Améliorer l'ARN-seq : moins de biais et une meilleure détection des ARN 2'-O-Methyl

Résumé

Nous présentons un protocole détaillé de réparation de petite bibliothèque d'ARN avec moins de biais que les méthodes standard et une sensibilité accrue pour les ARN 2'-O-méthyle. Ce protocole peut être suivi à l'aide de réactifs faits maison pour économiser des coûts ou en utilisant des kits pour plus de commodité.

Résumé

L'étude des petits ARN (ARN) par séquençage de la prochaine génération (NGS) est remise en question par des problèmes de partialité pendant la préparation de la bibliothèque. Plusieurs types d'ARNde tels que les microARN végétaux (miARN) portent une modification de 2'-O-méthyle (2'-OMe) à leur nucléotide terminal de 3'. Cette modification ajoute une autre difficulté car elle inhibe la ligature de l'adaptateur de 3'. Nous avons déjà démontré que les versions modifiées du protocole 'TruSeq (TS)' ont moins de biais et une meilleure détection des ARN 2'-OMe. Ici, nous décrivons en détail le protocole 'TS5', qui a montré la meilleure performance globale. TS5 peut être suivi soit à l'aide de réactifs faits maison ou de réactifs du kit TS, avec des performances égales.

Introduction

Les petits ARN (ARN) sont impliqués dans le contrôle d'une diversité de processus biologiques¹. Les ARS réglementaires eucaryotes ont généralement entre 20 et 30 nt de taille; les trois principaux types sont les microARN (miRNA), les ARN piwi-interacting (piRNA) et les petits ARN interférant (siRNA). Les niveaux aberrants d'expression de miRNA ont été impliqués dans une série de maladies². Cela souligne l'importance des miARN dans les domaines de la santé et des maladies et l'exigence d'outils de recherche précis et quantitatifs pour détecter les ARS en général.

Le séquençage de nouvelle génération (NGS) est une méthode largement utilisée pour étudier les ARN. Principaux avantages de NGS par rapport à d'autres approches, telles que les techniques quantitatives PCR ou microarray (qPCR), sont qu'il n'a pas besoin d'une connaissance priori des séquences d'ARNs et peut donc être utilisé pour découvrir de nouvelles ARN, et en outre il souffre moins de signaux de fond et effets de saturation. En outre, il peut détecter les différences de nucléotide unique et a un débit plus élevé que les microréseaux. Cependant, NGS a également quelques inconvénients; le coût d'une exécution de séquençage reste relativement élevé et le processus en plusieurs étapes requis pour convertir un échantillon en bibliothèque pour le séquençage peut introduire des biais. Dans un processus typique de préparation de la bibliothèque sRNA, un adaptateur de 3' est d'abord ligaté à l'ARNs (souvent gel-purifié à partir de l'ARN total) en utilisant une version tronquée de ligase d'ARN 2 (RNL2) et un adaptateur préadenyé 3 ' (Figure 1) en l'absence d'ATP. Cela augmente l'efficacité de la ligature sRNA-adaptateur et réduit la formation de réactions latérales telles que la circularisation de sRNA ou la concatemerization. Par la suite, un adaptateur de 5' est ligated par la ligase 1 d'ARN (RNL1), suivi de la transcription inverse (RT) et de l'amplification de PCR. Toutes ces étapes peuvent introduire un biais^3,4. Par conséquent, les nombres de lecture peuvent ne pas refléter les niveaux réels d'expression de l'ARNde conduisant à des modèles d'expression artificiels et dépendants de la méthode. Les ARS spécifiques peuvent être surreprésentées ou sous-représentées dans une bibliothèque, et les ARS fortement sous-représentés peuvent échapper à la détection. La situation est particulièrement compliquée avec les miARN végétaux, les siRNAs chez les insectes et les plantes, et les piARN chez les insectes, les nématodes et les mammifères, dans lesquels le nucléotide terminal de 3' a une modification de 2'-O-méthyle (2'-OMe)¹. Cette modification inhibe fortement la ligature adaptatrice de 3'⁵, ce qui rend la préparation de la bibliothèque pour ces types d'ARN une tâche difficile.

Les travaux antérieurs ont démontré que la ligature adaptateur introduit un biais sérieux, en raison de la séquence d'ARN / effets de structure^{6,7,8,9,10,11}. Les étapes en aval de la ligature adaptateur tels que la transcription inversée et PCR ne contribuent pas de manière significative au biais^6,11,12. Le biais de ligation est probablement dû au fait que les molécules adaptatrices avec une séquence donnée interagiront avec les molécules d'ARS dans le mélange de réaction pour former des co-plis, qui peuvent conduire à des configurations favorables ou défavorables pour la ligature (Figure 2). Les données de Sorefan et^{coll. 7} suggèrent que RNL1 préfère un seul contexte échoué, tandis que RNL2 préfère un double brin pour la ligature. Le fait que les structures de co-pliage adaptateur/sRNA soient déterminées par l'adaptateur spécifique et les séquences sRNA explique pourquoi l'ARNs spécifique est surreprésenté ou sous-représenté avec un ensemble d'adaptateurs donné. Il est également important de noter que dans une série de bibliothèques sRNA à comparer, les mêmes séquences d'adaptateur doivent être utilisées. En effet, il a déjà été observé que le changement des adaptateurs par l'introduction de différentes séquences de codes à barres modifie les profils miRNA dans les bibliothèques de séquençage^9,13.

La randomisation des séquences d'adaptateur près de la jonction de ligature réduit probablement ces biais. Sorefan et ses collègues⁷ ont utilisé des adaptateurs avec 4 nucléotides aléatoires à leurs extrémités, désignés adaptateurs « Haute Définition » (HD) et ont montré que l'utilisation de ces adaptateurs conduit à des bibliothèques qui reflètent mieux les niveaux d'expression de l'ARNs véritable. Des travaux plus récents ont confirmé ces observations et révélé que la région randomisée n'a pas besoin d'être adjacente à la jonction de ligature¹¹. Ce nouveau type d'adaptateurs a été nommé "MidRand" adaptateurs. Ensemble, ces résultats démontrent qu'une meilleure conception de l'adaptateur peut réduire les biais.

Au lieu de modifier les adaptateurs, le biais peut être supprimé par l'optimisation des conditions de réaction. Polyéthylène glycol (PEG), un agent de crowding macromoléculaire connu pour augmenter l'efficacité de ligature¹⁴, a été montré pour réduire de manière significative le biais^15,16. Sur la base de ces résultats, plusieurs kits « faible biais » sont apparus sur le marché. Il s'agit notamment de kits qui utilisent PEG dans les réactions de ligature, soit en combinaison avec des adaptateurs classiques ou adaptateurs HD. D'autres kits évitent la ligature tout à fait, et utilisent 3' polyadenylation et la commutation de modèle pour 3' et 5' adaptateur d'ajout, respectivement¹². Dans une autre stratégie, la ligature de l'adaptateur 3' est suivie d'une étape de circularisation, omettant ainsi la ligation de l'adaptateur^{5' 17}.

Dans une étude précédente, nous avons cherché un protocole de préparation de bibliothèque d'ARND avec les niveaux les plus bas possibles de biais et la meilleure détection de 2'-OMe RNAs¹². Nous avons testé quelques-uns des kits « faible biais » mentionnés ci-dessus, qui avaient une meilleure détection des ARN 2'-OMe que le protocole standard (TS). Étonnamment cependant, lors de la modification (l'utilisation d'adaptateurs randomisés, PEG dans les réactions de ligature et la suppression de l'excès 3' adaptateur par purification) ce dernier a surpassé les autres protocoles pour la détection de 2'-OMe RNAs. Ici, nous décrivons en détail un protocole basé sur le protocole TS, 'TS5', qui avait la meilleure détection globale de 2'-OMe RNAs. Le protocole peut être suivi à l'aide de réactifs du kit TS et d'un réactif du kit 'Nf' ou, pour économiser de l'argent, en utilisant des réactifs faits maison, avec des performances égales. Nous fournissons également un protocole détaillé pour la purification de l'ARNs à partir de l'ARN total et la préparation de l'adaptateur préadenyé de 3'.

Protocole

1. Isolement des petits ARN

1. Extraire l'ARN total à l'aide de réactifs à base de phénol ou de toute autre méthode. Vérifier si l'ARN est de bonne qualité.
2. Pré-exécuter un gel TBE-urée de 15 % (voir Tableau des matériaux) pendant 15 min à 200 V.
3. Pendant que le gel est pré-fonctionnement, mélangez 5-20 g d'ARN total dans un volume de 5-15 L avec un volume égal de colorant de chargement de formamide (voir Tableau des matériaux; formamide déionisé à 95 %, 0,025 % bleu bromophénol, 0,025 % de cyanol xylène, 5 mM EDTA pH 8) dans un tube PCR de 200 lL. De même, mélanger 10 l (200 ng) d'échelle à petit ARN (voir Tableau des matériaux) avec un volume égal de colorant de chargement de formamide. Incuber pendant 5 min à 65 oC dans un thermocycleur avec couvercle chauffé, puis placer les tubes immédiatement sur la glace.
4. Chargez l'échelle et l'échantillon sur le même gel avec au moins une voie entre eux et courez à 200 V jusqu'à ce que le bleu bromophénol (bleu foncé) ait migré environ deux tiers de la longueur du gel (environ 40 min).
5. Préparer un système pour élifier l'ARN du gel comme suit : perforer le fond d'un tube micro centrifugeuse sans nucléane de 0,5 ml avec une aiguille de calibre 21. Placez le tube perforé de 0,5 ml dans un tube de micro centrifugeuse de 2 ml sans nauséalen.
6. Retirer le gel et incuber à température ambiante avec une tache de gel d'acide nucléique de 3 l (10 000 x concentré; voir Table of Materials) dans 30 ml d'eau pendant 10 à 15 min.
7. Afficher le gel sur un enlumineur trans 'Dark Reader' (il est fortement recommandé d'éviter les UV car cela pourrait endommager l'ARN) et découper l'ARN de l'échantillon entre les bandes de 17 nt et 29 nt échelle. Transférer le morceau de gel dans le tube de 0,5 ml à partir de l'étape 1.5.
8. Centrifuger le tube de 0,5 ml dans le tube de 2 ml dans une micro centrifugeuse à vitesse maximale pendant 2 min. Retirez le tube de 0,5 ml, qui devrait être vide maintenant.
9. Ajouter 300 l l de naclocation-free 0.3 M NaCl au tube de 2 ml contenant le gel écrasé et tourner pendant au moins 2 h à température ambiante ou à 4 oC pendant la nuit (16 h).
10. Transférer la suspension des morceaux de gel concassés sur une colonne de spin (voir Tableau des matériaux)et la centrifugeuse pendant 2 min à vitesse maximale dans une micro centrifugeuse.
11. Ajouter 1 l (20 g/L) de glycogène (voir Tableau des matériaux)et 950 l de température ambiante 100 % d'éthanol. Incuber au moins 30 min à -80 oC.
12. Centrifugeuse de 20 min à vitesse maximale dans une micro centrifugeuse à 4 oC. Retirer le supernatant, laver la pastille avec 800 ll d'éthanol froid à 80 %. Centrifugeà encore pendant 5 min à 4 oC, et retirer soigneusement tous les supernatants. Resuspendre le granule d'ARN dans 15 l'eau sans nucléane. En règle générale, 5 à 20 ng de petit ARN doivent être récupérés, selon la quantité d'ARN total d'entrée (1 ng de petit ARN par 1 g d'ARN total d'entrée).
13. Étape supplémentaire recommandée : Vérifier la quantité et la qualité de l'ARNs récupéré (p. ex., par électrophorèse de gel capillaire à l'aide d'un petit kit d'ARN; voir Tableau des matériaux).

2. Préparation de l'adaptateur HD préadenyé de 3'

REMARQUE : La préadenylation de l'adaptateur HD de 3' a été faite d'une manière similaire au protocole décrit par Chen et^{coll. 18}. Notez que l'adaptateur préadenylated peut être commandé directement (/5rApp/ modification), mais c'est assez cher.

1. Ordre 5' phosphorylated, 3' bloqué 3' HD adaptateur oligonucléotide. Voir tableau 1 pour les séquences et les modifications. Notez que '3AmMO' est un groupe de modificateurais aminés de 3', la plupart des fournisseurs peuvent produire de l'oligonucléotide avec cette modification. Diluer dans de l'eau sans nucléane à 100 M.
2. Mettre en place une réaction de 100 L contenant les réactifs suivants : 10 oL d'oligo (100 M), 10 l de tampon de ligase d'ARN T4 (10x), 10 l d'ATP (10 mM), 40 oL de 50 % PEG8000, 5 l de ligase d'ARN T4 1 (50 unités), 25 l d'eau sans navane. Incuber toute la nuit à 20 oC.
3. Effectuer une extraction classique de phénol-chloroforme de l'oligonucléotide préadenyé suivi de précipitations d'éthanol. Ajouter 100 l d'acide (pH 4,5) phénol : chloroforme et vortex. Tourner pendant 5 min à température ambiante, vitesse maximale. Transférer soigneusement 90 l de la phase supérieure vers un nouveau tube; ajouter 10 l de 3 M d'acétate de sodium pH 5,2, 1 l de glycogène ultra-pur et 250 l d'éthanol froid à 100 %.
4. Conserver à -20 oC pendant au moins 30 min. Centrifugeuse pendant 30 min à une vitesse maximale de 4 oC. Retirer le supernatant, laver la boulette une fois avec 500 l'éthanol froid de 80%. Comme alternative à l'extraction de phénol-chloroforme et à la précipitation d'éthanol, une trousse d'enlèvement de nucléotides peut être utilisée (voir tableau des matériaux). Resuspendre dans 25 l'eau.
5. Mesurer la concentration de l'adaptateur à l'aide d'un kit pour la détection spécifique de l'ADN à brin unique (voir Tableau des matériaux). Diluer à 80 ng/L (10 M).
6. Étape supplémentaire recommandée : Vérifier l'efficacité de la préadenylation en migrant 1 'L de 10 'M adaptateur sur un gel TBE-urée de 15% (Tableau des matériaux) avec l'oligonucléotide non traité. L'adaptateur préadenylated devrait migrer légèrement plus lentement que l'oligonucléotide non traité. Si désiré, l'adaptateur préadenyé peut être gel-purifié; procéder comme décrit ci-dessus (étapes 1.2-1.12).

3. Préparation de la bibliothèque - Protocole TS5

REMARQUE: Nous présentons ici le protocole TS modifié 'TS5' que nous avons décrit précédemment¹² et qui peut être effectué soit avec des réactifs du kit ou avec des réactifs auto-fournis. Il convient de noter que nous avons obtenu des résultats similaires ou même légèrement meilleurs avec un protocole différent, «TS7». Cependant, avec TS7, il est plus difficile d'éliminer les dieux adaptateurs. Nous avons donc préféré décrire TS5 en détail, mais TS7 peut être suivi par le simple remplacement des adaptateurs. Pour TS7, utilisez les séquences d'adaptateur 'MidRand-Like (MRL) (tableau 1). Notez qu'ici les régions randomisées sont au milieu des adaptateurs. Les amorces pour la transcription inversée et pcR s'hybrideront aux séquences en aval de la région randomisée dans l'adaptateur 3' et en amont de la région randomisée dans l'adaptateur 5'. Le séquençage commencera à partir du premier nucléotide randomisé dans l'adaptateur 5'.

1. 3' adaptateur de ligature.
   1. Combiner 1 ll d'adaptateur HD préadenyé de 3' (10 m) avec 1 l de petit ARN purifié (0,1 à 1 M) dans un tube micro centrifugeur de 0,2 ml. Incuber pendant 2 min à 72 oC dans un thermocycleur, puis mettre directement sur la glace.
   2. Ajouter 4 'L de 50 % PEG 8000 (solution visqueux; pipet lentement), 1 'L de tampon de ligase d'ARN (10x), 1 'L de H₂O, 1 'L de T4 RNA ligase2 tronqué, et 1 'L d'inhibiteur de la RNase. Incuber toute la nuit à 16 oC.
2. Élimination de l'adaptateur 3' non ligated
   1. Ajouter 10 l'eau sans nucléane et bien mélanger. Ajouter 6 'L de 3 M NaOAc pH 5.2 ou 'Adapt Depletion Solution' du kit Nf (Table of Materials) et bien mélanger. Ajouter 40 l de perles de purification magnétique(Tableau des matériaux) et 60 l d'isopropanol et bien mélanger. Incuber 5 min à température ambiante.
   2. Mettre l'échantillon dans un support magnétique jusqu'à ce que la solution semble claire. Retirez et jetez le supernatant.
   3. Ajouter 180 l d'éthanol fraîchement préparé à 80 %. Incuber pour 30 s, puis retirer. Veillez à utiliser de l'éthanol fraîchement préparé à 80 % et ne pas couver avec 80 % d'éthanol pendant de longues périodes.
   4. Faites tourner brièvement le tube et retirez le liquide résiduel qui a pu se recueillir au fond du puits. Laisser sécher les perles pendant 2 min, puis les suspendre dans 22 l de 10 mM Tris pH 8 ou tampon de suspension du kit Nf. Incuber pendant 2 min, puis magnétiser l'échantillon jusqu'à ce que la solution semble claire.
   5. Ajoutez 6 'L de 3 M NaOAc pH 5.2 ou 'Adapt depletion Solution' à partir du kit Nf (Table of Materials) à un nouveau tube. Transférer 20 l du supernatant de l'étape précédente à ce nouveau tube et mélanger par pipetting. Ajouter 40 l de perles magnétiques et 60 l d'isopropanol à 100 % et bien mélanger par pipetting. Incuber 5 min.
   6. Magnétiser l'échantillon jusqu'à ce que la solution semble claire, puis retirer et jeter le supernatant.
   7. Ajouter 180 l d'éthanol fraîchement préparé à 80 %. Incuber pour 30 s, puis retirer. Take soin d'utiliser de l'éthanol fraîchement préparé 80% et ne pas incuber avec 80% d'éthanol pendant de longues périodes.
   8. Faites tourner brièvement le tube et retirez le liquide résiduel qui a pu se recueillir au fond du puits. Laisser sécher les perles pendant 2 min et les suspendre dans 10 l'eau sans nucléane. Incuber pendant 2 min, puis magnétiser l'échantillon jusqu'à ce que la solution semble claire.
   9. Transférer 9 ll de supernatant dans un nouveau tube. Ajouter 1 l de tampon de ligase d'ARN T4 (10x) et 1 l d'eau. Vous pouvez également ajouter 2 l de tampon de ligase dans le kit TS.
3. Ligation de l'adaptateur 5'
   1. Ajouter 1 'L d'adaptateur HD de 5' (10 'M; Tableau 1) à un tube PCR de 200 L dans un cycleur thermo avec couvercle chauffé. Incuber pendant 2 min à 70 oC, puis mettre le tube directement sur la glace.
   2. Ajouter 1 l de 10 mM ATP et 1 l de ligase d'ARN T4 1. Bien mélanger en pipetilage en douceur. Ajouter 3 'L de ce mélange à l'ARN ligaté 3' à partir de l'étape 3.2.9 et mélanger par pipetting. Incuber pendant 1 h à 28 oC.
4. Transcription inversée (RT)
   1. Transférer 6 'L de 3' et 5' adaptateur d'ARN ligaté à un nouveau tube PCR de 200 l (garder le reste de 8 'L à -80 'C pour une utilisation ultérieure si nécessaire). Ajouter 1 L d'apprêt RT (10 M; Tableau 1) et mélanger par pipetting. Incuber pendant 2 min à 70 oC, puis mettre le tube directement sur la glace.
   2. Ajouter les réactifs suivants pour RT : 2 l de tampon de 5x premier brin, 0,5 l de mélange dNTP de 12,5 mM, 1 L de 100 mD DTT, 1 L d'inhibiteur de la RNase et 1 l de transcriptase inversée(tableau des matériaux). Incuber pendant 1 h à 50 oC.
5. Amplification PCR
   1. Ajouter les réactifs suivants au mélange de réaction RT de 12,5 L : 10 l de tampon de polymérase PCR, 2 l d'amorce P5 universelle (10 M; Tableau 1), 2 l d'apprêt à indice P7 (10 M; Tableau 1, 1 L de 12,5 mL de dNTP, 0,5 L de polymérase d'ADN(Tableau des matériaux)et 22 l d'eau. Garder la réaction sur la glace jusqu'à l'utilisation.
   2. Exécuter le programme PCR suivant : 98 oC pour 30 s, 11 cycles (98 oC pour 10 s, 60 oC pour 30 s et 72 oC pour 15 s) et 72 oC pendant 10 min. Maintenir la réaction à 4 oC une fois terminée.
      REMARQUE : En ce qui concerne le nombre de cycles PCR : nous effectuons généralement 11 cycles, mais cela doit être optimisé par l'utilisateur. Essayez d'effectuer le plus petit nombre possible de cycles PCR.
6. Purification de gel
   1. Exécuter 5, 10 et 20 L de produit PCR sur un gel TBE natif de 6 % (voir Tableau des matériaux)avec une échelle appropriée (voir Tableau des matériaux). Exécuter le gel pendant environ 1 h à 145 V (jusqu'à ce que le bleu bromophénol atteigne le fond; ce colorant migre à la position de 65 pb).
   2. Retirer le gel, et couver avec une tache de gel d'acide nucléique (voir Tableau des matériaux) dans l'eau pendant 10-15 min.
   3. Afficher le gel sur un enlumineur trans "Dark Reader" (il est fortement recommandé d'éviter les UV car cela pourrait endommager l'ARN) et découper la bande de bibliothèque à 150 bp. Préparer un système pour éliper l'ARN du gel tel que décrit à l'étape 1.5 et transférer la pièce de gel au tube de 0,5 ml.
   4. Centrifugeuse dans une micro centrifugeuse à vitesse maximale pendant 2 min. Retirez le tube de 0,5 ml, qui devrait être vide maintenant.
   5. Ajouter 300 l'eau sans nucléane au tube de 2 ml contenant le gel concassé et faire pivoter pendant au moins 2 h à température ambiante ou à 4 oC pendant la nuit.
   6. Transférer la suspension des morceaux de gel concassés dans l'eau sur une colonne de spin et une centrifugeuse pendant 2 min à vitesse maximale.
   7. Ajouter 1 g de glycogène de 20 g/L, 30 oL de 3 M NaOAc et 975 oL d'éthanol glacé à 100 %. Centrifugeuse de 20 min à vitesse maximale à 4 oC.
   8. Resuspendre la pastille dans 20 l de 10 mM Tris pH8. Utilisez 1 L pour la mesure de la concentration et 1 l pour le contrôle de la qualité.

4. Analyse des données

REMARQUE: La procédure d'analyse des données décrite ci-dessous est basée sur le système d'exploitation Linux Ubuntu 16.04 LTS.

1. Traitement des fichiers séquences brutes
   1. Téléchargez le fichier de séquence FASTQ (s) généré pendant la séquence. Si nécessaire, effectuer le demultiplexing avec bcl2fastq2 (version V2.2.18.12; un manuel peut être téléchargé à partir du lien suivant: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
      Utilisez la commande suivante :
      nohup Pathway-of-bcl2fastq/bcl2fastq --runfolder-dir Pathway-of-Run --ignore-missing-bcl --output-dir Pathway-of-Output-Directory --barcode-mismatches 1 --aggregated-tiles AUTO -r 16 -d 16 -p 16 -w 16
   2. Supprimer les séquences adaptatrices à l'aide de Cutadapt¹⁹ version 1.15. Un manuel peut être téléchargé ici: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
      Utilisez la commande suivante :
      Voie à couperadapt/ cutadapt -a TGGAATTCCGgGTGCCAAGG -n 5 -O 4 -m 10 -j 0 --nextseq-trim 10 -o Output-File-Read1-cutadapt.fastq.gz Input-File-Read1.fastq.fastq.gz
      Notez que la séquence de la commande correspond à l'adaptateur HD 3' sans les 4 nucléotides aléatoires; ceux-ci ne seront donc pas supprimés au cours de cette étape.
   3. Utilisez seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) pour l'enlèvement des nucléotides aléatoires terminaux dans les lectures de séquençage. Utilisez la commande suivante (noms variables en gras) :
      seqtk trimfq -b 4 -e 4 Sortie-File-Read1-cutadapt .fastq -gt; Sortie-File-Read1 -trimmed .fastq (en)
   4. Utilisez la commande awk suivante afin de jeter les séquences inférieures à 10 nt:
      awk 'BEGIN 'FS ''t'; OFS - «n» 'en-tête '0 $; getline seq; getline qheader; getline qseq; if (longueur(seq) 'gt;' 10) 'print header, seq, qheader, qseq' Sortie 'File'Read1'trimmed.fastq 'gt; Length 'Filtered.fastq
2. Cartographie des séquences taillées
   1. Téléchargez la base de données correspondant à l'organisme d'étude de miRBase comme suit. Allez à http://www.mirbase.org/ftp.shtml et téléchargez le fichier 'mature.fa'. Notez que les séquences sont indiquées dans la notation de l'ARN. Remplacez les résidus U par T par la commande suivante :
      sed -i '/ '///! s/U/T/g' mature.fa
      REMARQUE: Cela donnera une liste complète de tous les miRNAs dans miRBase, provenant d'une variété d'organismes.
   2. Sélectionnez les séquences miRNA de votre organisme d'intérêt avec la commande suivante :
      awk 'nom de l'organisme'print; nr[NR'1]; suivant; NR in nr' mature.fa 'gt; mature 'nom de l'organismemirs.fa
   3. Cartographiez les lectures sur le fichier ci-dessus en utilisant Bowtie2²⁰ (version 2.3.0) ne permettant aucune inadéquation. Tout d'abord, créez un index pour votre fichier avec la commande suivante :
      bowtie2-build matureSNomde l'organismemirs.famatures
   4. Aligner les lectures de séquençage à la base de données, exigeant qu'une lecture des cartes entièrement à un miRNA de la base de données, sans aucune décalage. À cette fin, utilisez l'outil suivant :
      bowtie2 -N 0 -L 10 --score-min C,0,0 --fin-à-fin --temps -x mature'nom -de-l'organisme mirs-U Length -Filtered.fastq -S Length-Filtered-ALIGNMENT.sam
      REMARQUE: L'option: --score-min C,0,0 assure que l'alignement est sans aucune décalage. Pour une explication des différents paramètres de l'outil, veuillez visiter le site Web suivant : http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml
   5. Pour rejeter les lectures qui ne s'alignent pas, utilisez la commande suivante :
      samtools view -F 4 Longueur -Filtered-ALIGNMENT.sam .sam .sam ; Reads -aligned'to-Mirs.sam
      REMARQUE : À la suite de ces étapes, vous devriez maintenant avoir obtenu les lectures alignées, correspondant aux miRNAs.

Résultats

Les étapes critiques sont l'isolement de la petite fraction d'ARN du matériel d'ARN total de départ (figure 3) et le produit final de la bibliothèque souhaité (figure 4). Les deux étapes impliquent la purification de gel de polyacrylamide ; le petit ARN est isolé des gels d'urée de TBE de 15%, tandis que les bibliothèques finales sont isolées des gels tBE indigènes de 6%. Le petit ARN isolé du gel peut être analysé sur une petite puce d'électropho...

Discussion

La préparation de la petite bibliothèque d'ARN demeure difficile en raison du biais, principalement introduit pendant les étapes de ligature d'adaptateur. Les ARN avec une modification de 2'-OMe à leur extrémité de 3' tels que les miARN de plante, le piRNA dans les insectes, les nématodes et les mammifères, et les petits ARN interférant (siRNA) dans les insectes et les usines sont particulièrement difficiles à étudier parce que la modification de 2'-OMe inhibe la ligature d'adaptateur de 3' Un certain nombre ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)	ThermoFisher	AM9720
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	Nex England Biolabs	P0756S
Agencourt AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63880
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit	Agilent	5067-4626
Bioanalyzer Small RNA Kit	Agilent	5067-1548
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Sigma Aldrich	CLS8162-96EA
Dark Reader transilluminator	various suppiers
HotStart PCR Kit, with dNTPs	Kapa Biosystems	KK2501
NEXTflex small RNA-seq V3 kit	BIOO Scientific	NOVA-5132-05	optional
Novex TBE gels 6%	ThermoFisher	EC6265BOX
Novex TBE Urea gels 15%	ThermoFisher	EC6885BOX
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen	28304
Qubit 4 Quantitation Starter Kit	ThermoFisher	Q33227
Qubit ssDNA Assay Kit	ThermoFisher	Q10212
RNA Gel Loading Dye (2X)	ThermoFisher	R0641
RNA Gel Loading Dye (2X)	ThermoFisher	R0641
RNase Inhibitor, Murine	Nex England Biolabs	M0314S
SuperScript IV Reverse Transcriptase	ThermoFisher	18090200
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	ThermoFisher	S11494
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)	Nex England Biolabs	M0204S
T4 RNA Ligase 2, truncated	Nex England Biolabs	M0242S
TrackIt 50 bp DNA ladder	ThermoFisher	10488043
TruSeq Small RNA Library Prep Kit	Illumina	RS-200-0012/24/36/48	optional
UltraPure Glycogen	ThermoFisher	10814010
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher	EI0001
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher	EI0001
ZR small RNA ladder	Zymo Research	R1090
the last two numbers correspond to the set of indexes