АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем подробный небольшой протокол репарации библиотеки РНК с меньшим уклоном, чем стандартные методы и повышенной чувствительностью для 2'-O-метил РНК. Этот протокол можно соблюдать с помощью самодельных реагентов, чтобы сэкономить стоимость или с помощью комплектов для удобства.

Аннотация

Изучение малых РНК (РНК) по секвенированию следующего поколения (NGS) оспаривается проблемами предвзятости при подготовке библиотеки. Несколько типов сРНК, таких как микроРНК растений (миРНК) имеют модификацию 2'O-метил (2'-OMe) на их 3' терминал нуклеотида. Эта модификация добавляет еще одну трудность, поскольку она подавляет 3' перевязки адаптера. Ранее мы продемонстрировали, что модифицированные версии протокола 'TruSeq (TS)' имеют меньшую предвзятость и улучшенное обнаружение 2'-OMe РНК. Здесь мы подробно описываем протокол 'TS5', который показал лучшую общую производительность. За TS5 можно следить либо с помощью самодельных реагентов, либо реагентов из комплекта TS, с одинаковой производительностью.

Введение

Малые РНК (РНК) участвуют в контроле разнообразия биологических процессов1. Eukaryotic нормативных sRNAs, как правило, между 20 и 30 nt в размере; три основных типа: микроРНК (miRNA), piwi-взаимодействующих РНК (piRNA) и малых интерферирующих РНК (siRNA). Аномальные уровни экспрессии miRNA были вовлечены в различные заболевания2. Это подчеркивает важность миРНК в области здравоохранения и болезней и потребность в точных количественных исследовательских инструментах для выявления СРНК в целом.

Секвенирование следующего поколения (NGS) является широко используемым методом изучения сРНК. Основные преимущества NGS по сравнению с другими подходами, такими как количественные методы ПЦР или microarray (qPCR), заключаются в том, что он не нуждается в априори знания последовательностей сРНК и поэтому может быть использован для обнаружения новых РНК, и, кроме того, он страдает меньше фоновый сигнал и эффекты насыщения. Кроме того, он может обнаружить одно нуклеотидные различия и имеет более высокую пропускную мощность, чем microarrays. Тем не менее, NGS также имеет некоторые недостатки; стоимость последовательного запуска остается относительно высокой, и многоступенчатый процесс, необходимый для преобразования образца в библиотеку для секвенирования, может привести к смещениям. В типичном процессе подготовки библиотеки sRNA, 3' адаптер сначала ligated к sRNA (часто гель-очищенной от полной РНК) используя усеченную версию RNA ligase 2 (RNL2) и preadenylated 3' адаптер(Рисунок 1) в отсутствии ATP. Это повышает эффективность перевязки sRNA-адаптера и уменьшает образование побочных реакций, таких как циркуляризация sRNA или конкатегоризация. Впоследствии 5' адаптер сливается с помощью РНК лигаза 1 (RNL1), а затем обратная транскрипция (RT) и pcR усиление. Все эти шаги могут ввести предвзятость3,4. Следовательно, считываемые числа могут не отражать фактические уровни экспрессии sRNA, ведущие к искусственным, зависимым от метода шаблонам выражения. Конкретные СРНК могут быть либо чрезмерно или недопредставлены в библиотеке, а сильно недопредставленные СРНк могут избежать обнаружения. Особенно сложная ситуация с растительными миРНКами, сиРНК у насекомых и растений, а также пиРНК у насекомых, нематод и млекопитающих, в которых 3' терминальный нуклеотид имеет 2'O-метил (2'-OMe) модификацию1. Эта модификация сильно подавляет перевязку 3' адаптера5,что делает подготовку библиотеки для этих типов РНК трудной задачей.

Предыдущая работа показала, что перевязка адаптера вводит серьезные предубеждения, из-за РНК последовательности / структурных эффектов6,7,8,9,10,11. Шаги вниз по течению перевязки адаптера, такие как обратная транскрипция и ПЦР, существенно не способствуют смещению6,11,12. Смещение лигации, вероятно, связано с тем, что молекулы адаптера с заданной последовательностью будут взаимодействовать с молекулами SRNA в реакционной смеси для формирования сгибов, что может либо привести к благоприятным или неблагоприятным конфигурациям для перевязки(рисунок 2). Данные Sorefan et al7 свидетельствуют о том, что RNL1 предпочитает один контекст, в то время как RNL2 предпочитает двойную нить для перевязки. Тот факт, что структуры совместного сгиба адаптера/sRNA определяются конкретным истектором адаптера и последовательностями sRNA, объясняет, почему конкретные sRNA чрезмерно или недопредставлены с данным набором адаптера. Важно также отметить, что в рамках серии библиотек sRNA для сопоставления следует использовать одни и те же последовательности адаптера. Действительно, ранее было отмечено, что изменение адаптеров путем введения различных последовательностей штрих-кодов изменяет профили miRNA в секвенирующих библиотеках9,13.

Рандомизация последовательностей адаптера вблизи перевязочных узлов, вероятно, уменьшает эти предубеждения. Sorefan и коллеги7 использовали адаптеры с 4 случайных нуклеотидов на их конечностях, назначенных "Высокой четкости" (HD) адаптеры, и показал, что использование этих адаптеров привести к библиотекам, которые лучше отражают истинные уровни экспрессии SRNA. Более поздние работы подтвердили эти наблюдения и показали, что рандомизированный регион не должен быть рядом с перевязочную перевязку11. Этот новый тип адаптеров был назван "MidRand" адаптеры. В совокупности эти результаты показывают, что улучшение конструкции адаптера может уменьшить предвзятость.

Вместо того, чтобы изменять адаптеры, смещение может быть подавлено путем оптимизации условий реакции. Полиэтиленгликоль (PEG), макромолекулярный скученность агент, как известно, увеличение эффективности перевязки14, было показано, значительно уменьшить предвзятость15,16. На основе этих результатов на рынке появилось несколько комплектов "низкой предвзятости". К ним относятся комплекты, которые используют PEG в реакции перевязки, либо в сочетании с классическими адаптерами или HD адаптеры. Другие комплекты избежать перевязки в целом, и использовать 3' полиаденилаации и шаблона переключения для 3' и 5' адаптер дополнение, соответственно12. В еще одной стратегии, 3' перевязка адаптера сопровождается круговой шаг, таким образом, опуская 5' адаптер перевязки17.

В предыдущем исследовании мы искали протокол подготовки библиотеки sRNA с наименьшими уровнями смещения и лучшим обнаружением 2'-OMe РНК12. Мы протестировали некоторые из вышеупомянутых комплектов «низкого смещения», которые имели лучшее обнаружение 2'-OMe РНК, чем стандартный протокол (TS). Удивительно, однако, при модификации (использование рандомизированных адаптеров, PEG в реакции перевязки и удаление избытка 3' адаптера путем очистки) последний превзошел другие протоколы для обнаружения 2'-OMe РНК. Здесь мы подробно описываем протокол, основанный на протоколе TS, 'TS5', который имел лучшее общее обнаружение 2'-OMe РНК. Протокол можно соблюдать с помощью реагентов из комплекта ТС и одного реагента из комплекта «Nf» или, чтобы сэкономить деньги, с помощью самодельных реагентов, с одинаковой производительностью. Мы также предоставляем подробный протокол для очистки сРНК от общей РНК и подготовки предаденина 3' адаптера.

протокол

1. Изоляция малых РНК

  1. Извлекайте полную РНК с помощью реагентов на основе фенола или любого другого метода. Проверьте, является ли РНК хорошего качества.
  2. Предварительно запустить 15% TBE-мочевого геля (см. Таблица материалов) в течение 15 мин при 200 В.
  3. В то время как гель предварительно работает, смешать 5-20 мкг общего РНК в 5-15 л объема с равным объемом formamide загрузки красителя (см. Таблица Материалов; 95% деионизированной формамид, 0,025% бромофенол синий, 0,025% ксилена цианола, 5 мМ PCTA pH 8) в 200 л. Аналогичным образом, смешайте 10 кЛ (200 нг) мелкой РНК-лестницы (см. Таблица материалов)с равным объемом погрузочного красителя formamide. Инкубировать в течение 5 мин при 65 градусах По Цельсия в термоцикле с нагретой крышкой, затем поместите трубки сразу на лед.
  4. Загрузите лестницу и образец на тот же гель с по крайней мере одной полосой между ними и запустить на 200 V до бромофенола синий (темно-синий) мигрировали около двух третей длины геля (примерно 40 мин).
  5. Подготовьте систему, чтобы вычеркнить РНК из геля следующим образом: прокол нижней части нуклеазы свободной 0,5 мл микро центрифуги трубки с 21-калиберной иглой. Поместите прокол0,5 мл трубки в нуклеазе-бесплатно едкой 2 мл микроцентрифуги трубки.
  6. Удалить гель, и инкубировать при комнатной температуре с 3 юклеиновой кислоты гель пятно (10000 х концентрат; см. Таблица материалов) в 30 мл воды в течение 10-15 мин.
  7. Посмотреть гель на транс-иллюминатор "Темный читатель" (настоятельно рекомендуется, чтобы избежать УФ, как это может повредить РНК) и вырезать образец РНК между 17 nt и 29 nt лестницы полос. Перенесите кусок геля в трубку 0,5 мл со ступени 1,5.
  8. Centrifuge 0,5 мл трубки в 2 мл трубки в микро центрифуги на максимальной скорости в течение 2 мин. Удалите 0,5 мл трубки, которая должна быть пустой сейчас.
  9. Добавьте 300 qL без нуклеаза 0,3 М NaCl в трубку 2 мл, содержащую измельченный гель, и поверните по крайней мере 2 ч при комнатной температуре или при температуре 4 градусов по Цельсию (16 ч).
  10. Перенесите подвеску измельченных кусочков геля в колонку спина (см. Таблица Материалов)и центрифугу на 2 мин на максимальной скорости в микроцентрифуге.
  11. Добавьте 1 кЛ (20 мкг/Л) гликогена (см. Таблицу Материалов)и 950 л комнатной температуры 100% этанола. Инкубировать не менее 30 мин при -80 градусах По Цельсию.
  12. Центрифуга в течение 20 минут на максимальной скорости в микроцентрифуге при 4 градусах Цельсия. Удалить супернатант, вымыть гранулы с 800 л холодного 80% этанола. Центробежа снова в течение 5 мин при 4 градусах по Цельсию, и осторожно удалите все супернатанты. Повторное увеличение РНК-гранул в 15 л безнужной воды. Как правило, следует восстановить 5-20 нг мелкой РНК, в зависимости от количества входного общего ОБЪЕМА РНК (1 нг небольшой РНК на 1 мкг входного общего объема РНК).
  13. Рекомендуемый дополнительный шаг: Проверьте количество и качество восстановленной сРНК (например, с помощью капиллярного геля электрофорасиса с помощью небольшого комплекта РНК; см. Таблица материалов).

2. Подготовка предаденилатированный 3' HD адаптер

ПРИМЕЧАНИЕ: Преаденэлация 3' HD адаптер был сделан таким образом, похожим на протокол, описанный Чэнь идр. Обратите внимание, что предаденилатированный адаптер можно заказать напрямую (/5rApp/модификация), но это довольно дорого.

  1. Заказать 5' фосфорилированный, 3' заблокирован 3' HD адаптер олигонуклеотид. Смотрите таблицу 1 для последовательности и модификаций. Обратите внимание, что '3AmMO' является 3' аминомодификатор группы, большинство поставщиков могут производить олигонуклеотид с этой модификацией. Разбавить в нуклеазе свободной воды до 100 км.
  2. Настройка реакции 100 л, содержащая следующие реагенты: 10 л олиго (100 мкм), 10 л буфера Лиги Т4 РНК (10x), 10 л АТФ (10 мМ), 40 л 50% PEG8000, 5 л T4 RNA ligase 1 (50 единиц), 25 L Инкубировать ночь при 20 градусах Цельсия.
  3. Выполните классическую добычу фенола-хлороформа из предаденилатного олигонуклеотида с последующим итанолом осадков. Добавьте 100 кЛ кислоты (pH 4.5) фенола: хлороформ и вихрь. Спин в течение 5 минут при комнатной температуре, максимальной скорости. Тщательно перенесите 90 л верхней фазы на новую трубку; добавьте 10 кл/л 3 М ацетата натрия pH 5.2, 1 л ультра-чистого гликогена и 250 л холодного 100% этанола.
  4. Держите сью 20 градусов по Цельсию в течение не менее 30 мин. Центрифуге в течение 30 мин при максимальной скорости 4 градуса По Цельсию. Удалить супернатант, вымыть гранулы один раз с 500 Л холодного 80% этанола. В качестве альтернативы экстракции фенола хлороформа и осадка в этанол можно использовать комплект удаления нуклеотидов (см. Таблицу Материалов). Повторное вводе воды в 25 л.
  5. Измерьте концентрацию адаптера с помощью комплекта для конкретного обнаружения одноцепочечной ДНК (см. Таблицу Материалов). Разбавить до 80 нг/л (10 мкм).
  6. Рекомендуемый дополнительный шаг: Проверьте эффективность преадениэлирования путем миграции 1 зл 1 л из 10 мкм адаптер на 15% TBE-мочевой гель (Таблица материалов) вместе с необработанным олигонуклеотидом. Предаденированный адаптер должен мигрировать немного медленнее, чем необработанный олигонуклеотид. При желании предаденированный адаптер может быть очищен от геля; продолжение, как описано выше (шаги 1.2-1.12).

3. Подготовка библиотеки - Протокол TS5

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы представляем здесь модифицированный протокол TS 'TS5', который мы описали ранее12 и который может быть выполнен либо с реагентами из комплекта, либо с самообеспеченными реагентами. Следует отметить, что мы получили аналогичные или даже чуть лучшие результаты с другим протоколом, 'TS7'. Однако с TS7 труднее устранить димеры адаптера. Поэтому мы предпочли подробно описать TS5, но за TS7 может последовать просто замена адаптеров. Для TS7 используйте адаптерные последовательности 'MidRand-Like (MRL)'(таблица 1). Обратите внимание, что здесь рандомизированные области находятся в середине адаптеров. Праймеры для обратной транскрипции и ПЦР будут гибридизироваться с последовательностями вниз по течению рандомизированной области в 3' адаптер и вверх по течению рандомизированной области в 5' адаптер. Секвенирование начнется с первого рандомизированного нуклеотида в 5' адаптере.

  1. 3' перевязка адаптера.
    1. Объедините 1 зл предаденированного 3' HD адаптера (10 мкм) с 1 злочищеной небольшой РНК (0,1-1 мкм) в микроцентрифуговой трубке 0,2 мл. Инкубировать в течение 2 мин при 72 градусах По Цельсию в термоциклисте, затем положить прямо на лед.
    2. Добавьте 4 злиц 50% PEG 8000 (вязкий раствор; труба медленно), 1 Зл буфера лигазы РНК (10x), 1 Зл H2O, 1 Зл T4 РНК ligase2 усеченный, и 1 Зл ингибитора RNase. Инкубировать на ночь при 16 градусах Цельсия.
  2. Ликвидация разгертетов 3' адаптера
    1. Добавьте 10 кл.л. безнуса воды и хорошо перемешайте. Добавьте 6 злотизму 3 M NaOAc pH 5.2 или «Решение по истощению адаптера» из комплекта Nf(Таблица материалов)и хорошо перемешайте. Добавьте 40 зЛ магнитных очистных шариков(Таблица Материалов)и 60 л изопропанола и хорошо перемешайте. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
    2. Поместите образец в магнитную стойку, пока решение не появится ясным. Удалите и отбросьте супернатант.
    3. Добавьте 180 л свежеприготовленного 80% этанола. Инкубировать за 30 с, затем удалить. Позаботьтесь, чтобы использовать свежеприготовленные 80% этанола и не инкубировать с 80% этанола в течение длительных периодов.
    4. Кратко спина трубки и удалить остаточной жидкости, которые, возможно, собрали в нижней части колодца. Пусть бусы высохнут в течение 2 мин, затем повторно в 22 л 10 мМ Tris pH 8 или resuspension буфера из комплекта Nf. Инкубировать в течение 2 мин, затем намагничить образец, пока раствор не появится ясным.
    5. Добавьте 6 кЛ 3 M NaOAc pH 5.2 или 'Решение по истощению адаптера' из комплекта Nf(Таблица материалов)в новую трубку. Передача 20 зл и супернатант с предыдущего шага на эту новую трубку и перемешать путем пипетки. Добавьте 40 л магнитных бусин и 60 л 100% изопропанола и хорошо перемешайте путем пипетки. Инкубировать в течение 5 мин.
    6. Магнитизировать образец, пока решение появляется ясно, а затем удалить и отбросить супернатант.
    7. Добавьте 180 л свежеприготовленного 80% этанола. Инкубировать за 30 с, затем удалить. Take уход использовать свежеприготовленный 80% этанола и не инкубировать для 80% этанола в течение длительных периодов.
    8. Кратко спина трубки и удалить остаточной жидкости, которые, возможно, собрали в нижней части колодца. Пусть бусы высохнут в течение 2 мин, и повторно в 10 зл и без nuclease воды. Инкубировать в течение 2 мин, затем намагничить образец, пока раствор не появится ясным.
    9. Передача 9 Зл супернатанта в новую трубку. Добавьте 1 qL буфера лигазы T4 РНК (10x) и 1 зл воды. Кроме того, добавьте 2 юл буфера лигазэ из комплекта ТС.
  3. Лигация 5' адаптера.
    1. Добавить 1 юл 5' HD адаптер (10 мкм; Таблица 1) до 200 Л ПЦР трубки в термоциклер с нагретой крышкой. Инкубировать в течение 2 мин при 70 градусах Цельсия, затем положить трубку прямо на лед.
    2. Добавьте 1 зл 10 мМ АТФ и 1 Зл Т4 РНК лигаза 1. Хорошо перемешать, аккуратно пипетка. Добавьте 3 зЛ этой смеси в 3' ligated РНК от шага 3.2.9 и перемешайте путем пипетки. Инкубировать в течение 1 ч при 28 градусах Цельсия.
  4. Обратная транскрипция (RT)
    1. Передача 6 злификатора 3' и 5' адаптера ligated РНК в новую трубку ПЦР 200 л (держать оставшиеся 8 евро при -80 градусов по Цельсию для последующего использования в случае необходимости). Добавить 1 злиц rt грунтовки (10 мкм; Таблица 1) и смешивать путем пипетки. Инкубировать в течение 2 мин при 70 градусах Цельсия, затем положить трубку прямо на лед.
    2. Добавьте следующие реагенты для RT: 2 злитромы 5x первого буфера пряди, 0,5 л 12,5 мМ dNTP смеси, 1 л 100 мМ DTT, 1 л ингибитора RNase, и 1 л обратной транскриптазы (Таблица материалов). Инкубировать в течение 1 ч при 50 градусах Цельсия.
  5. Усиление ПЦР
    1. Добавьте следующие реагенты в 12,5 л реакционной смеси РТ: 10 л буфера полимеразы ПЦР, 2 злиц универсальной грунтовки P5 (10 мкм; Таблица 1, 2 л p7-индекса грунтовки (10 мкм; Таблица 1), 1 л 12,5 мМ dNTPs, 0,5 л полимеразы ДНК(Таблица материалов), и 22 л воды. Держите реакцию на льду до использования.
    2. Запустите следующую программу ПЦР: 98 градусов по Цельсию на 30 с, 11 циклов (98 градусов по Цельсию на 10 с, 60 градусов по Цельсию для 30 с и 72 градусов по Цельсию для 15 с) и 72 градусов по Цельсию в течение 10 мин. Держите реакцию при 4 градусах по Цельсию, когда закончите.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Что касается количества циклов ПЦР: обычно мы выполняем 11 циклов, но это должно быть оптимизировано пользователем. Попробуйте выполнить наименьшее количество циклов ПЦР.
  6. Очистка геля
    1. Выполнить 5, 10 и 20 л ПЦР продукта на родном 6% TBE гель (см. Таблица материалов) вместе с подходящей лестницей (см. Таблица материалов). Выполнить гель около 1 ч на 145 V (до бромофенола синий достигает дна; этот краситель мигрирует в положении 65 bp).
    2. Удалить гель, и инкубировать с нуклеиновой кислотой гель пятно (см. Таблица материалов) в воде в течение 10-15 мин.
    3. Посмотреть гель на "Темный читатель" транс-иллюминатор (настоятельно рекомендуется, чтобы избежать УФ, как это может повредить РНК) и вырезать библиотеку полосы на 150 bp. Подготовьте систему, чтобы удлинить РНК из геля, как описано в шаге 1.5 и передать кусок геля на 0,5 мл трубки.
    4. Центрифуга в микроцентрифуге на максимальной скорости в течение 2 мин. Удалите трубку 0,5 мл, которая должна быть пуста сейчас.
    5. Добавьте 300 л воды без нуклеаза в трубку 2 мл, содержащую измельченный гель, и поверните по крайней мере 2 ч при комнатной температуре или при температуре 4 градусов Цельсия на ночь.
    6. Перенесите подвеску измельченных кусочков геля в воде в спин-колонку и центрифугу на 2 мин на максимальной скорости.
    7. Добавьте 1 зл (20 мкг/Л) гликогена, 30 л из 3 М НаОАК и 975 л ледяного холода 100% этанола. Центрифуга в течение 20 минут на максимальной скорости при 4 градусах Цельсия.
    8. Приостановите гранулы в 20 л 10 мМ Tris pH8. Используйте 1 зл для измерения концентрации и 1 Зл для контроля качества.

4. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура анализа данных, описанная ниже, основана на операционной системе Linux Ubuntu 16.04 LTS.

  1. Обработка необработанных файлов последовательности
    1. Загрузите файл последовательность FAST (ы), сгенерированный во время выполнения последовательности. При необходимости выполните демонксинг с bcl2fastq2 (версия V2.2.18.12; руководство можно загрузить по следующей ссылке: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
      Используйте следующую команду:
      nohup Pathway-of'bcl2fastq/bcl2fastq --runfolder-dir Pathway-of-Run--ignore-missing-bcl --выход-dir Pathway-of-Output-Directory --barcode-mismatches 1 --агрегированные плитки AUTO -r 16-d 16 -p 16 -w 16
    2. Удалите последовательности адаптера с помощью версии Cutadapt19 1.15. Руководство можно скачать здесь: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
      Используйте следующую команду:
      Путьк-ккатада/ cutadapt-TGGAATCTCGGGGTGCCAAGG -n 5 -O 4 -м 10 -j 0 --nextseq-trim 10 -o Выход-Файл-Читать1'cutadapt.fastq.gz Ввода-File
      Обратите внимание, что последовательность в команде соответствует 3' HD адаптер без 4 случайных нуклеотидов; поэтому они не будут удалены во время этого шага.
    3. Используйте seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) для удаления терминала случайных нуклеотидов в секвенировании. Используйте следующую команду (переменные имена жирным шрифтом):
      seqtk trimfq -b 4 -e 4 Выходное-Филе-Read1'cutadapt .fastq Выходное-файле-Чтение1 Обрезается .fastq
    4. Используйте следующую команду awk для того, чтобы отказаться от последовательностей короче 10 nt:
      awk 'BEGIN ЗФС ) " OFS - "N" ( »Заголовок - $0 ; getline seq ; getline qheader ; getline qseq ; если (длина (seq)
  2. Картирование обрезанных последовательностей
    1. Скачать базу данных, соответствующую организму исследования из miRBase следующим образом. Перейти к http://www.mirbase.org/ftp.shtml и скачать файл 'mature.fa'. Обратите внимание, что последовательности указаны в RNA нотации. Замените остатки U на T следующей командой:
      sed -i '/'gt;/! s/U/T/g' mature.fa
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это даст полный список всех miRNAs в miRBase, происходящих из различных организмов.
    2. Выберите последовательности miRNA вашего организма, представляющие интерес, со следующей командой:
      awk 'имя »оф--организм»печать; nr»NR); следующий»; NR в nr' mature.fa (г-н)имя »из-организм»mirs.fa
    3. Карта считывает выше созданного файла с помощью Bowtie220 (версия 2.3.0), что не позволяет не совпадений. Во-первых, создайте индекс для файла со следующей командой:
      bowtie2-build зрелые' имя 'of'the-organism'mirs.fa зрелые'имя
    4. Выровняйте секвенирование считывает к базе данных, требуя, чтобы читать карты полностью miRNA базы данных, без каких-либо несоответствий. Для этого используйте следующий инструмент:
      bowtie2 -N 0 -L 10 --оценка-мин C,0,0 --конец-к-конец --время -xзрелый' имя »из-организма»миры -U Длина -Фильтр.fastq .fastq-S Длина -Фильтрованный.sam .sam
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вариант: --оценка-мин C,0,0 гарантирует, что выравнивание без каких-либо несоответствий. Для объяснения различных параметров в инструменте, пожалуйста, посетите следующий веб-сайт: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml
    5. Чтобы отбросить считыватель, которые не выровнялись, используйте следующую команду:
      samtools зрения -F 4 Длина "Фильтр"СТОНКТ".Сантетит; Читает
      ПРИМЕЧАНИЕ: В результате этих шагов, вы должны теперь получили выровненные чтения, соответствующие miRNAs.

Результаты

Критическими шагами являются изоляция небольшой рнковой доли исходного материала РНК(рисунок 3)и желаемого конечного продукта библиотеки(рисунок 4). Оба этапа включают очистку полиакриламидного геля; малая РНК выделена из 15% гелей мочевины TBE, в то время ...

Обсуждение

Подготовка небольшой библиотеки РНК остается сложной из-за предвзятости, в основном внедряемой во время этапов перевязки адаптера. РНК с 2'-OMe модификации в их 3 'конец, такие как мифы растений, piRNA у насекомых, нематод и млекопитающих, и малых вмешательства РНК (siRNA) в насекомых и растений о...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным центром научных исследований (CNRS), Французской комиссией по альтернативным энергетикам и атомной энергии (CEA) и Университетом Париж-Суд. Вся подготовка библиотеки, анализы последовательности illumina и биоинформатики для данного исследования были проведены на объекте I2BC Next-Generation Sequencing (NGS). Члены i2BC NGS объекта признаны для критического чтения рукописи и полезные предложения.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2100 Bioanalyzer Instrument AgilentG2939BA
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)ThermoFisherAM9720
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)Nex England BiolabsP0756S
Agencourt AMPure XP beadsBeckman CoulterA63880
Bioanalyzer High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626
Bioanalyzer Small RNA KitAgilent5067-1548
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filtersSigma AldrichCLS8162-96EA
Dark Reader transilluminatorvarious suppiers
HotStart PCR Kit, with dNTPsKapa BiosystemsKK2501
NEXTflex small RNA-seq V3 kitBIOO ScientificNOVA-5132-05optional
Novex TBE gels 6%ThermoFisherEC6265BOX
Novex TBE Urea gels 15%ThermoFisherEC6885BOX
QIAquick Nucleotide Removal KitQiagen 28304
Qubit 4 Quantitation Starter KitThermoFisherQ33227
Qubit ssDNA Assay KitThermoFisherQ10212
RNA Gel Loading Dye (2X)ThermoFisherR0641
RNA Gel Loading Dye (2X)ThermoFisherR0641
RNase Inhibitor, Murine Nex England BiolabsM0314S
SuperScript IV Reverse TranscriptaseThermoFisher18090200
SYBR Gold Nucleic Acid Gel StainThermoFisherS11494
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)Nex England BiolabsM0204S
T4 RNA Ligase 2, truncatedNex England BiolabsM0242S
TrackIt 50 bp DNA ladderThermoFisher10488043
TruSeq Small RNA Library Prep KitIlluminaRS-200-0012/24/36/48optional
UltraPure GlycogenThermoFisher10814010
XCell SureLock Mini-CellThermoFisherEI0001
XCell SureLock Mini-CellThermoFisherEI0001
ZR small RNA ladderZymo ResearchR1090
the last two numbers correspond to the set of indexes

Ссылки

  1. Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
  2. Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
  3. Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).
  4. van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
  5. Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
  6. Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
  7. Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4 (2012).
  8. Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
  9. Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).
  10. Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).
  11. Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049 (2015).
  12. Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118 (2018).
  13. Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969 (2011).
  14. Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
  15. Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619 (2014).
  16. Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109 (2013).
  17. Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105 (2018).
  18. Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41 (2012).
  19. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
  20. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
  21. Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

151NGS2 O 2 OMe

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены