحاها عند 20 درجة مئوية.
  3. إجراء استخراج الفينول الكلوروفورم الكلاسيكية من oligonucleotide preadenylated تليها هطول الأمطار الإيثانول. إضافة 100 ميكرولتر من الحمض (درجة الحموضة 4.5) الفينول: الكلوروفورم والدوامة. تدور لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، والسرعة القصوى. نقل بعناية 90 درجة مئوية من المرحلة العليا إلى أنبوب جديد. إضافة 10 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم درجة الحموضة 5.2، 1 درجة مئوية من الجليكوجين فائقة النقاء و 250 درجة مئوية من الإيثانول البارد 100٪.
  4. يُحفظ عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. إزالة supernatant، وغسل بيليه مرة واحدة مع 500 درجة مئوية الباردة 80٪ الإيثانول. كبديل لاستخراج الفينول كلوروفورم وهطول الأمطار الإيثانول، يمكن استخدام مجموعة إزالة النيوكليوتيد (انظر جدول المواد). إعادة تعليق في الماء 25 ميكرولتر.
  5. قياس تركيز المحول باستخدام مجموعة للكشف محددة من الحمض النووي الذي تقطعت به السبل واحدة (انظر جدول المواد). تمييع إلى 80 نانوغرام / ميكرولتر (10 درجة مئوية).
  6. الخطوة الإضافية الموصى بها: تحقق من فعالية preadenylation عن طريق ترحيل 1 ميكرولتر من 10 م محول على هلام TBE-اليوريا 15٪(جدول المواد)جنبا إلى جنب مع oligonucleotide غير المعالجة. يجب أن يهاجر المحول preadenylated أبطأ قليلاً من oligonucleotide غير المعالجة. إذا رغبت في ذلك، يمكن أن يكون محول preadenylated هلام تنقية. المضي قدما على النحو المبين أعلاه (الخطوات 1-2-1-12).

3. إعداد المكتبة - بروتوكول TS5

ملاحظة: نقدم هنا بروتوكول TS المعدل 'TS5' الذي وصفناهسابقا12 ويمكن أن يتم إما مع الكواشف من مجموعة أو مع الكواشف المقدمة ذاتيا. وتجدر الإشارة إلى أننا حصلنا على نتائج مماثلة أو حتى أفضل قليلا مع بروتوكول مختلف، 'TS7'. ومع ذلك، مع TS7 من الصعب القضاء على وحدات الديمتر. لذلك فضلنا وصف TS5 بالتفصيل، ولكن TS7 يمكن أن يتبع ببساطة استبدال المحولات. بالنسبة لـ TS7، استخدم تسلسلات المحول 'MidRand-like (MRL)'(الجدول 1). لاحظ أن المناطق العشوائية هنا في منتصف المحولات. سوف التمهيديات للنسخ العكسي وPCR التهجين إلى تسلسل المصب من المنطقة المعشاة في محول 3 'والمنبع من المنطقة العشوائية في محول 5'. سيبدأ التسلسل من أول نيوكليوتيد معشاة في المحول 5'.

  1. 3 ' ربط محول.
    1. الجمع بين 1 ميكرولتر من محول HD 3 'preadenylated 3 ' (10 درجة مئوية) مع 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الصغير النقي (~ 0.1-1 درجة مئوية) في أنبوب الطرد المركزي الصغير 0.2 مل. حضانة لمدة 2 دقيقة في 72 درجة مئوية في دورة الحرارية، ثم وضع مباشرة على الجليد.
    2. إضافة 4 ميكرولتر من 50٪ PEG 8000 (محلول لزج؛ pipet ببطء)، 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الرباطي العازلة (10X)، 1 ميكرولتر من H2O، 1 ميكرولتر من T4 RNA ligase2 اقتطاع، و 1 ميكرولتر من مثبطات RNase. الحضانة بين عشية وضحاها عند 16 درجة مئوية.
  2. القضاء على محول 3 'غير الليغا
    1. أضف 10 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلووووووووووووون واخلطي جيداً. إضافة 6 ميكرولتر من 3 M NaOAc درجة الحموضة 5.2 أو "محول استنفاد الحل" من مجموعة Nf(جدول المواد)ومزيج جيدا. إضافة 40 درجة مئوية من حبات تنقية المغناطيسي(جدول المواد)و 60 درجة مئوية من isopropanol ومزيج جيدا. الحضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. ضع العينة في رف مغناطيسي حتى يظهر الحل واضحًا. إزالة وتجاهل supernatant.
    3. إضافة 180 درجة مئوية من الإيثانول أعدت حديثا 80٪. حضانة ل ~ 30 s، ثم إزالة. الحرص على استخدام الإيثانول أعدت حديثا 80٪ ولا حضانة مع الإيثانول 80٪ لفترات طويلة.
    4. تدور لفترة وجيزة الأنبوب وإزالة السائل المتبقية التي قد تكون جمعت في الجزء السفلي من البئر. دع الخرز يجف لمدة دقيقتين، ثم أعيد تعليقه في 22 ميكرولتر من 10 mM Tris pH 8 أو المخزن المؤقت لإعادة التعليق من مجموعة Nf. حضانة لمدة 2 دقيقة، ثم مغنطة العينة حتى يظهر الحل واضحة.
    5. إضافة 6 μL من 3 M NaOAc درجة الحموضة 5.2 أو "محول استنفاد الحل" من مجموعة Nf(جدول المواد)إلى أنبوب جديد. نقل 20 درجة مئوية من supernatant من الخطوة السابقة إلى هذا الأنبوب الجديد ومزيج من قبل pipetting. إضافة 40 درجة مئوية من الخرز المغناطيسي و 60 درجة مئوية من 100٪ isopropanol ومزيج جيدا عن طريق الأنابيب. الحضانة لمدة 5 دقائق.
    6. مغنطة العينة حتى يظهر الحل واضحة، ثم إزالة وتجاهل supernatant.
    7. إضافة 180 درجة مئوية من الإيثانول أعدت حديثا 80٪. حضانة ل ~ 30 s، ثم إزالة. Take الرعاية لاستخدام الإيثانول أعدت حديثا 80٪ ولا حضانة لمع الإيثانول 80٪ لفترات طويلة.
    8. تدور لفترة وجيزة الأنبوب وإزالة السائل المتبقية التي قد تكون جمعت في الجزء السفلي من البئر. يُترك الخرز جافًا لمدة دقيقتين، ويُعلّق من جديد في 10 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكل. حضانة لمدة 2 دقيقة، ثم مغنطة العينة حتى يظهر الحل واضحة.
    9. نقل 9 ميكرولتر من supernatant إلى أنبوب جديد. إضافة 1 ميكرولتر من T4 RNA ligase العازلة (10X) و 1 ميكرولتر من الماء. بدلاً من ذلك، إضافة 2 μL من المخزن المؤقت ligase من مجموعة TS.
  3. ربط محول 5 '.
    1. إضافة 1 ميكرولتر من محول HD 5 ' (10 درجة مئوية; الجدول 1) إلى أنبوب PCR 200 ميكرولتر في دورة الحرارية مع غطاء ساخن. حضانة لمدة 2 دقيقة في 70 درجة مئوية، ثم وضع الأنبوب مباشرة على الجليد.
    2. إضافة 1 درجة مئوية من ATP 10 mM و 1 ميكرولتر من T4 RNA ligase 1. يُمزج المزيج جيّداً بالأنابيب برفق. إضافة 3 μL من هذا المزيج إلى الحمض النووي الريبي 3 'ligated من الخطوة 3.2.9 ومزيج من الأنابيب. حضانة لمدة 1 ساعة عند 28 درجة مئوية.
  4. النسخ العكسي (RT)
    1. نقل 6 μL من 3 ' و 5 ' محول ليغاد RNA إلى أنبوب PCR جديد 200 μL (الحفاظ على ما تبقى ~ 8 درجة مئوية في -80 درجة مئوية للاستخدام في وقت لاحق إذا لزم الأمر). إضافة 1 ميكرولتر من التمهيدي RT (10 درجة مئوية; الجدول 1) ومزيج من قبل الأنابيب. حضانة لمدة 2 دقيقة في 70 درجة مئوية، ثم وضع الأنبوب مباشرة على الجليد.
    2. إضافة الكواشف التالية لRT: 2 μL من 5X المخزن المؤقت حبلا الأولى، 0.5 ميكرولتر من 12.5 مل dNTP مزيج، 1 ميكرولتر من 100 MM DTT، 1 ميكرولتر من مثبطات RNase، و 1 ميكرولتر من النسخ العكسي(جدول المواد). حضانة لمدة 1 ساعة عند 50 درجة مئوية.
  5. تضخيم PCR
    1. تضاف الكواشف التالية إلى خليط التفاعل RT الذي تبلغ 12.5 ميكرولتر: 10 ميكرولتر من المخزن الاحتياطي للبوليميراز PCR، و2 ميكرولتر من التمهيدي العالمي P5 (10 ميكرومتر؛ الجدول 1)،2 ميكرولتر من التمهيدي P7-مؤشر (10 درجة مئوية؛ الجدول 1)،و1 ميكرولتر من 12.5 مليون متر من الدنتس، و0.5 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي(جدول المواد)،و22 ميكرولتر من الماء. الحفاظ على رد الفعل على الجليد حتى الاستخدام.
    2. تشغيل برنامج PCR التالية: 98 درجة مئوية لمدة 30 ق، 11 دورات (98 درجة مئوية ل 10 ق، 60 درجة مئوية لمدة 30 ق و 72 درجة مئوية لمدة 15 ق) و 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: فيما يتعلق بعدد دورات PCR: نقوم عادةً بتنفيذ 11 دورة ولكن يجب تحسين هذا من قبل المستخدم. حاول تنفيذ أصغر عدد ممكن من دورات PCR.
  6. تنقية الجل
    1. تشغيل 5، 10 و 20 ميكرولتر من المنتج PCR على هلام TBE الأصلي 6٪ (انظر جدول المواد)جنبا إلى جنب مع سلم مناسب (انظر جدول المواد). تشغيل هلام لحوالي 1 ساعة في 145 V (حتى الأزرق بروموفينول يصل إلى القاع؛ هذه الصبغة يهاجر في موقف 65 نقطة بقوة حصانة).
    2. إزالة هلام، وحضانة مع وصمة عار هلام حمض نووي (انظر جدول المواد)في الماء لمدة 10-15 دقيقة.
    3. عرض هلام على "قارئ الظلام" عبر المضيء (فمن المستحسن بشدة لتجنب الأشعة فوق البنفسجية لأن هذا قد يضر الحمض النووي الريبي) وقطع الفرقة مكتبة في 150 bp. إعداد نظام لelute RNA من هلام كما هو موضح في الخطوة 1.5 ونقل قطعة هلام إلى أنبوب 0.5 مل.
    4. الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي صغير في السرعة القصوى لمدة 2 دقيقة.
    5. إضافة 300 درجة مئوية من المياه الخالية من nuclease إلى أنبوب 2 مل التي تحتوي على هلام سحقت وتناوب لمدة 2 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    6. نقل تعليق قطع هلام سحقت في الماء إلى عمود تدور والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في السرعة القصوى.
    7. إضافة 1 ميكرولتر من (20 ميكروغرام / ميكرولتر) الجليكوجين، 30 ميكرولتر من 3 M NaOAc و 975 ميكرولتر من الجليد البارد 100٪ الإيثانول. الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في السرعة القصوى في 4 درجة مئوية.
    8. إعادة تعليق بيليه في 20 درجة مئوية من 10 MM تريس pH8. استخدم 1 ميكرولتر لقياس التركيز و1 ميكرو لتر لمراقبة الجودة.

4 - تحليل البيانات

ملاحظة: يستند إجراء تحليل البيانات الموضحة أدناه إلى نظام التشغيل Linux أوبونتو 16.04 LTS.

  1. معالجة ملفات التسلسل الخام
    1. قم بتنزيل ملف (ملفات) تسلسل FASTQ التي تم إنشاؤها أثناء تشغيل التسلسل. إذا لزم الأمر، قم بإجراء إلغاء تعدد الإرسال باستخدام bcl2fastq2 (الإصدار V2.2.18.12؛ ويمكن تنزيل دليل من الرابط التالي: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
      استخدم الأمر التالي:
      nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq --runfolder-dir Pathway_of_Run --ignore-missing-bcl --Output-dir Pathway_of_Output_Directory --barcode-mismatch 1 --التجميع البلاط AUTO-r 16 -d 16 -p 16 -w 16
    2. إزالة تسلسلات المحول باستخدام Cutadapt19 الإصدار 1.15. يمكن تحميل دليل هنا: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
      استخدم الأمر التالي:
      [سطول_تو_كتتكييف] / cutadapt-a TGGAATTCTCGTGCCAAGG -n 5 -O 4 -m 10-j 0 --nextseq-trim 10 -o Output_File_Read1_cutadapt.fastq.gz Input_File_Read1.fastq.gz Input_File_Read1 .fastq.gz
      لاحظ أن التسلسل في الأمر يتوافق مع محول HD 3 'دون النيوكليوتيدات العشوائية 4; ولذلك لن تتم إزالة هذه خلال هذه الخطوة.
    3. استخدام seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) لإزالة النيوكليوتيدات العشوائية الطرفية في يقرأ التسلسل. استخدم الأمر التالي (أسماء المتغيرات بخط غامق):
      seqtk trimfq -b 4 -e 4 إخراج_ملف_Read1_cutadapt .fastq > إخراج_ملف_قراءة1 _قلص .fastq
    4. استخدم الأمر awk التالي لتجاهل تسلسلات أقصر من 10 nt:
      awk 'BEGIN {FS = "\t" ; OFS = "\n"} {رأس = $0 ; getline seq ; getline qheader ; getline qseq ; إذا (طول(seq) >= 10) {رأس الطباعة, seq, qheader, qseq}}' Output_File_Read1_rimmed.fastq > Length_Filtered.fastq
  2. تعيين التسلسلات المشذبة
    1. تحميل قاعدة البيانات المقابلة للكائن الحي للدراسة من miRBase على النحو التالي. انتقل إلى http://www.mirbase.org/ftp.shtml وتنزيل ملف 'mature.fa'. لاحظ أن تتم الإشارة إلى التسلسلات في تدوين RNA. استبدال المخلفات U بواسطة T الأمر التالي:
      Sed -i '/^>/! s/U/T/g'mature.fa
      ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى قائمة كاملة بجميع الميلانينات في miRBase، التي تنشأ من مجموعة متنوعة من الكائنات الحية.
    2. حدد تسلسل miRNA الكائن الحي الخاص بك من الفائدة مع الأمر التالي:
      awk 'name_of_the_organism{print; nr[NR+1]; next}; NR في nr' mature.fa >ناضجة_ name_of_the_organism_mirs.fa
    3. تعيين القراءة إلى الملف الذي تم إنشاؤه أعلاه باستخدام Bowtie220 (الإصدار 2.3.0) السماح عدم التطابق. أولاً، إنشاء فهرس للملف الخاص بك مع الأمر التالي:
      بووتي2-بناء ناضجة_name_of_the_organism_mirs.faناضجة_ name_of_the_organism_mirs
    4. محاذاة يقرأ التسلسل إلى قاعدة البيانات، مما يتطلب أن يقرأ قراءة تماماً إلى miRNA من قاعدة البيانات، دون أي عدم تطابق. لهذه الغاية، استخدم الأداة التالية:
      bowtie2 -N 0 -L 10 -score-min C,0,0 -end-to-end-time-x mature_name_of_the_organism_mirs-U Length_Filtered.fastq-S Length_Filtered_ALIGNMENT.sam
      ملاحظة: الخيار: ---النتيجة دقيقة C,0,0 يضمن أن المحاذاة بدون أي عدم تطابق. للحصول على شرح لمختلف المعلمات في الأداة، يرجى زيارة الموقع التالي: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml
    5. لتجاهل القراءة التي لم تتم محاذاة، استخدم الأمر التالي:
      samtools عرض -F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT.sam > Reads_aligned_to_Mirs.sam
      ملاحظة: نتيجة لهذه الخطوات، يجب الآن الحصول على قراءات محاذاة، المقابلة لmiRNAs.

النتائج

الخطوات الحاسمة هي عزل جزء RNA الصغيرة من المواد RNA مجموع البداية (الشكل 3) والمنتج المكتبة النهائية المطلوب (الشكل 4). كلا الخطوات تنطوي على تنقية هلام بوليأكريلاميد; يتم عزل الحمض النووي الريبي الصغيرة من 15٪ TBE هلام اليوريا، في حين يتم عزل المكتبات النهائية م?...

Discussion

إعداد مكتبة RNA الصغيرة لا يزال تحديا بسبب التحيز، التي أدخلت أساسا خلال خطوات ربط محول. RNAs مع تعديل 2'-OMe في نهايتها 3 'مثل miRNAs النبات، piRNA في الحشرات، الديدان الخيطية والثدييات، وRNAs التدخل الصغيرة (siRNA) في الحشرات والنباتات من الصعب بشكل خاص لدراسة لأن تعديل 2'-OMe يمنع ربط محول 3'. وقد اقتُرح عدد ?...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل المركز الوطني للبحوث العلمية، واللجنة الفرنسية للطاقات البديلة والطاقة الذرية، وجامعة باريس - سود. وقد أجريت جميع عمليات إعداد المكتبة وتسلسل إلومينا وتحليلات المعلوماتية الحيوية لهذه الدراسة في مرفق التسلسل من الجيل التالي من الـ I2BC. ويُعترف بأعضاء مرفق I2BC NGS للقراءة النقدية للمخطوطة والاقتراحات المفيدة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2100 Bioanalyzer Instrument AgilentG2939BA
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)ThermoFisherAM9720
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)Nex England BiolabsP0756S
Agencourt AMPure XP beadsBeckman CoulterA63880
Bioanalyzer High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626
Bioanalyzer Small RNA KitAgilent5067-1548
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filtersSigma AldrichCLS8162-96EA
Dark Reader transilluminatorvarious suppiers
HotStart PCR Kit, with dNTPsKapa BiosystemsKK2501
NEXTflex small RNA-seq V3 kitBIOO ScientificNOVA-5132-05optional
Novex TBE gels 6%ThermoFisherEC6265BOX
Novex TBE Urea gels 15%ThermoFisherEC6885BOX
QIAquick Nucleotide Removal KitQiagen 28304
Qubit 4 Quantitation Starter KitThermoFisherQ33227
Qubit ssDNA Assay KitThermoFisherQ10212
RNA Gel Loading Dye (2X)ThermoFisherR0641
RNA Gel Loading Dye (2X)ThermoFisherR0641
RNase Inhibitor, Murine Nex England BiolabsM0314S
SuperScript IV Reverse TranscriptaseThermoFisher18090200
SYBR Gold Nucleic Acid Gel StainThermoFisherS11494
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)Nex England BiolabsM0204S
T4 RNA Ligase 2, truncatedNex England BiolabsM0242S
TrackIt 50 bp DNA ladderThermoFisher10488043
TruSeq Small RNA Library Prep KitIlluminaRS-200-0012/24/36/48optional
UltraPure GlycogenThermoFisher10814010
XCell SureLock Mini-CellThermoFisherEI0001
XCell SureLock Mini-CellThermoFisherEI0001
ZR small RNA ladderZymo ResearchR1090
the last two numbers correspond to the set of indexes

References

  1. Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
  2. Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
  3. Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).
  4. van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
  5. Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
  6. Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
  7. Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4 (2012).
  8. Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
  9. Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).
  10. Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).
  11. Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049 (2015).
  12. Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118 (2018).
  13. Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969 (2011).
  14. Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
  15. Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619 (2014).
  16. Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109 (2013).
  17. Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105 (2018).
  18. Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41 (2012).
  19. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
  20. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
  21. Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

151RNARNA seqNGS2 O 2 OMe RNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved