Melhorando O RNA-Seq pequeno: menos polarização e melhor deteção de 2 '-O-methyl RNAs

Resumo

Nós apresentamos um protocolo pequeno detalhado da reparação da biblioteca do RNA com menos viés do que métodos padrão e uma sensibilidade aumentada para 2 '-O-methyl RNAs. Este protocolo pode ser seguido usando reagentes caseiros para economizar custos ou usar kits para conveniência.

Resumo

O estudo de pequenas RNAs (sRNAs) por sequenciamento de próxima geração (NGS) é desafiado por problemas de viés durante a preparação da biblioteca. Diversos tipos de sRNA tais como microRNAs da planta (miRNAs) carregam uma modificação 2 '-O-methyl (2 '-OMe) em seus 3 ' nucleotide terminal. Esta modificação acrescenta outra dificuldade, pois inibe 3 ' ligadura do adaptador. Nós demonstramos previamente que as versões modificadas do protocolo de TruSeq (TS) têm menos polarização e uma deteção melhorada de 2 '-OMe RNAs. Aqui nós descrevemos no protocolo do detalhe ' TS5 ', que mostrou o melhor desempenho total. TS5 pode ser seguido usando reagentes caseiros ou reagentes do kit TS, com desempenho igual.

Introdução

Pequenas RNAs (sRNAs) estão envolvidas no controle de uma diversidade de processos biológicos¹. Os sRNAs regulatórios eucarióticos são tipicamente entre 20 e 30 NT de tamanho; os três tipos principais são microRNAs (miRNA), Piwi-interagindo RNAs (piRNA) e RNAs de interferência pequenas (siRNA). Os níveis de expressão de miRNA aberrantes têm sido implicados em uma variedade de doenças². Isso ressalta a importância do miRNAs na saúde e na doença e a exigência de ferramentas de pesquisa quantitativas e precisas para detectar sRNAs em geral.

O sequenciamento de próxima geração (NGS) é um método amplamente utilizado para estudar sRNAs. As vantagens principais de NGS em comparação com outras aproximações, tais como técnicas quantitativas do PCR ou do microarray (qPCR), são que não precisa um conhecimento a priori das seqüências de sRNA e podem conseqüentemente ser usadas para descobrir RNAs novas, e além sofre menos de sinal de fundo e efeitos de saturação. Além disso, ele pode detectar diferenças de nucleotídeo único e tem uma taxa de transferência maior do que Microarrays. No entanto, o NGS também tem algumas desvantagens; o custo de uma execução de seqüenciamento permanece relativamente alto e o processo de várias etapas necessário para converter uma amostra em uma biblioteca para seqüenciamento pode introduzir vieses. Em um processo típico de preparação da biblioteca sRNA, um adaptador de 3 ' é primeiro ligado ao sRNA (muitas vezes purificado a partir do RNA total) usando uma versão truncada de RNA ligase 2 (RNL2) e um adaptador de 3 ' preadenylated (Figura 1) na ausência de ATP. Isso aumenta a eficiência da ligadura do adaptador sRNA e reduz a formação de reações colaterais, como circularização de sRNA ou concatemerização. Posteriormente, um adaptador de 5 ' é ligado por RNA ligase 1 (RNL1), seguido por transcrição reversa (RT) e amplificação de PCR. Todos estes passos podem introduzir viés^3,4. Consequentemente, os números de leitura podem não refletir os níveis de expressão sRNA reais, levando a padrões de expressão artificiais e dependentes de método. Os sRNAs específicos podem ser over-ou underrepresentado em uma biblioteca, e os sRNAs fortemente subrepresentados podem escapar da detecção. A situação é particularmente complicada com miRNAs vegetais, siRNAs em insetos e plantas, e piRNAs em insetos, nematoides e mamíferos, nos quais o nucleotídeo terminal 3 ' tem uma modificação 2 '-O-metil (2 '-OMe)¹. Esta modificação inibe fortemente 3 ' ligadura do adaptador⁵, fazendo a preparação da biblioteca para estes tipos de RNA uma tarefa difícil.

O trabalho prévio demonstrou que a ligadura do adaptador introduz viés grave, devido à^{sequência de RNA}/efeitos de estrutura^{6,7,8,9,10,11}. As etapas a jusante da ligadura do adaptador tais como a transcrição reversa e o PCR não contribuem significativamente à polarização^6,11,12. A polarização da ligadura é provável devido ao fato de que as moléculas do adaptador com uma determinada seqüência irão interagir com moléculas de sRNA na mistura de reação para formar codobras, que podem levar a configurações favoráveis ou desfavoráveis para a ligadura (Figura 2). Dados de Sorefan et al⁷ SUGEREM que RNL1 prefere um único contexto encalhado, enquanto RNL2 prefere uma dupla vertente para a ligadura. O fato de que as estruturas cofold Adapter/sRNA são determinadas pelo adaptador específico e seqüências sRNA explica por que sRNA específicos são over-ou underrepresentado com um determinado adaptador definido. Também é importante notar que, dentro de uma série de bibliotecas sRNA a serem comparadas, as mesmas sequências de adaptadores devem ser usadas. De fato, tem sido observado anteriormente que a mudança de adaptadores pela introdução de diferentes sequências de código de barras altera os perfis de Mirna nas bibliotecas de sequenciamento^9,13.

A randomização de seqüências de adaptadores perto da junção de ligadura provavelmente reduz esses desvios. Sorefan e colegas⁷ adaptadores usados com 4 nucleotídeos aleatórios em suas extremidades, designados adaptadores de "alta definição" (HD), e mostraram que o uso desses adaptadores levam a bibliotecas que refletem melhor os níveis de expressão de Srna verdadeiros. O trabalho mais recente confirmou essas observações e revelou que a região randomizada não precisa ser adjacente à junção de ligadura¹¹. Este novo tipo de adaptadores foi nomeado "MidRand" adaptadores. Juntos, esses resultados demonstram que o design aprimorado do adaptador pode reduzir o viés.

Em vez de modificar os adaptadores, o viés pode ser suprimido através da otimização das condições de reação. O polietileno glicol (PEG), um agente de aglomeração macromolecular conhecido para aumentar a eficiência da ligadura¹⁴, foi mostrado para reduzir significativamente o viés^15,16. Com base nesses resultados, vários kits de "baixo viés" apareceram no mercado. Estes incluem kits que utilizam PEG nas reacções de ligadura, quer em combinação com adaptadores clássicos ou adaptadores HD. Outros kits de evitar a ligadura completamente, e usar 3 ' poliadenilação e modelo de comutação para 3 ' e 5 ' adaptador de adição, respectivamente¹². Em outra estratégia, 3 ' ligadura do adaptador é seguido por uma etapa de circularização, omitindo assim 5 ' ligadura do adaptador¹⁷.

Em um estudo anterior, procurou-se um protocolo de preparação da biblioteca sRNA com os menores níveis possíveis de viés e a melhor detecção de 2 '-OMe RNAs¹². Nós testamos alguns dos acima mencionados ' baixo viés ' kits, que teve uma melhor detecção de 2 '-OMe RNAs do que o protocolo padrão (TS). Surpreendentemente, no entanto, após a modificação (o uso de adaptadores randomizados, PEG nas reações de ligadura e remoção do excesso de 3 ' adaptador por purificação) o último superou os outros protocolos para a detecção de 2 '-OMe RNAs. Aqui, descrevemos detalhadamente um protocolo baseado no protocolo TS, ' TS5 ', que teve a melhor detecção geral de RNAs 2 '-OMe. O protocolo pode ser seguido usando reagentes do kit TS e um reagente do kit ' NF ' ou, para economizar dinheiro, usando reagentes caseiros, com igual desempenho. Nós igualmente fornecemos um protocolo detalhado para a purificação de sRNA do RNA total e a preparação de 3 ' adaptador preadenylated.

Protocolo

1. isolamento de pequenas RNAs

1. Extraia o RNA total usando reagentes à base de fenóis ou qualquer outro método. Verifique se o RNA é de boa qualidade.
2. Pré-executar um 15% TBE-ureia gel (ver tabela de materiais) para 15 min em 200 V.
3. Quando o gel for pre-running, misture 5-20 μg do RNA total em um volume de 5-15 μl com um volume igual do corante da carga do formamida (veja a tabela de materiais; 95% formamida deionizada, 0, 25% azul do bromofenol, 0, 25% cyanol do xileno, 5 milímetros de pH do EDTA 8) em um tubo do PCR de 200 μl. Do mesmo modo, misture 10 μL (200 ng) da escada do pequeno-RNA (veja a tabela dos materiais) com um volume igual de tintura do carregamento do formamida. Incubar por 5 min a 65 ° c em um termocicer com tampa aquecida, em seguida, coloque os tubos imediatamente no gelo.
4. Carregue a escada e a amostra no mesmo gel com pelo menos uma pista entre eles e corra a 200 V até que o azul de bromofenol (azul escuro) tenha migrado cerca de dois terço do comprimento do gel (aproximadamente 40 min).
5. Prepare um sistema para Eluir o RNA do gel como segue: perfure a parte inferior de um micro tubo do centrifugador da nuclease-livre 0,5 ml com uma agulha de 21 calibres. Coloque o tubo perfurado de 0,5 mL num tubo de centrifugação micro de fundo redondo sem nuclease 2 mL.
6. Retire o gel e incubar à temperatura ambiente com 3 μL de mancha de gel de ácido nucleico (10.000 x concentrado; ver tabela de materiais) em 30 ml de água por 10-15 min.
7. Veja o gel em um iluminador trans ' Dark Reader ' (é altamente recomendável evitar UV, pois isso pode danificar o RNA) e cortar o RNA de amostra entre o 17 NT e as faixas de escada de 29 NT. Transfira a peça de gel para o tubo de 0,5 mL a partir do passo 1,5.
8. Centrifugue o tubo de 0,5 mL no tubo de 2 mL num micro centrifugador a uma velocidade máxima de 2 min. Retire o tubo de 0,5 mL, que deve estar vazio agora.
9. Adicionar 300 μL de NaCl 0,3 M sem nuclease ao tubo de 2 mL que contenha o gel esmagado e rodar durante pelo menos 2 h à temperatura ambiente ou a 4 ° c durante a noite (16 h).
10. Transfira a suspensão de peças de gel esmagadas para uma coluna de centrifugação (ver tabela de materiais) e centrifugue durante 2 min a uma velocidade máxima num micro centrifugador.
11. Adicionar 1 μL (20 μg/μL) de glicogênio (ver tabela de materiais) e 950 μL de temperatura ambiente 100% etanol. Incubar durante pelo menos 30 min a-80 ° c.
12. Centrifugue por 20 minutos na velocidade máxima em um micro centrifugador em 4 ° c. Retire o sobrenadante, lave o pellet com 800 μL de frio 80% etanol. Centrifugue novamente durante 5 min a 4 ° c e Retire cuidadosamente todo o sobrenadante. Reressuscitem a pelota do RNA em 15 μL da água livre do nuclease. Tipicamente, ~ 5-20 ng do RNA pequeno deve ser recuperado, dependendo da quantidade de RNA total da entrada (~ 1 ng do RNA pequeno por 1 μg do RNA total da entrada).
13. Etapa adicional recomendada: Verific a quantidade e a qualidade do sRNA recuperado (por exemplo, pela electroforese capilar do gel usando um jogo pequeno do RNA; Veja a tabela dos materiais).

2. preparação de preadenylated 3 ' adaptador de HD

Nota: a Preadenilação do adaptador de 3 ' HD foi feita de forma semelhante ao protocolo descrito por Chen et al¹⁸. Note que o adaptador preadenylated pode ser requisitado diretamente (modificação de/5rApp/), mas este é completamente caro.

1. Ordem 5 ' fosforilado, 3 ' bloqueado 3 ' adaptador HD oligonucleotide. Consulte a tabela 1 para a sequência e as modificações. Note que ' 3AmMO ' é um grupo modificador 3 ' amino, a maioria dos fornecedores pode produzir oligonucleotídeo com esta modificação. Diluir na água nuclease livre a 100 μM.
2. Configurar uma reacção de 100 μL contendo os seguintes reagentes: 10 μL de oligo (100 μM), 10 μL de tampão de ligase de RNA T4 (10x), 10 μL de ATP (10 mM), 40 μL de 50% PEG8000 μL de RNA de T4 ligase 1 (50 unidades), 25 μL de água sem nuclease. Incubar durante a noite a 20 ° c.
3. Realize uma extração clássica do fenol-clorofórmio do oligonucleotide preadenylated seguido pela precipitação do etanol. Adicionar 100 μL de ácido (pH 4,5) fenol: clorofórmio e Vortex. Gire por 5 minutos na temperatura ambiente, velocidade máxima. Transfira cuidadosamente 90 μL da fase superior para um novo tubo; Adicionar 10 μL de acetato de sódio a 3 M pH 5,2, 1 μL de glicogênio ultrapuro e 250 μL de etanol a 100% a frio.
4. Manter a-20 ° c durante pelo menos 30 min. centrifugar durante 30 min a 4 ° c a velocidade máxima. Retire o sobrenadante, lave o pellet uma vez com 500 μL frio 80% etanol. Como uma alternativa à extração de fenol-clorofórmio e precipitação de etanol, um kit de remoção de nucleotídeo pode ser usado (ver tabela de materiais). Resuspend em 25 μL de água.
5. Meça a concentração do adaptador usando um jogo para a deteção específica do ADN único-encalhado (veja a tabela de materiais). Diluir para 80 ng/μL (10 μM).
6. Etapa adicional recomendada: Verificar a eficácia da pré-adenilação através da migração de 1 μL de adaptador de 10 μM em um gel de TBE-ureia 15% (tabela de materiais), juntamente com oligonucleotídeo não tratado. O adaptador preadenylated deve migrar ligeiramente mais lento do que o oligonucleotide não tratado. Se desejado, o adaptador preadenylated pode ser gel-purified; proceder como descrito acima (passos 1.2-1.12).

3. preparação da biblioteca-protocolo TS5

Nota: apresentamos aqui o protocolo TS modificado ' TS5 ' que descrevemos anteriormente¹² e que pode ser realizado tanto com reagentes do kit ou com reagentes autofornecidos. Deve-se notar que obtivemos resultados semelhantes ou mesmo ligeiramente melhores com um protocolo diferente, ' TS7 '. No entanto, com TS7 é mais difícil eliminar dímeros de adaptador. Temos, portanto, preferiu descrever TS5 em detalhes, mas TS7 pode ser seguido simplesmente substituindo os adaptadores. Para TS7 use as seqüências do adaptador ' tipo de MidRand (MRL) ' (tabela 1). Observe que aqui as regiões aleatórias estão no meio dos adaptadores. Os primers para transcrição reversa e PCR hibridizarão para as sequências a jusante da região randomizada no adaptador 3 ' e a montante da região randomizada no adaptador 5 '. O sequenciamento começará a partir do primeiro nucleotídeo randomizado no adaptador 5 '.

1. 3 ' ligadura do adaptador.
   1. Combine 1 μL de adaptador pré-adenilado de 3 ' HD (10 μM) com 1 μL de RNA pequeno purificado (~ 0,1-1 μM) em um micro tubo de centrífuga de 0,2 mL. Incubar por 2 min a 72 ° c em um termocicer, em seguida, colocar diretamente no gelo.
   2. Adicionar 4 μL de 50% PEG 8000 (solução viscosa; Pipet lentamente), 1 μL de tampão da ligase do RNA (10x), 1 μL de H₂O, 1 ΜL de RNA T4 ligase2 truncado, e 1 μL de inibidor de RNase. Incubar durante a noite a 16 ° c.
2. Eliminação do adaptador 3 ' unligated
   1. Adicione 10 μL de água sem nuclease e misture bem. Adicionar 6 μL de 3 M de pH NaOAc 5,2 ou ' solução de depleção de adaptador ' do kit NF (tabela de materiais) e misture bem. Adicionar 40 μL de grânulos de purificação magnética (tabela de materiais) e 60 μL de isopropanol e misturar bem. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
   2. Coloque a amostra em um rack magnético até que a solução pareça clara. Retire e descarte o sobrenadante.
   3. Adicionar 180 μL de etanol preparado na hora 80%. Incubar para ~ 30 s, em seguida, retire. Tome cuidado para usar o etanol preparado na hora 80% e não incubar com 80% de etanol por períodos prolongados.
   4. Gire momentaneamente o tubo e remova o líquido residual que pode ter coletado na parte inferior do poço. Deixe os grânulos secos por 2 min, em seguida, ressuscite em 22 μL de 10 mM TRIS pH 8 ou tampão de ressuscite do kit NF. Incubar por 2 min, em seguida, magnetizar a amostra até que a solução pareça clara.
   5. Adicionar 6 μL de 3 M de pH NaOAc 5,2 ou ' solução de depleção de adaptador ' do kit NF (tabela de materiais) a um novo tubo. Transfira 20 μL do sobrenadante do passo anterior para este novo tubo e misture com pipetagem. Adicionar 40 μL de grânulos magnéticos e 60 μL de isopropanol a 100% e misturar bem com pipetagem. Incubar por 5 min.
   6. Magnetize a amostra até que a solução pareça desobstruída, a seguir remova e descarte o sobrenadante.
   7. Adicionar 180 μL de etanol preparado na hora 80%. Incubar para ~ 30 s, em seguida, retire. TAke cuidado para usar o etanol preparado na hora 80% e não incubar para com 80% etanol por períodos prolongados.
   8. Gire momentaneamente o tubo e remova o líquido residual que pode ter coletado na parte inferior do poço. Deixe os grânulos secos por 2 min, e ressuscite em 10 μL de água nuclease-livre. Incubar por 2 min, em seguida, magnetizar a amostra até que a solução pareça clara.
   9. Transfira 9 μL de sobrenadante para um novo tubo. Adicionar 1 μL de tampão de ligase de RNA T4 (10x) e 1 μL de água. Alternativamente, adicione 2 μL de tampão ligase do kit TS.
3. Ligadura de 5 ' adaptador.
   1. Adicionar 1 μL de adaptador de 5 ' HD (10 μM; Tabela 1) a um tubo do PCR de 200 μL em um cycler Thermo com tampa aquecida. Incubar por 2 min a 70 ° c, em seguida, coloque o tubo diretamente no gelo.
   2. Adicionar 1 μL de ATP de 10 mM e 1 μL de ligase de RNA T4 1. Misture bem suavemente com pipetagem. Adicione 3 μl desta mistura ao 3 ' RNA ligado da etapa 3.2.9 e misture introduzindo com pipting. Incubar por 1 h a 28 ° c.
4. Transcrição reversa (RT)
   1. Transfira 6 μL de 3 ' e 5 ' de RNA ligado adaptador a um tubo novo do PCR de 200 μl (Mantenha o ~ 8 μl restante em-80 ° c para um uso mais atrasado se necessário). Adicionar 1 μL de primer RT (10 μM; Tabela 1) e misture com pipetagem. Incubar por 2 min a 70 ° c, em seguida, coloque o tubo diretamente no gelo.
   2. Adicione os seguintes reagentes para RT: 2 μL de 5x tampão de primeira vertente, 0,5 μL de 12,5 mM dNTP Mix, 1 μL de 100 mM DTT, 1 μL de inibidor de RNase e 1 μL de transcriptase reversa (tabela de materiais). Incubar por 1 h a 50 ° c.
5. Amplificação do PCR
   1. Adicione os seguintes reagentes à 12,5 μL de mistura de reacção RT: 10 μL de tampão da polimerase PCR, 2 μL de primer P5 universal (10 μM; Tabela 1), 2 μL de primer do índice P7 (10 μm; Tabela 1), 1 μL de dNTPs de 12,5 mM, 0,5 ΜL de DNA polimerase (tabela de materiais) e 22 μL de água. Mantenha a reação no gelo até o uso.
   2. Execute o seguinte programa de PCR: 98 ° c para 30 s, 11 ciclos (98 ° c para 10 s, 60 ° c para 30 s e 72 ° c para 15 s) e 72 ° c por 10 min. Mantenha a reacção a 4 ° c quando terminar.
      Nota: a respeito do número de ciclos do PCR: nós realizamos tipicamente 11 ciclos, mas este deve ser aperfeiçoado pelo usuário. Tente executar o menor número possível de ciclos de PCR.
6. Purificação do gel
   1. Execute 5, 10 e 20 μL do produto do PCR em um gel nativo de 6% TBE (veja a tabela dos materiais) junto com uma escada apropriada (veja a tabela dos materiais). Funcione o gel para aproximadamente 1 h em 145 V (até que o azul do bromofenol alcangue a parte inferior; este corante migra na posição 65 BP).
   2. Retire o gel, e incubar com mancha de gel de ácido nucleico (ver tabela de materiais) em água por 10-15 min.
   3. Ver o gel em um "Dark Reader" iluminador trans (é altamente recomendável para evitar UV como isso pode danificar o RNA) e cortar a banda da biblioteca em 150 BP. Prepare um sistema para Eluir o RNA do gel como descrito na etapa 1,5 e transfira a parte do gel ao tubo de 0,5 ml.
   4. Centrifugador em um micro centrifugador na velocidade máxima por 2 minutos remova o tubo 0,5 mL, que deve estar vazio agora.
   5. Adicionar 300 μL de água sem nuclease ao tubo de 2 mL contendo o gel esmagado e rodar durante pelo menos 2 h à temperatura ambiente ou a 4 ° c durante a noite.
   6. Transfira a suspensão de peças de gel esmagadas em água para uma coluna de centrifugação e centrifugue durante 2 min na velocidade máxima.
   7. Adicionar 1 μL de (20 μg/μL) de glicogênio, 30 μL de 3 M de NaOAc e 975 μL de gelo frio 100% etanol. Centrifugador por 20 minutos na velocidade máxima em 4 ° c.
   8. Ressuspender o pellet em 20 μL de 10 mM de tris pH8. Use 1 μL para medição de concentração e 1 μL para controle de qualidade.

4. análise de dados

Nota: o procedimento de análise de dados descrito abaixo é baseado no sistema operacional Linux Ubuntu 16, 4 LTS.

1. Tratamento de arquivos de sequência RAW
   1. Transfira os ficheiros de sequência FASTQ gerados durante a execução de sequenciamento. Se necessário, execute demultiplexing com bcl2fastq2 (versão V 2.2.18.12; um manual pode ser descarregado a partir do seguinte link: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
      Use o seguinte comando:
      nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq--runfolder-dir Pathway_of_Run --ignorar-ausente-BCL--output-dir Pathway_of_Output_Directory --código de barras-desencontros 1--agregados-telhas auto-r 16-d 16-p 16-w 16
   2. Remova as sequências do adaptador usando o Cutadapt¹⁹ versão 1,15. Um manual pode ser baixado aqui: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
      Use o seguinte comando:
      Pathway_to_cutadapt/ cutadapt-a TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-n 5-O 4-m 10-j 0--nextseq-Trim 10-O Output_File_Read1_cutadapt. Fastq. gz Input_File_Read1. fastq. gz
      Note que a sequência no comando corresponde ao adaptador de 3 ' HD sem os 4 nucleotides aleatórios; Estes não serão, portanto, removidos durante esta etapa.
   3. Use seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) para a remoção do terminal nucleotídeos aleatórios nas leituras de sequenciamento. Use o seguinte comando (nomes de variáveis em negrito):
      seqtk trimfq-b 4-e 4 Output_File_Read1_cutadapt . fastq > Output_File_Read1 _ aparado . fastq
   4. Use o seguinte comando awk a fim rejeitar as seqüências mais curtas de 10 NT:
      awk ' Begin {FS = "\t"; OFS = "\n"} {cabeçalho = $0; getline Seq; getline qheader; getline qseq; if (comprimento (Seq) > = 10) {cabeçalho de impressão, Seq, qheader, qseq}} ' Output_File_Read1_ aparada. fastq > Length_Filtered. fastq
2. Mapeamento das sequências cortadas
   1. Faça o download do banco de dados correspondente ao organismo de estudo da miRBase da seguinte forma. Vá para http://www.mirbase.org/ftp.shtml e faça o download do arquivo ' Mature. FA '. Observe que as sequências são indicadas na notação de RNA. Substitua os resíduos de U por T com o seguinte comando:
      sed-i '/^ >/! s/U/T/g ' maduro. FA
      Nota: isto produzirá uma lista completa de todos os miRNAs no miRBase, originando de uma variedade de organismos.
   2. Selecione as sequências de miRNA do seu organismo de interesse com o seguinte comando:
      awk 'name_of_the_organism{imprimir; NR [NR + 1]; Next}; NR em NR ' maduro. FA > mature_name_of_the_organism_mirs. FA
   3. Mapeie as leituras para o arquivo criado acima usando Bowtie2²⁰ (versão 2.3.0) que não permite nenhuma correspondência. Primeiro, crie um índice para seu arquivo com o seguinte comando:
      bowtie2-Build mature_name_of_the_organism_mirs. FA mature_name_of_the_organism_mirs
   4. Alinhe as leituras de sequenciamento ao banco de dados, exigindo que uma leitura seja mapeada inteiramente para um miRNA do banco de dados, sem nenhuma correspondência. Para este fim, use a seguinte ferramenta:
      bowtie2-N 0-L 10--escore-min C, 0,0--end-to-End--Time-x mature_name_of_the_organism_mirs-U Length_Filtered. Fastq-S Length_Filtered_ALIGNMENT. Sam
      Nota: a opção:--Score-min C, 0, 0 assegura que o alinhamento é sem quaisquer incombinações. Para uma explicação dos vários parâmetros na ferramenta, por favor visite o seguinte site: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml
   5. Para descartar as leituras que não se alinham, use o seguinte comando:
      samtools View-F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT. Sam > Reads_aligned_to_Mirs. Sam
      Nota: como resultado destas etapas, você deve agora ter obtido as leituras alinhadas, correspondendo a miRNAs.

Resultados

As etapas críticas são o isolamento da pequena fração de RNA do material de RNA total inicial (Figura 3) e o produto da biblioteca final desejada (Figura 4). Ambas as etapas envolvem a purificação do gel do poliacrilamida; o RNA pequeno é isolado dos géis da ureia de 15% TBE, quando as bibliotecas finais forem isoladas de 6% géis nativos de TBE. O RNA pequeno isolado do gel pode ser analisado em uma microplaqueta capilar pequena da electroforese do RNA ...

Discussão

A preparação pequena da biblioteca do RNA permanece desafiante devido ao viés, introduzida principalmente durante etapas da ligadura do adaptador. RNAs com uma modificação de 2 '-ome em sua extremidade 3 ' tal como miRNAs da planta, Pirna nos insetos, nematóides e mamíferos, e RNAs de interferência pequenos (siRNA) nos insetos e nas plantas são particularmente difíceis de estudar porque a modificação 2 '-ome inibe 3 ' a ligadura do adaptador. Uma série de soluções foram propostas na literatura para melhora...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)	ThermoFisher	AM9720
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	Nex England Biolabs	P0756S
Agencourt AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63880
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit	Agilent	5067-4626
Bioanalyzer Small RNA Kit	Agilent	5067-1548
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Sigma Aldrich	CLS8162-96EA
Dark Reader transilluminator	various suppiers
HotStart PCR Kit, with dNTPs	Kapa Biosystems	KK2501
NEXTflex small RNA-seq V3 kit	BIOO Scientific	NOVA-5132-05	optional
Novex TBE gels 6%	ThermoFisher	EC6265BOX
Novex TBE Urea gels 15%	ThermoFisher	EC6885BOX
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen	28304
Qubit 4 Quantitation Starter Kit	ThermoFisher	Q33227
Qubit ssDNA Assay Kit	ThermoFisher	Q10212
RNA Gel Loading Dye (2X)	ThermoFisher	R0641
RNA Gel Loading Dye (2X)	ThermoFisher	R0641
RNase Inhibitor, Murine	Nex England Biolabs	M0314S
SuperScript IV Reverse Transcriptase	ThermoFisher	18090200
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	ThermoFisher	S11494
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)	Nex England Biolabs	M0204S
T4 RNA Ligase 2, truncated	Nex England Biolabs	M0242S
TrackIt 50 bp DNA ladder	ThermoFisher	10488043
TruSeq Small RNA Library Prep Kit	Illumina	RS-200-0012/24/36/48	optional
UltraPure Glycogen	ThermoFisher	10814010
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher	EI0001
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher	EI0001
ZR small RNA ladder	Zymo Research	R1090
the last two numbers correspond to the set of indexes