Mejora de ARN pequeño-seq: Menos sesgo y mejor detección de 2'-O-Metil RNAs

Resumen

Presentamos un protocolo detallado de reparación de la biblioteca de ARN pequeño con menos sesgo que los métodos estándar y una mayor sensibilidad para los ARN de 2'-O-metil. Este protocolo se puede seguir utilizando reactivos caseros para ahorrar costos o usar kits para mayor comodidad.

Resumen

El estudio de los ARN pequeños (ARN) mediante la secuenciación de próxima generación (NGS) se ve cuestionado por problemas de sesgo durante la preparación de la biblioteca. Varios tipos de ARNS, como los microARN vegetales (miRNAs) llevan una modificación de 2'-O-metil (2'-OMe) en su nucleótido terminal de 3'. Esta modificación añade otra dificultad, ya que inhibe la ligadura del adaptador de 3'. Anteriormente demostramos que las versiones modificadas del protocolo 'TruSeq (TS)' tienen menos sesgo y una mejor detección de ARN 2'-OMe. Aquí describimos en detalle el protocolo 'TS5', que mostró el mejor rendimiento general. TS5 se puede seguir utilizando reactivos caseros o reactivos del kit TS, con el mismo rendimiento.

Introducción

Pequeños ARN (ARN) participan en el control de una diversidad de procesos biológicos¹. Los ARNm reguladores eucariotas suelen tener entre 20 y 30 nt de tamaño; los tres tipos principales son los microARN (miRNA), los ARN que interactúan con piwi (piRNA) y los ARN pequeños que interfieren (siRNA). Los niveles de expresión de miRNA aberrante se han implicado en una variedad de enfermedades². Esto subraya la importancia de los miRNA en la salud y las enfermedades y el requisito de herramientas de investigación precisas y cuantitativas para detectar los ARNNa en general.

La secuenciación de próxima generación (NGS) es un método ampliamente utilizado para estudiar los ARN. Las principales ventajas de NGS en comparación con otros enfoques, como las técnicas cuantitativas de PCR o microarray (qPCR), son que no necesita conocimiento a priori de las secuencias de ARN y, por lo tanto, puede utilizarse para descubrir nuevos ARN, y además sufre menos de señal de fondo y efectos de saturación. Además, puede detectar diferencias de nucleótidos individuales y tiene un mayor rendimiento que los microarrays. Sin embargo, NGS también tiene algunos inconvenientes; el costo de una ejecución de secuenciación sigue siendo relativamente alto y el proceso de varios pasos necesario para convertir una muestra en una biblioteca para la secuenciación puede introducir sesgos. En un proceso típico de preparación de la biblioteca de ARNS, un adaptador de 3' se liga primero al ARNS (a menudo purificado en gel del ARN total) utilizando una versión truncada de la ligada de ARN 2 (RNL2) y un adaptador de 3' preadenilado(Figura 1) en ausencia de ATP. Esto aumenta la eficiencia de la ligadura del adaptador de ARN sRNA y reduce la formación de reacciones secundarias como la circularización del ARNS o la concatemerización. Posteriormente, un adaptador de 5' es ligado por la ligada de ARN 1 (RNL1), seguido de transcripción inversa (RT) y amplificación pcR. Todos estos pasos pueden introducir sesgo^3,4. Por consiguiente, es posible que los números de lectura no reflejen los niveles reales de expresión de ARNS reales que conducen a patrones de expresión artificiales dependientes del método. Los ARNEspecíficos específicos pueden estar sobrerrepresentados o subrepresentados en una biblioteca, y los ARNs fuertemente subrepresentados pueden escapar a la detección. La situación es particularmente complicada con miRNAs vegetales, siRNAs en insectos y plantas, y piRNAs en insectos, nematodos y mamíferos, en los que el nucleótido terminal de 3' tiene una modificación de 2'-O-metil (2'-OMe)¹. Esta modificación inhibe fuertemente la ligadura del adaptador^{de 3',}haciendo que la preparación de la biblioteca para estos tipos de ARN sea una tarea difícil.

Trabajos anteriores demostraron que la ligadura del adaptador introduce un sesgo grave, debido a los efectos de secuencia/estructura de ARN^{6,7,8,9,10,11}. Los pasos aguas abajo de la ligadura del adaptador, como la transcripción inversa y la PCR, no contribuyen significativamente al sesgo^6,11,12. Es probable que el sesgo de ligadura se deba al hecho de que las moléculas adaptadoras con una secuencia determinada interactuarán con moléculas de ARNS en la mezcla de reacción para formar pliegues, que pueden conducir a configuraciones favorables o desfavorables para la ligadura(Figura 2). Los datos de Sorefan et al⁷ sugieren que RNL1 prefiere un solo contexto trenzado, mientras que RNL2 prefiere una doble hebra para la ligadura. El hecho de que las estructuras de plegado conjunto del adaptador/sRNA estén determinadas por las secuencias específicas de adaptador y sRNA explica por qué el ARNS específico está sobrerrepresentado o subrepresentado con un conjunto de adaptadores determinado. También es importante tener en cuenta que dentro de una serie de bibliotecas de SRNA que se van a comparar, se deben utilizar las mismas secuencias de adaptador. De hecho, se ha observado anteriormente que el cambio de adaptadores mediante la introducción de diferentes secuencias de códigos de barras altera los perfiles de miRNA en las bibliotecas de secuenciación^9,13.

La aleatorización de secuencias de adaptadores cerca de la unión de ligación probablemente reduce estos sesgos. Sorefan y sus colegas⁷ utilizaron adaptadores con 4 nucleótidos aleatorios en sus extremidades, designaron adaptadores de "alta definición" (HD) y demostraron que el uso de estos adaptadores conduce a bibliotecas que reflejan mejor los verdaderos niveles de expresión de ARNS. Trabajos más recientes confirmaron estas observaciones y revelaron que la región aleatorizada no necesita ser adyacente a la unión de ligación¹¹. Este novedoso tipo de adaptadores se llamaba "MidRand" adaptadores. Juntos, estos resultados demuestran que el diseño mejorado del adaptador puede reducir el sesgo.

En lugar de modificar los adaptadores, el sesgo se puede suprimir mediante la optimización de las condiciones de reacción. Se ha demostrado que el polietilenglicol (PEG), un agente de aglomeración macromolecular conocido por aumentar la eficiencia de la ligadura^14,reduce significativamente el sesgo^15,16. Sobre la base de estos resultados, varios kits de "bajo sesgo" aparecieron en el mercado. Estos incluyen kits que utilizan PEG en las reacciones de ligadura, ya sea en combinación con adaptadores clásicos o adaptadores HD. Otros kits evitan la ligadura por completo, y utilizar 3' poliadenilación y cambio de plantilla para 3' y 5' adición de adaptador, respectivamente¹². En otra estrategia, la ligadura del adaptador de 3' es seguida por un paso de circularización, omitiendo así 5' ligadura del adaptador¹⁷.

En un estudio anterior, buscamos un protocolo de preparación de la biblioteca de ARNS con los niveles más bajos posibles de sesgo y la mejor detección de los ARN 2'-OMe¹². Probamos algunos de los kits de "sesgo bajo" antes mencionados, que tenían una mejor detección de los ARN 2'-OMe que el protocolo estándar (TS). Sorprendentemente, sin embargo, tras la modificación (el uso de adaptadores aleatorios, PEG en las reacciones de ligación y la eliminación del exceso de adaptador de 3' por purificación) este último superó a los otros protocolos para la detección de RNA 2'-OMe. Aquí, describimos en detalle un protocolo basado en el protocolo TS, 'TS5', que tenía la mejor detección general de 2'-OMe RNAs. El protocolo se puede seguir utilizando reactivos del kit TS y un reactivo del kit 'Nf' o, para ahorrar dinero, utilizando reactivos caseros, con el mismo rendimiento. También proporcionamos un protocolo detallado para la purificación de ARN SRNA a partir del ARN total y la preparación del adaptador preadenilado de 3'.

Protocolo

1. Aislamiento de pequeños ARN

1. Extraiga el ARN total utilizando reactivos a base de fenol o cualquier otro método. Verifique si el ARN es de buena calidad.
2. Pre-ejecutar un gel tBE-urea 15% (ver Tabla de Materiales)durante 15 min a 200 V.
3. Mientras el gel está pre-funcionando, mezcle 5-20 g de ARN total en un volumen de 5-15 l con un volumen igual de tinte de carga de formamida (ver Tabla de Materiales;Formamida 95% desionizada, 0.025% de azul bromofenol, 0.025% de cianoleo de xileno, 5 mM EDTA pH 8) en un tubo de PCR de 200 Ol. Del mismo modo, mezcle 10 l (200 ng) de escalera de ARN pequeño (ver Tabla de materiales)con un volumen igual de tinte de carga de formamida. Incubar durante 5 min a 65 oC en un termociclador con tapa calentada, luego colocar los tubos inmediatamente sobre hielo.
4. Cargue la escalera y la muestra en el mismo gel con al menos un carril entre ellos y corra a 200 V hasta que el azul bromofenol (azul oscuro) haya migrado alrededor de dos tercios de la longitud del gel (aproximadamente 40 min).
5. Prepare un sistema para eluir el ARN del gel de la siguiente manera: perfore la parte inferior de un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml sin nucleasa con una aguja de calibre 21. Coloque el tubo perforado de 0,5 ml en un tubo de microcentrífuga de fondo redondo sin nucleasa de 2 ml.
6. Retirar el gel e incubar a temperatura ambiente con una mancha de gel de ácido nucleico de 3 l (10.000 x concentrado; ver Tabla de materiales)en agua de 30 ml durante 10-15 min.
7. Vea el gel en un iluminador trans 'Dark Reader' (se recomienda encarecidamente evitar los rayos UV, ya que esto podría dañar el ARN) y cortar el ARN de la muestra entre las bandas de escalera de 17 nt y 29 nt. Transfiera la pieza de gel al tubo de 0,5 ml desde el paso 1.5.
8. Centrifugar el tubo de 0,5 ml en el tubo de 2 ml en una microcentrífuga a velocidad máxima durante 2 minutos. Retire el tubo de 0,5 ml, que debería estar vacío ahora.
9. Añadir 300 ml de naCl sin nucleasas 0,3 M al tubo de 2 ml que contiene el gel triturado y rotar durante al menos 2 h a temperatura ambiente o a 4 oC durante la noche (16 h).
10. Transfiera la suspensión de las piezas de gel trituradas a una columna de centrifugado (ver Tabla de Materiales)y centrífuga durante 2 minutos a la velocidad máxima en una microcentrrípica.
11. Añadir 1 l (20 g/l) de glucógeno (ver Tabla de materiales)y 950 ml de etanol a temperatura ambiente 100%. Incubar durante al menos 30 min a -80oC.
12. Centrífuga durante 20 minutos a velocidad máxima en una microcentrífuga a 4oC. Retire el sobrenadante, lave el pellet con 800 ml de etanol frío al 80 %. Centrifugar de nuevo durante 5 min a 4oC, y retirar cuidadosamente todo el sobrenadante. Resuspenda el gránulo de ARN en 15 ml de agua libre de nucleasas. Por lo general, se deben recuperar 5-20 ng de ARN pequeño, dependiendo de la cantidad de ARN total de entrada (1 ng de ARN pequeño por 1 g de ARN total de entrada).
13. Paso adicional recomendado: Compruebe la cantidad y la calidad del ARNS recuperado (por ejemplo, mediante electroforesis de gel capilar utilizando un pequeño kit de ARN; véase Tabla de materiales).

2. Preparación del adaptador HD preadenilado de 3'

NOTA: La preadenilación del adaptador HD de 3' se hizo de una manera similar al protocolo descrito por Chen et al¹⁸. Tenga en cuenta que el adaptador preadenilado se puede pedir directamente (/5rApp/ modificación), pero esto es bastante caro.

1. Pedido 5' fosforilado, 3' bloqueado 3' hd adaptador oligonucleótido. Consulte la Tabla 1 para ver la secuencia y las modificaciones. Tenga en cuenta que '3AmMO' es un grupo modificador de amino 3', la mayoría de los proveedores pueden producir oligonucleótidos con esta modificación. Diluir en agua libre de nucleasas a 100 m.
2. Establecer una reacción de 100 l que contenga los siguientes reactivos: 10 ml de oligo (100 oM), 10 ml de tampón de ligasa de ARN T4 (10x), 10 ml de ATP (10 ml), 40 ml de 50% de PEG8000, 5 ml de l de l de anerbosa de ARN T4 1 (50 unidades), 25 ml de agua libre de nucleasas. Incubar durante la noche a 20oC.
3. Realizar una extracción clásica de fenol-cloroformo del oligonucleótido preadenilado seguido de precipitación de etanol. Añadir 100 l de ácido (pH 4.5) fenol:cloroformo y vórtice. Girar durante 5 minutos a temperatura ambiente, velocidad máxima. Transfiera cuidadosamente 90 l de la fase superior a un tubo nuevo; Añadir 10 ml de acetato de sodio pH de 3 M 5,2, 1 l de glucógeno ultrapuro y 250 ml de etanol en frío 100%.
4. Mantener a -20 oC durante al menos 30 minutos centrífuga durante 30 min a una velocidad máxima de 4 oC. Retire el sobrenadante, lave el pellet una vez con 500 éL frío 80% etanol. Como alternativa a la extracción de fenol-cloroformo y la precipitación de etanol, se puede utilizar un kit de eliminación de nucleótidos (ver Tabla de Materiales). Resuspender en agua de 25 l.
5. Mida la concentración del adaptador utilizando un kit para la detección específica de ADN de una sola cadena (ver Tabla de Materiales). Diluir hasta 80 ng/L (10 m).
6. Paso adicional recomendado: Verificar la eficacia de la preadenilación migrando 1 l de adaptador de 10 m en un gel de 15% de TBE-urea(Tabla de materiales)junto con oligonucleótido no tratado. El adaptador preadenilado debe migrar ligeramente más lento que el oligonucleótido no tratado. Si lo desea, el adaptador preadenilado puede ser purificado en gel; proceder como se describió anteriormente (pasos 1.2-1.12).

3. Preparación de la biblioteca - Protocolo TS5

NOTA: Presentamos aquí el protocolo TS modificado 'TS5' que describimos anteriormente¹² y que se puede realizar con reactivos del kit o con reactivos autoproporcionados. Cabe señalar que obtuvimos resultados similares o incluso ligeramente mejores con un protocolo diferente, 'TS7'. Sin embargo, con TS7 es más difícil eliminar los atenuadores del adaptador. Por lo tanto, hemos preferido describir TS5 en detalle, pero TS7 puede ser seguido simplemente reemplazando los adaptadores. Para TS7, utilice las secuencias de adaptador 'MidRand-Like (MRL)'(Tabla 1). Tenga en cuenta que aquí las regiones aleatorias están en el medio de los adaptadores. Los imprimadores para transcripción inversa y PCR se hibridarán a las secuencias aguas abajo de la región aleatoria en el adaptador de 3' y aguas arriba de la región aleatoria en el adaptador de 5'. La secuenciación comenzará desde el primer nucleótido aleatorio en el adaptador de 5'.

1. 3' ligadura del adaptador.
   1. Combinar 1 l de adaptador HD preadenilado de 3' (10 m) con 1 ml de ARN pequeño purificado (0,1-1 m) en un tubo de microcentrífuga de 0,2 ml. Incubar durante 2 min a 72 oC en un termociclador, luego poner directamente sobre hielo.
   2. Añadir 4 ml de 50 % de PEG 8000 (solución viscosa; pipeteo lentamente), 1 l de tampón de la ligasa de ARN (10x), 1 l de H₂O, 1 l de l de arn ligóleo T4 truncado y 1 l de inhibidor de la rnasa. Incubar durante la noche a 16oC.
2. Eliminación del adaptador de 3' sin parar
   1. Añadir 10 l de agua libre de nucleasas y mezclar bien. Añadir 6 l de 3 M NaOAc pH 5.2 o 'Adapter Depletion Solution' desde el kit Nf(Tabla de materiales)y mezclar bien. Añadir 40 s de perlas de purificación magnética(Tabla de Materiales)y 60 l de isopropanol y mezclar bien. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
   2. Coloque la muestra en un bastidor magnético hasta que la solución parezca clara. Retire y deseche el sobrenadante.
   3. Añadir 180 ml de etanol al 80 % recién preparado. Incubar durante 30 s y, a continuación, retirar. Tenga cuidado de usar etanol 80% recién preparado y no incubar con 80% de etanol durante períodos prolongados.
   4. Gire brevemente el tubo y retire el líquido residual que pueda haberse acumulado en la parte inferior del pozo. Deje secar las perlas durante 2 min, luego resuspenda en 22 ml de 10 mM Tris pH 8 o tampón de resuspensión del kit Nf. Incubar durante 2 min, luego magnetizar la muestra hasta que la solución parezca clara.
   5. Añadir 6 l de 3 M NaOAc pH 5.2 o 'Adapter Depletion Solution' desde el kit Nf(Tabla de materiales)a un nuevo tubo. Transfiera 20 l del sobrenadante del paso anterior a este nuevo tubo y mezcle mediante pipeteo. Añadir 40 l de perlas magnéticas y 60 l de isopropanol 100% y mezclar bien mediante pipeteo. Incubar durante 5 min.
   6. Magnetizar la muestra hasta que la solución parezca transparente, luego retirar y desechar el sobrenadante.
   7. Añadir 180 ml de etanol al 80 % recién preparado. Incubar durante 30 s y, a continuación, retirar. Take cuidado de usar etanol recién preparado 80% y no incubar con 80% etanol durante períodos prolongados.
   8. Gire brevemente el tubo y retire el líquido residual que pueda haberse acumulado en la parte inferior del pozo. Deje que las perlas se sequen durante 2 minutos y resuspendan en 10 ml de agua libre de nucleasas. Incubar durante 2 min, luego magnetizar la muestra hasta que la solución parezca clara.
   9. Transfiera 9 l de sobrenadante a un tubo nuevo. Añadir 1 l de tampón de ligasa de ARN T4 (10x) y 1 l de agua. Alternativamente, agregue 2 l de tampón de ligasa desde el kit de TS.
3. Adaptador de ligadura de 5'.
   1. Añadir 1 l de adaptador HD de 5' (10 m; Tabla 1) a un tubo PCR de 200 l en un termociclador con tapa calentada. Incubar durante 2 min a 70 oC, luego poner el tubo directamente sobre hielo.
   2. Añadir 1 l de 10 mM de ATP y 1 l de la ligasa de ARN T4 1. Mezcle bien pipeteando suavemente. Añadir 3 l de esta mezcla al ARN ligado de 3' del paso 3.2.9 y mezclar mediante pipeteo. Incubar durante 1 h a 28oC.
4. Transcripción inversa (RT)
   1. Transfiera el ARN ligado del adaptador de 6' y 5' a un nuevo tubo pcR de 200 ml (mantenga el tubo de PCR restante de 8 oC a -80 oC para su uso posterior si es necesario). Añadir 1 l de imprimación RT (10 m; Tabla 1) y mezclar mediante pipeteo. Incubar durante 2 min a 70 oC, luego poner el tubo directamente sobre hielo.
   2. Añadir los siguientes reactivos para RT: 2 l de tampón de primera hebra de 5x, 0,5 ml de mezcla dNTP de 12,5 mM, 1 l de TDT de 100 mM, 1 l de inhibidor de la rnalosa y 1 l de transcriptasa inversa(tabla de materiales). Incubar durante 1 h a 50oC.
5. Amplificación de PCR
   1. Añadir los siguientes reactivos a la mezcla de reacción RT de 12,5 l: 10 ml de tampón de polimerasa de PCR, 2 ml de imprimación P5 universal (10 oM; Tabla 1), 2 l de imprimación de índice P7 (10 m; Tabla 1), 1 l de dNTPs de 12,5 mM, 0,5 ml de ADN polimerasa(Tabla de materiales)y 22 ml de agua. Mantenga la reacción en hielo hasta su uso.
   2. Ejecutar el siguiente programa de PCR: 98 oC para 30 s, 11 ciclos (98 oC para 10 s, 60 oC para 30 s y 72 oC durante 15 s) y 72 oC durante 10 min. Mantener la reacción a 4 oC cuando haya terminado.
      NOTA: En cuanto al número de ciclos de PCR: normalmente realizamos 11 ciclos, pero esto debe ser optimizado por el usuario. Intente realizar el menor número posible de ciclos pcR.
6. Purificación de gel
   1. Ejecutar 5, 10 y 20 l de producto PCR en un gel TBE nativo del 6% (ver Tabla de Materiales)junto con una escalera adecuada (ver Tabla de Materiales). Ejecutar el gel durante aproximadamente 1 h a 145 V (hasta que el azul de bromofenol llegue a la parte inferior; este tinte migra en la posición de 65 bp).
   2. Retire el gel e incubar con mancha de gel de ácido nucleico (ver Tabla de Materiales)en agua durante 10-15 min.
   3. Ver el gel en un iluminador trans "Dark Reader" (se recomienda encarecidamente evitar los rayos UV, ya que esto podría dañar el ARN) y cortar la banda de la biblioteca a 150 bp. Preparar un sistema para eluir el ARN del gel como se describe en el paso 1.5 y transferir la pieza de gel al tubo de 0,5 ml.
   4. Centrífuga en una microcentrífuga a velocidad máxima durante 2 min. Retire el tubo de 0,5 ml, que debería estar vacío ahora.
   5. Añadir 300 ml de agua libre de nucleasas al tubo de 2 ml que contiene el gel triturado y rotar durante al menos 2 h a temperatura ambiente o a 4 oC durante la noche.
   6. Transfiera la suspensión de las piezas de gel trituradas en agua a una columna de centrifugar y centrífuga durante 2 minutos a la velocidad máxima.
   7. Añadir 1 l de glucógeno (20 g/L), 30 ml de 3 M de NaOAc y 975 ml de etanol 100% frío en frío. Centrífuga durante 20 min a velocidad máxima a 4oC.
   8. Resuspenda el pellet en 20 s de 10 mM Tris pH8. Utilice 1 l para la medición de la concentración y 1 l para el control de calidad.

4. Análisis de datos

NOTA: El procedimiento de análisis de datos descrito a continuación se basa en el sistema operativo Linux Ubuntu 16.04 LTS.

1. Tratamiento de archivos de secuencia sin procesar
   1. Descargue los archivos de secuencia FASTQ generados durante la ejecución de secuenciación. Si es necesario, realice la desmultiplexación con bcl2fastq2 (versión V2.2.18.12; se puede descargar un manual desde el siguiente enlace: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
      Utilice el siguiente comando:
      nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq --runfolder-dir Pathway_of_Run --ignore-missing-bcl --output-dir Pathway_of_Output_Directory --barcode-mismatches 1 --aggregated-tiles AUTO -r 16 -d 16 -p 16 -w 16
   2. Quite las secuencias del adaptador mediante Cutadapt¹⁹ versión 1.15. Puede descargar un manual aquí: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
      Utilice el siguiente comando:
      Pathway_to_cutadapt/ cutadapt -a TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG -n 5 -O 4 -m 10 -j 0 --nextseq-trim 10 -o Output_File_Read1_cutadapt.fastq.gz Input_File_Read1.fastq.gz
      Tenga en cuenta que la secuencia en el comando corresponde al adaptador HD de 3' sin los 4 nucleótidos aleatorios; por lo tanto, no se eliminarán durante este paso.
   3. Utilice seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) para la eliminación de los nucleótidos aleatorios terminales en las lecturas de secuenciación. Utilice el siguiente comando (nombres variables en negrita):
      seqtk trimfq -b 4 -e 4 Output_File_Read1_cutadapt .fastq > Output_File_Read1 _trimmed .fastq
   4. Utilice el siguiente comando awk para descartar las secuencias más cortas que 10 nt:
      awk 'BEGIN 'FS' ''t' ; OFS á "'n'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
2. Mapeo de las secuencias recortadas
   1. Descargue la base de datos correspondiente al organismo de estudio de miRBase de la siguiente manera. Vaya a http://www.mirbase.org/ftp.shtml y descargue el archivo 'mature.fa'. Tenga en cuenta que las secuencias se indican en notación de ARN. Sustituya los residuos U por T por el siguiente comando:
      sed -i '/'>/! s/U/T/g' mature.fa
      NOTA: Esto producirá una lista completa de todos los miRNAs en miRBase, que provienen de una variedad de organismos.
   2. Seleccione las secuencias de miRNA de su organismo de interés con el siguiente comando:
      awk 'name_of_the_organismá print; nr[NR+1]; siguiente; NR en nr' mature.fa > mature_name_of_the_organism_mirs.fa
   3. Asigne las lecturas al archivo creado anteriormente utilizando Bowtie2²⁰ (versión 2.3.0) sin discrepancias. En primer lugar, cree un índice para el archivo con el siguiente comando:
      bowtie2-build mature_name_of_the_organism_mirs.fa mature_name_of_the_organism_mirs
   4. Alinee las lecturas de secuenciación con la base de datos, requiriendo que una lectura se asigne por completo a un miRNA de la base de datos, sin discrepancias. Para ello, utilice la siguiente herramienta:
      bowtie2 -N 0 -L 10 --score-min C,0,0 --end-to-end --time -x mature_name_of_the_organism_mirs -U Length_Filtered.fastq -S Length_Filtered_ALIGNMENT.sam
      NOTA: La opción: --score-min C,0,0 garantiza que la alineación no tenga discrepancias. Para una explicación de los diversos parámetros en la herramienta, por favor visite el siguiente sitio web: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml
   5. Para descartar las lecturas que no se alinearon, utilice el siguiente comando:
      vista samtools -F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT.sam > Reads_aligned_to_Mirs .sams.sam
      NOTA: Como resultado de estos pasos, ahora debería haber obtenido las lecturas alineadas, correspondientes a los miRNAs.

Resultados

Los pasos críticos son el aislamiento de la pequeña fracción de ARN del material de ARN total inicial(Figura 3) y el producto de biblioteca final deseado (Figura 4). Ambos pasos implican la purificación del gel de poliacrilamida; ARN pequeño se aísla del 15% de geles de urea TBE, mientras que las bibliotecas finales están aisladas de geles TBE nativos al 6%. ARN pequeño aislado de gel se puede analizar en un pequeño chip de electroforesis capilar de ARN...

Discusión

La preparación de la biblioteca de ARN pequeño sigue siendo difícil debido al sesgo, introducido principalmente durante los pasos de ligadura del adaptador. Los ARN con una modificación de 2'-OMe en sus 3' extremos como miRNAs vegetales, piRNA en insectos, nematodos y mamíferos, y pequeños ARN que interfieren (siRNA) en insectos y plantas son particularmente difíciles de estudiar porque la modificación 2'-OMe inhibe la ligadura adaptadora de 3'. En la literatura se han propuesto una serie de soluciones para mejor...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)	ThermoFisher	AM9720
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	Nex England Biolabs	P0756S
Agencourt AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63880
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit	Agilent	5067-4626
Bioanalyzer Small RNA Kit	Agilent	5067-1548
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Sigma Aldrich	CLS8162-96EA
Dark Reader transilluminator	various suppiers
HotStart PCR Kit, with dNTPs	Kapa Biosystems	KK2501
NEXTflex small RNA-seq V3 kit	BIOO Scientific	NOVA-5132-05	optional
Novex TBE gels 6%	ThermoFisher	EC6265BOX
Novex TBE Urea gels 15%	ThermoFisher	EC6885BOX
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen	28304
Qubit 4 Quantitation Starter Kit	ThermoFisher	Q33227
Qubit ssDNA Assay Kit	ThermoFisher	Q10212
RNA Gel Loading Dye (2X)	ThermoFisher	R0641
RNA Gel Loading Dye (2X)	ThermoFisher	R0641
RNase Inhibitor, Murine	Nex England Biolabs	M0314S
SuperScript IV Reverse Transcriptase	ThermoFisher	18090200
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	ThermoFisher	S11494
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)	Nex England Biolabs	M0204S
T4 RNA Ligase 2, truncated	Nex England Biolabs	M0242S
TrackIt 50 bp DNA ladder	ThermoFisher	10488043
TruSeq Small RNA Library Prep Kit	Illumina	RS-200-0012/24/36/48	optional
UltraPure Glycogen	ThermoFisher	10814010
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher	EI0001
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher	EI0001
ZR small RNA ladder	Zymo Research	R1090
the last two numbers correspond to the set of indexes