작은 RNA-seq 개선: 2'-O-메틸 RNA의 더 적은 편견 및 더 나은 검출

요약

우리는 표준 방법 보다는 더 적은 편견을 가진 상세한 작은 RNA 라이브러리 배상 프로토콜 및 2'-O-메틸 RNA를 위한 증가한 감도를 제시합니다. 이 프로토콜은 비용을 절감하기 위해 수제 시약을 사용하거나 편의를 위해 키트를 사용하여 따를 수 있습니다.

초록

차세대 염기서열 분석(NGS)에 의한 소형 RNA(sRNA)에 대한 연구는 도서관 준비 중 편향문제에 의해 도전받고 있습니다. 식물 microRNAs (miRNAs)와 같은 sRNA의 몇몇 모형은 그들의 3' 말단 뉴클레오티드에서 2'-O-메틸 (2'-OMe) 수정을 전송합니다. 이 수정은 3'어댑터 결찰을 억제하기 때문에 또 다른 어려움을 추가합니다. 이전에는 'TruSeq(TS)' 프로토콜의 수정된 버전이 편향이 적고 2'-OMe RNA의 검출이 개선되었다는 것을 입증했습니다. 여기서는 전체적인 성능을 가장 잘 보여준 프로토콜 'TS5'를 자세히 설명합니다. TS5는 TS 키트의 홈메이드 시약 또는 시약을 사용하여 동일한 성능으로 따를 수 있습니다.

서문

작은 RNA (sRNA)는 생물 학적 과정의 다양성의 제어에 관여^1. 진핵 조절 sRNA는 전형적으로 20 와 30 nt 크기 사이; 3개의 중요한 모형은 microRNAs (miRNA), piwi 상호 작용하는 RNA (piRNA) 및 작은 간섭 RNA (siRNA)입니다. 비정상적인 miRNA 발현 수준은 다양한 질병^2에서연루되어 왔다. 이것은 건강과 질병에 있는 miRNAs의 중요성 및 일반적으로 sRNAs를 검출하기 위하여 정확하고 정량적인 연구 공구를 위한 필요함을 강조합니다.

차세대 염기서열 분석(NGS)은 sRNA를 연구하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 정량적 PCR 또는 마이크로어레이 기술(qPCR)과 같은 다른 접근법과 비교하여 NGS의 주요 장점은 sRNA 서열에 대한 사전 지식이 필요하지 않으며 따라서 새로운 RNA를 발견하는 데 사용될 수 있다는 것입니다. 배경 신호 및 채도 효과. 또한, 단일 뉴클레오티드 차이를 검출할 수 있으며 마이크로어레이보다 처리량이 더 높습니다. 그러나 NGS에는 몇 가지 단점이 있습니다. 시퀀싱 실행 비용은 상대적으로 높게 유지되며 시퀀싱을 위해 샘플을 라이브러리로 변환하는 데 필요한 다단계 프로세스가 편향을 유발할 수 있습니다. 전형적인 sRNA 라이브러리 제제 공정에서, 3' 어댑터는 ATP가 없는 경우 RNA 리가제 2(RNL2) 및 프리아베닐화된 3' 어댑터의 잘린 버전을 사용하여sRNA(종종 총 RNA로부터 겔 정제)로 먼저 결찰된다. 이는 sRNA 어댑터 결찰의 효율을 증가시키고 sRNA 순환화 또는 연결화와 같은 측 반응의 형성을 감소시킨다. 이어서, 5' 어댑터는 RNA 리가제 1(RNL1)에 의해 결찰되고, 이어서 역전사(RT) 및 PCR 증폭이 뒤따른다. 이러한 모든 단계는 바이어스^3,4를도입 할 수 있습니다 . 따라서 판독값은 인공적인 방법 종속 발현 패턴으로 이어지는 실제 sRNA 발현 수준을 반영하지 않을 수 있습니다. 특정 sRNA는 라이브러리에서 과대 또는 과소 표현될 수 있으며, 강하게 과소 대표되는 sRNA는 탐지를 벗어날 수 있습니다. 상황은 특히 식물 miRNAs, 곤충 및 식물의 siRNAs, 곤충, 선충 및 포유동물의 piRNAs, 있는 3' 말단 뉴클레오티드가 2'-O-Methyl(2'-OMe) 변형^1을갖는다. 이 수정은 3' 어댑터 결찰^5를강력하게 억제하여 이러한 유형의 RNA에 대한 라이브러리 준비를 어려운 작업으로 만듭니다.

이전 작업은 어댑터 결찰이 RNA 서열 /구조 효과^{6,7,8,9,10,11로}인해 심각한 편향을 도입한다는 것을 입증했다. 역전사 및 PCR과 같은 어댑터 결찰의 하류 단계는 바이어스^6,11,12에크게 기여하지 않는다. 결찰 편향은 주어진 서열을 가진 어댑터 분자가 반응 혼합물에서 sRNA 분자와 상호 작용하여 공동 접기를 형성할 것이고, 이는 결찰에 대해 유리하거나 불리한 구성으로 이어질 수 있다는사실(도 2)에기인한다. Sorefan 등의 데이터는 RNL1이 단일 가닥 컨텍스트를 선호하는 반면 RNL2는 결찰을 위한 이중 가닥을 선호한다는 것을 시사합니다. 어댑터/sRNA 코폴드 구조가 특정 어댑터 및 sRNA 서열에 의해 결정된다는 사실은 특정 sRNA가 지정된 어댑터 세트와 과대 또는 과소 대표되는 이유를 설명합니다. 또한 일련의 sRNA 라이브러리를 비교할 때 동일한 어댑터 서열을 사용해야 한다는 점에 유의해야 합니다. 실제로, 상이한 바코드 서열의 도입에 의해 어댑터를 변경하면 시퀀싱 라이브러리^9,13에서miRNA 프로파일이 변경되는 것이 관찰되었다.

결찰 접합 부근의 어댑터 서열의 무작위화는 이러한 바이어스를 감소시킬 가능성이 높습니다. Sorefan 및 동료^7그들의 사지에 4 개의 무작위 뉴클레오티드를 가진 어댑터를 사용, 지정된 "고화질" (HD) 어댑터, 이러한 어댑터의 사용은 더 나은 진정한 sRNA 발현 수준을 반영하는 라이브러리로 이어질 것으로 나타났다. 보다 최근의 작업은 이러한 관찰을 확인하고 무작위 영역이 결찰^{접합부(11)에}인접할 필요가 없다는 것을 밝혔다. 이 새로운 유형의 어댑터는 "MidRand" 어댑터로 명명되었습니다. 이러한 결과는 향상된 어댑터 설계가 바이어스를 줄일 수 있음을 보여줍니다.

어댑터를 수정하는 대신 반응 조건의 최적화를 통해 바이어스를 억제할 수 있습니다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 결찰^{효율(14)을}증가시키는 것으로 알려진 거대 분자 우향제로서, 바이어스^15,16을현저히 감소시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 바탕으로 여러 가지 "낮은 바이어스" 키트가 시장에 나타났습니다. 여기에는 고전적인 어댑터 또는 HD 어댑터와 함께 결찰 반응에서 PEG를 사용하는 키트가 포함됩니다. 다른 키트는 결찰을 완전히 피하고 3' 폴리아데닐레이션 및 템플릿 스위칭을 3' 및 5' 어댑터 추가용으로 각각^12개사용합니다. 또 다른 전략에서, 3' 어댑터 결찰은 순환 화 단계 뒤에, 따라서 5' 어댑터^{결찰(17)을}생략한다.

이전 연구에서는 가능한 가장 낮은 수준의 바이어스와 2'-OMe RNA^12의최상의 검출을 갖춘 sRNA 라이브러리 준비 프로토콜을 검색했습니다. 우리는 표준 프로토콜 (TS)보다 2'-OMe RNA의 더 나은 검출을 했다 위에서 언급 한 '낮은 바이어스' 키트의 일부를 테스트. 그러나 놀랍게도, 수정시 (무작위 어댑터의 사용, 결찰 반응에서 PEG 및 정제에 의한 초과 3' 어댑터의 제거) 후자는 2'-OMe RNA의 검출을 위한 다른 프로토콜을 능가하였다. 여기서는 2'-OMe RNA의 전체 검출이 가장 좋은 TS 프로토콜인 'TS5'를 기반으로 하는 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 TS 키트의 시약과 'Nf' 키트의 시약을 사용하거나, 동일한 성능으로 집에서 만든 시약을 사용하여 비용을 절감할 수 있습니다. 우리는 또한 총 RNA에서 sRNA의 정제 및 preadenylated 3' 어댑터의 제조를 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

프로토콜

1. 작은 RNA의 격리

1. 페놀 계 시약 또는 다른 방법을 사용하여 총 RNA를 추출합니다. RNA가 좋은 품질인지 확인합니다.
2. 200 V에서 15 분 동안 15 % TBE 우레아 젤 (재료 표참조)을 미리 실행하십시오.
3. 겔이 사전 실행되는 동안, 5-15 μL 부피의 포름아미드 로딩 염료(재료 표참조; 95% 탈이온화된 포르마미드, 0.025% 브로모페놀 블루, 0.025% 자일렌 시안올, 5 mM EDTA pH 8)를 20μg의 PC에서 혼합한다. 마찬가지로, 작은 RNA 사다리의 10 μL (200 ng)를동일한 부피의 포름아미드 로딩 염료와 혼합하십시오. 가열 된 뚜껑이있는 열사이클러에서 65 °C에서 5 분 동안 인큐베이션 한 다음 튜브를 얼음에 즉시 놓습니다.
4. 사다리와 샘플을 적어도 하나의 레인으로 동일한 겔에 적재하고 브로모페놀 블루(진한 청색)가 겔 길이의 약 2/3(약 40분)까지 200V에서 실행한다.
5. 다음과 같이 젤에서 RNA를 용해하는 시스템을 준비하십시오 : 21 게이지 바늘로 뉴클레아제없는 0.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브의 바닥에 구멍을 뚫습니다. 천공 된 0.5 mL 튜브를 뉴클레아제없는 둥근 바닥 2 mL 마이크로 원심 분리튜브에 놓습니다.
6. 겔을 제거하고, 실온에서 3 μL 핵산 겔 얼룩(10,000 x 농축물; 물질 표참조)을 30 mL 물에서 10-15분 동안 배양한다.
7. '다크 리더' 트랜스 일루미너이터에서 젤을 보고(RNA를 손상시킬 수 있으므로 UV를 피하는 것이 좋습니다) 17 nt와 29 nt 사다리 대역 사이의 샘플 RNA를 잘라냅니다. 겔 조각을 1.5단계에서 0.5 mL 튜브로 옮김.
8. 2 분 동안 최대 속도로 마이크로 원심 분리기에서 2 mL 튜브에 0.5 mL 튜브를 원심 분리. 지금 비어 있어야 0.5 mL 튜브를 제거합니다.
9. 분쇄된 겔을 함유하는 2 mL 튜브에 300 μL의 뉴클레아제 프리 0.3 M NaCl을 넣고 실온에서 또는 4°C에서 하룻밤(16시간)에서 적어도 2시간 동안 회전한다.
10. 분쇄된 젤 조각의 현탁액을 스핀 컬럼(재료 표참조)과 원심분리기를 마이크로 원심분리기에서 최대 속도로 2분 동안 옮니다.
11. 글리코겐 1 μL(20 μg/μL)과 실온 100% 에탄올 950 μL을 추가합니다. -80°C에서 30분 이상 배양한다.
12. 4 °C에서 마이크로 원심 분리기에서 최대 속도로 20 분 동안 원심 분리기. 상급을 제거하고 800 μL의 차가운 80 % 에탄올로 펠릿을 씻으십시오. 원심분리기를 4°C에서 5분 간 다시 제거하고 모든 상급체를 조심스럽게 제거합니다. 뉴클레아제 자유물 15 μL에서 RNA 펠릿을 다시 중단시다. 전형적으로, 작은 RNA의 ~5-20 ng는 입력 총 RNA의 양에 따라 회복되어야 한다(입력 총 RNA의 1 μg 당 작은 RNA의 ~1 ng).
13. 권장 추가 단계: 회수된 sRNA의 양 및 품질을 확인한다(예를 들어, 작은 RNA 키트를 사용하여 모세관 겔 전기동공에 의한; 재료표참조).

2. 사전 3' HD 어댑터 준비

참고: 3' HD 어댑터의 사전 조정은 첸 외^18에의해 설명된 프로토콜과 유사한 방식으로 수행되었다. 미리 입력된 어댑터는 직접 주문할 수 있지만(/5rApp/ 수정), 이것은 매우 비쌉입니다.

1. 주문 5' 인산화, 3' 차단 3' HD 어댑터 올리고뉴클레오티드. 시퀀스 및 수정사항은 표 1을 참조하십시오. 참고로 '3AmMO'는 3' 아미노 수정기 그룹이며, 대부분의 공급업체는 이러한 수정을 통해 올리고뉴클레오티드를 생산할 수 있습니다. 뉴클레아제 자유물에 100 μM으로 희석한다.
2. 다음 시약을 포함하는 100 μL 반응을 설정합니다: 올리고 10 μL (100 μM), T4 RNA 리가제 완충제 10 μL (10x), ATP의 10 μL (10 mM), 40 μL 의 50% PEG8000, 5 μL의 T4 RNA 리가제 1 (50 단위), 25μass. 20 °C에서 하룻밤 배양.
3. 에탄올 침전후 프리아베닐화된 올리고뉴클레오티드의 고전적인 페놀-클로로폼 추출을 수행한다. 산 (pH 4.5) 페놀 : 클로로 포름과 와류의 100 μL을 추가합니다. 실온에서 최대 속도로 5분 동안 회전합니다. 상층의 90 μL을 신중하게 새로운 튜브로 옮기고; 10 μL의 3 M 아세테이트 pH 5.2, 초순수 글리코겐 1 μL 및 차가운 100 % 에탄올 250 μL을 추가하십시오.
4. -20°C에서 30분 이상 원심분리기를 4°C 최대 속도로 30분 간 유지합니다. 상급체를 제거하고 펠릿을 500 μL 차가운 80 % 에탄올로 한 번 씻으십시오. 페놀-클로로폼 추출 및 에탄올 침전의 대안으로서, 뉴클레오티드 제거 키트를 사용할 수 있다(재료 표참조). 25 μL 의 물에 다시 일시 중단하십시오.
5. 단일 가닥 DNA의 특정 검출을 위한 키트를 사용하여 어댑터의 농도를 측정합니다(재료 표참조). 80 ng/μL (10 μM)로 희석하십시오.
6. 권장 추가 단계: 15% TBE-우레아젤(재료표)에1μL의 1μL을 처리되지 않은 올리고뉴클레오티드와 함께 이동하여 프리아데닐레이션의 효능을 확인하였다. 미리 처리된 어댑터는 처리되지 않은 올리고뉴클레오티드보다 약간 느리게 이동해야 합니다. 원하는 경우, 미리 된 어댑터는 겔 정제 될 수있다; 위에서 설명한 대로 진행하십시오(단계 1.2-1.12).

3. 도서관 준비 - 프로토콜 TS5

참고: 우리는 우리가 이전에^설명한 수정된 TS 프로토콜 'TS5'를 여기에서 제시하고 키트에서 시약 또는 자가 제공된 시약으로 수행될 수 있습니다. 우리는 다른 프로토콜, 'TS7'와 유사하거나 약간 더 나은 결과를 얻은 것을 주목해야한다. 그러나 TS7에서는 어댑터 디이머를 제거하기가 더 어렵습니다. 따라서 TS5를 자세히 설명하는 것이 바람직하지만 TS7은 어댑터를 교체하기만 하면 됩니다. TS7의 경우 'MRL(MidRand-Like)' 어댑터 시퀀스를사용합니다(표 1). 여기서 임의화된 영역은 어댑터 중간에 있습니다. 역전사 및 PCR을 위한 프라이머는 5' 어댑터에서 무작위 영역의 3' 어댑터 및 업스트림에서 무작위 화된 영역의 하류로 혼성화될 것이다. 시퀀싱은 5' 어댑터에서 첫 번째 무작위 뉴클레오티드로부터 시작됩니다.

1. 3' 어댑터 결찰.
   1. 0.2 mL 마이크로 원심분리튜브에 1 μL의 사전 3' HD 어댑터(10 μM)와 정제된 소형 RNA 1μL(~0.1-1 μM)을 결합합니다. 열 사이클러에서 72 °C에서 2 분 동안 인큐베이션 한 다음 얼음에 직접 넣습니다.
   2. 4 μL의 50 % PEG 8000 (점성 용액; 파이펫 천천히), RNA 리가제 완충액 1 μL (10x), H₂O 1 μL, T4 RNA 리가제2 트렌차, RNase 억제제 1 μL을 추가합니다. 16 °C에서 하룻밤 배양.
2. 슬리지 없는 3' 어댑터 제거
   1. 10 μL의 뉴클레아제없는 물을 넣고 잘 섞습니다. Nf키트(재료 표)에서3 M NaOAc pH 5.2 또는 '어댑터 고갈 솔루션'의 6 μL을 넣고 잘 섞습니다. 40 μL의 자기 정제 비드(재료 표)와이소 프로판올 60 μL을 넣고 잘 섞습니다. 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.
   2. 용액이 투명해질 때까지 샘플을 마그네틱 랙에 넣습니다. 상급체를 제거하고 폐기하십시오.
   3. 갓 준비한 80% 에탄올 180 μL을 첨가합니다. ~ 30 s에 대 한 배양, 다음 제거. 신선하게 준비된 80% 에탄올을 사용하고 장시간 80% 에탄올로 배양하지 않도록 주의하십시오.
   4. 튜브를 잠시 회전시키고 우물 바닥에 수집되었을 수 있는 잔류 액체를 제거합니다. 구슬을 2분 동안 건조시키자, 10 mM Tris pH 8의 22 μL에서 재중단하거나 Nf 키트에서 재서스펜션 버퍼로 재정지합니다. 2 분 동안 배양 한 다음 용액이 명확해질 때까지 샘플을 자화하십시오.
   5. Nf키트(재료 표)에서3M NaOAc pH 5.2 또는 '어댑터 고갈 솔루션'의 6μL을 새 튜브에 추가합니다. 이전 단계에서 상급물의 20 μL을 이 새로운 튜브로 옮기고 파이펫팅하여 혼합합니다. 자기 비드 40 μL과 100 % 이소 프로판올 60 μL을 추가하고 파이펫팅으로 잘 섞습니다. 5 분 동안 배양하십시오.
   6. 용액이 선명해 질 때까지 샘플을 자화한 다음 상급체를 제거하고 폐기하십시오.
   7. 갓 준비한 80% 에탄올 180 μL을 첨가합니다. ~ 30 s에 대 한 배양, 다음 제거. T에케 케어는 신선하게 제조된 80% 에탄올을 사용하고 장시간 80% 에탄올로 배양하지 않는다.
   8. 튜브를 잠시 회전시키고 우물 바닥에 수집되었을 수 있는 잔류 액체를 제거합니다. 구슬을 2 분 동안 건조시키고 뉴클레아제없는 물 10 μL에서 다시 일시 중단하십시오. 2 분 동안 배양 한 다음 용액이 명확해질 때까지 샘플을 자화하십시오.
   9. 상급의 9 μL을 새 튜브로 옮김. T4 RNA 리가제 완충제(10x)와 물 1 μL을 1 μL 더 넣습니다. 또는 TS 키트에서 2 μL의 리가아제 버퍼를 추가합니다.
3. 5' 어댑터 결찰.
   1. 5' HD 어댑터 1 μL(10 μM; 표 1) 가열 된 뚜껑이있는 열 사이클러에서 200 μL PCR 튜브에. 70 °C에서 2 분 동안 인큐베이션 한 다음 튜브를 얼음에 직접 넣습니다.
   2. 1 0 mM ATP의 1 μL 및 T4 RNA 리가제 1의 1 μL을 추가합니다. 부드럽게 파이펫팅하여 잘 섞으세요. 3.2.9 단계에서 3'결개 된 RNA에이 혼합물의 3 μL을 추가하고 파이펫팅으로 혼합하십시오. 28 °C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
4. 역전사(RT)
   1. 새로운 200 μL PCR 튜브에 3' 및 5' 어댑터 결찰 RNA의 6 μL을 전송합니다 (필요한 경우 나중에 사용하기 위해 나머지 ~ 8 μL을 -80 °C에서 유지하십시오). RT 프라이머 1 μL추가 (10 μM; 표 1) 파이펫팅으로 혼합합니다. 70 °C에서 2 분 동안 인큐베이션 한 다음 튜브를 얼음에 직접 넣습니다.
   2. RT에 대한 다음 시약을 추가: 5x 제1 스트랜드 완충제 의 2 μL, 0.5 μL 의 12.5 mM dNTP 혼합, 100 mM DTT의 1 μL, RNase 억제제의 1 μL, 및 역전사의 1 μL(재료표). 50 °C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
5. PCR 증폭
   1. RT 반응 혼합물의 12.5 μL에 다음 시약을 첨가: PCR 폴리머라제 완충제 10 μL, 범용 P5 프라이머 2 μL (10 μM; 표 1),P7-인덱스 프라이머의 2 μL(10 μM; 표 1),1 μL 의 12.5 mM dNTP, 0.5 μL의 DNA 폴리머라제(재료 표),및 22 μL의 물. 사용 될 때까지 얼음에 반응을 유지합니다.
   2. 다음 PCR 프로그램을 실행: 30s에 대한 98 °C, 11 사이클 (10 s의 경우 98 °C, 30 s의 경우 60 °C, 15 s의 경우 72 °C) 및 72 °C10 분 동안 10 분 동안 반응을 유지하십시오.
      참고: PCR 사이클 의 수에 관한: 우리는 일반적으로 수행 11 사이클, 하지만이 사용자에 의해 최적화 되어야 한다. 가능한 최소한의 PCR 주기를 수행하십시오.
6. 젤 정제
   1. PCR 제품의 5, 10 및 20 μL을 기본 6% TBE 젤(재료 표참조)과 적절한 사다리(재료 표참조)로 실행합니다. 145 V에서 약 1 시간 동안 젤을 실행하십시오 (브로모페놀 블루가 바닥에 도달 할 때까지 이 염료는 65 bp 위치에서 이동합니다).
   2. 겔을 제거하고, 10-15분 동안 물에 핵산 겔 얼룩(물질 표참조)으로 배양한다.
   3. "다크 리더" 트랜스 일루미너레이터에서 젤을 보고(RNA를 손상시킬 수 있으므로 UV를 피하는 것이 좋습니다) 라이브러리 밴드를 150 bp로 잘라내고, 1.5단계에서 설명한 바와 같이 겔로부터 RNA를 용해시키고 겔 조각을 0.5 mL 튜브로 옮기는 시스템을 준비한다.
   4. 2 분 동안 최대 속도로 마이크로 원심 분리기. 지금 비어 있어야 0.5 mL 튜브를 제거합니다.
   5. 분쇄된 겔을 함유한 2 mL 튜브에 300 μL의 뉴클레아제 없는 물을 넣고 실온에서 또는 4°C에서 하룻밤 동안 적어도 2시간 동안 회전합니다.
   6. 분쇄된 젤 조각의 현탁액을 최대 속도로 2분 동안 스핀 컬럼과 원심분리기로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 합니다.
   7. 글리코겐 1 μL(20 μg/μL), 3M NaOAc 30 μL, 얼음 차가운 100% 에탄올 975μL을 첨가합니다. 4 °C에서 최대 속도로 20 분 동안 원심 분리기.
   8. 10 mM Tris pH8의 20 μL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 농도 측정에 1 μL, 품질 관리를 위해 1 μL을 사용합니다.

4. 데이터 분석

참고: 아래에 설명된 데이터 분석 절차는 Linux 운영 체제 우분투 16.04 LTS를 기반으로 합니다.

1. 원시 시퀀스 파일 처리
   1. 시퀀싱 실행 중에 생성된 FASTQ 시퀀스 파일을 다운로드합니다. 필요한 경우 bcl2fastq2(버전 V2.2.18.12; 다음 링크에서 설명서를 다운로드할 수 있음)http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html)로 다중화를 수행합니다.
      다음 명령을 사용합니다.
      nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq--runfolder-dir Pathway_of_Run --ignore-missing-bcl --output-dir Pathway_of_Output_Directory --바코드-불일치 1 --집계 된 타일 AUTO -r 16 -d 16 -p 16 -w 16
   2. Cutadapt¹⁹ 버전 1.15를 사용하여 어댑터 시퀀스를 제거합니다. 매뉴얼은 여기에서 다운로드 할 수 있습니다 : https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
      다음 명령을 사용합니다.
      통로_to_컷적응/ cutadapt -tGGAATCTCGGGCCAAGG -n 5 -O 4 -m 10 -j 0 --nextseq-트림 10 -o 출력_File_Read1_cutadapt.fastq.gz 입력_File_Read1.fastq.gz
      명령의 서열은 4개의 랜덤 뉴클레오티드가 없는 3' HD 어댑터에 해당합니다. 따라서 이 단계에서는 제거되지 않습니다.
   3. 시퀀싱 판독에서 말단 무작위 뉴클레오티드의 제거를 위해 seqtk(https://github.com/lh3/seqtk)를 사용한다. 다음 명령(굵게 표시된 변수 이름)을 사용합니다.
      seqtk 트림 fq -b 4 -e 4 출력_파일_Read1_컷적응 .fastq > 출력_파일_읽기1 _트리밍 .fastq
   4. 10 nt보다 짧은 시퀀스를 삭제하려면 다음 awk 명령을 사용합니다.
      awk 'BEGIN {FS = "\t"; OFS = "\n"} {헤더 = $0; getline seq ; getline qseq ; getline qseq ; if (length(seq) > 10) {인쇄 헤더, seq, qheader, qseq}' Output_File_Read1_trimmed.fastq > Length_Filtered.fastq .fastq
2. 트리밍된 시퀀스 매핑
   1. miRBase에서 연구의 유기체에 해당하는 데이터베이스를 다운로드하려면 다음과 같이 합니다. http://www.mirbase.org/ftp.shtml 가서 'mature.fa' 파일을 다운로드합니다. 서열은 RNA 표기으로 표시됩니다. U 잔류물을 T로 바꾸면 다음 명령이 있습니다.
      sed -i '/^>/! s/U/T/g' 성숙.fa
      참고 : 이것은 다양한 유기체에서 유래 하는 miRBase의 모든 miRNAs의 전체 목록을 얻을 것 이다.
   2. 다음 명령을 사용하여 관심 있는 유기체의 miRNA 서열을 선택합니다.
      awk 'name_of_the_organism{인쇄; nr[NR+1]; 다음}; NR 의 nr' mature.fa > 성숙한_name_of_the_organism_mirs.fa
   3. Bowtie2^20(버전 2.3.0)을 사용하여 위에서 만든 파일에 읽기를 매핑하여 불일치를 방지합니다. 먼저 다음 명령을 통해 파일에 대한 인덱스를 작성합니다.
      bowtie2-build 성숙한_name_of_the_organism_mirs.fa 성숙한_name_of_the_organism_mirs
   4. 순서 를 데이터베이스에 정렬하여 읽기가 불일치 없이 데이터베이스의 miRNA에 전적으로 매핑되도록 합니다. 이를 위해 다음 도구를 사용하십시오.
      bowtie2 -N 0 -L 10 --점수-분 C,0,0 --엔드-투-엔드-엔드-엔드-엔드-엔드-엔드-엔드-엔드-투-엔드--엔드-투-엔드--시간-x 성숙한_name_of_the_organism_mirs-U Length_Filtered.fastq-S 길이_Filtered_ALIGNMENT.sam
      참고: --점수-분 C,0,0 은 정렬이 불일치없이 되도록 합니다. 도구의 다양한 매개 변수에 대한 설명은 다음 웹 사이트를 방문하십시오 http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml
   5. 정렬되지 않은 읽기를 삭제하려면 다음 명령을 사용합니다.
      samtools 보기 -F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT.sam > Reads_aligned_to_Mirs.sam
      참고: 이러한 단계의 결과로 miRNA에 해당하는 정렬된 읽기를 얻었습니다.

결과

임계 단계는 시작 총 RNA 물질의 작은 RNA 분획의분리(도 3)및 원하는 최종 라이브러리 생성물(도4)이다. 두 단계 모두 폴리아크릴아미드 겔 정제를 포함; 작은 RNA는 15% TBE 우레아 젤에서 분리되고, 최종 라이브러리는 6% 네이티브 TBE 겔로부터 분리된다. 젤로부터 분리된 작은 RNA는 작은 RNA 모세관 전기영동칩(물자표; 그림 3

토론

작은 RNA 라이브러리 제제는 주로 어댑터 결찰 단계 동안 도입된 바이어스로 인해 여전히 도전적이다. 식물 miRNAs, 곤충의 piRNA, 선충 및 포유동물의 piRNA, 곤충 및 식물의 작은 간섭 RNA(siRNA)와 같은 3' 말단에서 2'-OMe 변형을 가진 RNA는 2'-OMe 변형이 3' 적응기 결찰을 억제하기 때문에 연구하기가 특히 어렵습니다. sRNA 라이브러리 준비 프로토콜을 개선하기 위해 문헌에서 다수의 솔루션이 제안되었지만,...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)	ThermoFisher	AM9720
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	Nex England Biolabs	P0756S
Agencourt AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63880
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit	Agilent	5067-4626
Bioanalyzer Small RNA Kit	Agilent	5067-1548
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Sigma Aldrich	CLS8162-96EA
Dark Reader transilluminator	various suppiers
HotStart PCR Kit, with dNTPs	Kapa Biosystems	KK2501
NEXTflex small RNA-seq V3 kit	BIOO Scientific	NOVA-5132-05	optional
Novex TBE gels 6%	ThermoFisher	EC6265BOX
Novex TBE Urea gels 15%	ThermoFisher	EC6885BOX
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen	28304
Qubit 4 Quantitation Starter Kit	ThermoFisher	Q33227
Qubit ssDNA Assay Kit	ThermoFisher	Q10212
RNA Gel Loading Dye (2X)	ThermoFisher	R0641
RNA Gel Loading Dye (2X)	ThermoFisher	R0641
RNase Inhibitor, Murine	Nex England Biolabs	M0314S
SuperScript IV Reverse Transcriptase	ThermoFisher	18090200
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	ThermoFisher	S11494
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)	Nex England Biolabs	M0204S
T4 RNA Ligase 2, truncated	Nex England Biolabs	M0242S
TrackIt 50 bp DNA ladder	ThermoFisher	10488043
TruSeq Small RNA Library Prep Kit	Illumina	RS-200-0012/24/36/48	optional
UltraPure Glycogen	ThermoFisher	10814010
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher	EI0001
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher	EI0001
ZR small RNA ladder	Zymo Research	R1090
the last two numbers correspond to the set of indexes