Verbesserung der kleinen RNA-Seq: Weniger Voreingenommenheit und bessere Detektion von 2'-O-Methyl RNAs

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein detailliertes reparaturbasiertes Analyseprotokoll für kleine RNA-Bibliotheken mit weniger Voreingenommenheit als Standardmethoden und einer erhöhten Empfindlichkeit für 2'-O-Methyl-RNAs. Dieses Protokoll kann mit hausgemachten Reagenzien befolgt werden, um Kosten zu sparen oder Kits für die Bequemlichkeit zu verwenden.

Zusammenfassung

Die Untersuchung kleiner RNAs (sRNAs) durch Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) wird durch Voreingenommenheitsprobleme während der Bibliotheksvorbereitung in Frage gestellt. Mehrere Arten von sRNA, wie z. B. pflanzliche microRNAs (miRNAs), tragen eine 2'-O-Methyl(2'-OMe) Modifikation an ihrem 3' Terminalnukleotid. Diese Änderung fügt eine weitere Schwierigkeit hinzu, da sie 3' Adapterligation hemmt. Wir haben zuvor gezeigt, dass modifizierte Versionen des 'TruSeq (TS)'-Protokolls weniger Voreingenommenheit und eine verbesserte Erkennung von 2'-OMe RNAs haben. Hier beschreiben wir im Detail Protokoll 'TS5', das die beste Gesamtleistung zeigte. TS5 kann entweder mit hausgemachten Reagenzien oder Reagenzien aus dem TS-Kit mit gleicher Leistung verfolgt werden.

Einleitung

Kleine RNAs (sRNAs) sind an der Kontrolle einer Vielfalt biologischer Prozesse beteiligt¹. Eukaryotische regulatorische sRNAs sind in der Regel zwischen 20 und 30 nt groß; Die drei Haupttypen sind microRNAs (miRNA), piwi-interagierende RNAs (piRNA) und kleine störende RNAs (siRNA). Aberrante miRNA-Expressionsniveaus wurden in eine Vielzahl von Krankheiten verwickelt². Dies unterstreicht die Bedeutung von miRNAs in Gesundheit und Krankheit und die Forderung nach genauen, quantitativen Forschungsinstrumenten zum Nachweis von sRNAs im Allgemeinen.

Die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) ist eine weit verbreitete Methode zum Untersuchen von sRNAs. Die Hauptvorteile von NGS im Vergleich zu anderen Ansätzen, wie quantitativepcR- oder Mikroarray-Techniken (qPCR), bestehen darin, dass es keine a priori-Kenntnisse der sRNA-Sequenzen benötigt und daher verwendet werden kann, um neuartige RNAs zu entdecken, und darüber hinaus leidet es weniger unter Hintergrundsignal- und Sättigungseffekte. Darüber hinaus kann es einzelne Nukleotidunterschiede erkennen und hat einen höheren Durchsatz als Mikroarrays. NGS hat jedoch auch einige Nachteile; Die Kosten für einen Sequenzierungslauf bleiben relativ hoch, und der mehrstufige Prozess, der zum Konvertieren einer Stichprobe in eine Bibliothek für die Sequenzierung erforderlich ist, kann zu Verzerrungen führen. In einem typischen sRNA-Bibliotheksvorbereitungsprozess wird ein 3'-Adapter zunächst mit einer abgeschnittenen Version von RNA Ligase 2 (RNL2) und einem vorgefertigten 3'-Adapter(Abbildung 1) in Abwesenheit von ATP an die sRNA (oft gelgereinigt von der Gesamt-RNA) gebunden. Dies erhöht die Effizienz der sRNA-Adapterligation und reduziert die Bildung von Seitenreaktionen wie sRNA-Zirkularisation oder Konthespirierung. Anschließend wird ein 5'-Adapter durch RNA Ligase 1 (RNL1) ligiert, gefolgt von Reverse Transkription (RT) und PCR-Verstärkung. Alle diese Schritte können Voreingenommenheit^3,4einführen. Folglich spiegeln Lesezahlen möglicherweise nicht die tatsächlichen sRNA-Expressionsniveaus wider, die zu künstlichen, methodenabhängigen Expressionsmustern führen. Bestimmte sRNAs können in einer Bibliothek entweder über- oder unterrepräsentiert sein, und stark unterrepräsentierte sRNAs können der Erkennung entgehen. Besonders kompliziert ist die Situation bei pflanzlichen miRNAs, siRNAs in Insekten und Pflanzen und piRNAs bei Insekten, Nematoden und Säugetieren, bei denen das 3' Terminalnukleotid eine 2'-O-Methyl(2'-OMe)-Modifikation^{hat 1}. Diese Modifikation hemmt die 3' Adapterligation⁵stark, was die Bibliotheksvorbereitung für diese Arten von RNA zu einer schwierigen Aufgabe macht.

Frühere Arbeiten zeigten, dass Adapterligation aufgrund von RNA-Sequenz-/Struktureffekten^6,7,^8,9,10,11eine schwerwiegende Verzerrung einführt. Schritte nach der Adapterligation wie Reverse Transkription und PCR tragen nicht wesentlich zur Verzerrung^6,11,12bei. Ligationsverzerrung ist wahrscheinlich aufgrund der Tatsache, dass Adaptermoleküle mit einer bestimmten Sequenz mit sRNA-Molekülen in der Reaktionsmischung interagieren, um Co-Folds zu bilden, die entweder zu günstigen oder ungünstigen Konfigurationen für Ligation führen können (Abbildung 2). Daten von Sorefan et al⁷ deuten darauf hin, dass RNL1 einen einzelnen gestrandeten Kontext bevorzugt, während RNL2 einen Doppelstrang für Ligation bevorzugt. Die Tatsache, dass die Adapter/sRNA-Ko-Faltstrukturen durch die spezifischen Adapter- und sRNA-Sequenzen bestimmt werden, erklärt, warum bestimmte sRNA mit einem gegebenen Adaptersatz über- oder unterrepräsentiert sind. Es ist auch wichtig zu beachten, dass innerhalb einer Reihe von sRNA-Bibliotheken verglichen werden sollten, die gleichen Adaptersequenzen verwendet werden sollten. In der Tat wurde bisher beobachtet, dass das Ändern von Adaptern durch die Einführung verschiedener Barcodesequenzen miRNA-Profile in Sequenzierungsbibliotheken^9,13verändert.

Die Randomisierung von Adaptersequenzen in der Nähe des Ligationsknotens reduziert diese Verzerrungen wahrscheinlich. Sorefan und Kollegen⁷ verwendeten Adapter mit 4 zufälligen Nukleotiden an ihren Extremitäten, die als "High Definition" (HD) Adapter bezeichnet wurden, und zeigten, dass die Verwendung dieser Adapter zu Bibliotheken führt, die echte sRNA-Expressionsniveaus besser widerspiegeln. Neuere Arbeiten bestätigten diese Beobachtungen und zeigten, dass die randomisierte Region nicht an die Ligationskreuzung¹¹angrenzen muss. Diese neuartige Art von Adaptern wurde "MidRand" Adapter genannt. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass ein verbessertes Adapterdesign Verzerrungen reduzieren kann.

Anstatt die Adapter zu modifizieren, kann Die Verzerrung durch die Optimierung der Reaktionsbedingungen unterdrückt werden. Polyethylenglykol (PEG), ein makromolekulares Crowding-Mittel, das bekanntermaßen die Ligationseffizienz¹⁴erhöht, hat gezeigt, dass es die Verzerrung^15,16signifikant reduziert. Basierend auf diesen Ergebnissen erschienen mehrere "Low Bias"-Kits auf dem Markt. Dazu gehören Kits, die PEG in den Ligationsreaktionen verwenden, entweder in Kombination mit klassischen Adaptern oder HD-Adaptern. Andere Kits vermeiden Ligation ganz, und verwenden 3' Polyadenylierung und Template-Switching für 3' und 5' Adapter Addition, bzw.¹². In einer weiteren Strategie folgt 3' Adapterligation durch einen Zirkularisierungsschritt, wodurch 5' Adapterligation¹⁷weggelassen wird.

In einer früheren Studie haben wir nach einem sRNA-Bibliotheksvorbereitungsprotokoll mit den geringstmöglichen Voreingenommenheitsgraden und der besten Detektion von 2'-OMe RNAs¹²gesucht. Wir haben einige der oben genannten "Low Bias"-Kits getestet, die eine bessere Erkennung von 2'-OMe RNAs als das Standardprotokoll (Standard Protocol, TS) hatten. Überraschenderweise jedoch bei der Modifikation (die Verwendung von randomisierten Adaptern, PEG in den Ligationsreaktionen und Entfernung von überschüssigen 3' Adapter durch Reinigung) übertraf letztere die anderen Protokolle für die Erkennung von 2'-OMe RNAs. Hier beschreiben wir detailliert ein Protokoll, das auf dem TS-Protokoll 'TS5' basiert und die beste Gesamterkennung von 2'-OMe RNAs hatte. Das Protokoll kann mit Reagenzien aus dem TS-Kit und einem Reagenz aus dem "Nf"-Kit oder, um Geld zu sparen, mit hausgemachten Reagenzien, mit gleicher Leistung befolgt werden. Wir bieten auch ein detailliertes Protokoll für die Reinigung von sRNA aus der gesamten RNA und die Herstellung von präadenylierten 3' Adapter.

Protokoll

1. Isolierung kleiner RNAs

1. Extrahieren Sie die gesamte RNA mit phenolbasierten Reagenzien oder einer anderen Methode. Überprüfen Sie, ob die RNA von guter Qualität ist.
2. Führen Sie ein 15% TBE-Harnstoffgel (siehe Materialtabelle) 15 min bei 200 V vor.
3. Während das Gel vorlaufend ist, mischen Sie 5-20 g Gesamt-RNA in einem Volumen von 5-15 l mit einem gleichen Volumen von Formamid-Ladefarbstoff (siehe Tabelle der Materialien;95% deionisiertes Formamid, 0,025% Bromphenolblau, 0,025% Xylol cyanol, 5 mM EDTA pH 8) in einem 200-L-PCR-Rohr. Ebenso mischen Sie 10 l (200 ng) kleine RNA-Leiter (siehe Tabelle der Materialien) mit einem gleichen Volumen von Formamid-Ladefarbstoff. 5 min bei 65 °C in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel inkubieren und die Schläuche sofort auf Eis legen.
4. Laden Sie die Leiter und die Probe auf das gleiche Gel mit mindestens einer Spur zwischen ihnen und laufen Sie bei 200 V, bis das Bromphenolblau (dunkelblau) etwa zwei Drittel der Gellänge (ca. 40 min) migriert hat.
5. Bereiten Sie ein System vor, um die RNA wie folgt aus Gel zu befreien: Punktieren Sie den Boden eines nukleasefreien 0,5 ml Mikrozentrifugenrohrs mit einer 21-Spur-Nadel. Legen Sie das punktierte 0,5 ml-Rohr in ein nukleasefreies Rundboden-Mikrozentrifugenrohr 2 ml.
6. Entfernen Sie das Gel, und inkubieren Sie bei Raumtemperatur mit 3 l Nukleinsäure-Gel-Färbung (10.000 x Konzentrat; siehe Tabelle der Materialien) in 30 ml Wasser für 10-15 min.
7. Sehen Sie sich das Gel auf einem 'Dark Reader' Trans-Illuminator an (es wird dringend empfohlen, UV zu vermeiden, da dies die RNA beschädigen könnte) und schneiden Sie die Proben-RNA zwischen dem 17 nt und dem 29 nt Leiterband aus. Das Gelstück ab Schritt 1,5 in das 0,5 ml-Rohr geben.
8. Zentrifugieren Sie das 0,5 ml-Rohr im 2 ml-Rohr in einer Mikrozentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit für 2 min. Entfernen Sie das 0,5 ml-Rohr, das jetzt leer sein sollte.
9. Fügen Sie dem 2 ml-Rohr, das das zerkleinerte Gel enthält, 300 l Nacl-freie 0,3 M NaCl hinzu und drehen Sie sie mindestens 2 h bei Raumtemperatur oder bei 4 °C über Nacht (16 h).
10. Übertragen Sie die Suspension von zerkleinerten Gelstücken in eine Spinsäule (siehe Materialtabelle)und Zentrifuge für 2 min bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge.
11. Fügen Sie 1 l (20 g/l) Glykogen (siehe Materialtabelle)und 950 l Raumtemperatur 100 % Ethanol hinzu. Mindestens 30 min bei -80 °C inkubieren.
12. Zentrifuge für 20 min bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei 4 °C. Den Überstand entfernen, das Pellet mit 800 l kaltem 80 % Ethanol waschen. Zentrifugieren Sie wieder für 5 min bei 4 °C, und entfernen Sie sorgfältig alle Überstand. Resuspend RNA Pellet in 15 l Nuklease-freies Wasser. In der Regel sollten 5-20 ng kleiner RNA zurückgewonnen werden, abhängig von der Menge der Eingangs-Gesamt-RNA (1 ng kleiner RNA pro 1 g Input-Gesamt-RNA).
13. Empfohlener zusätzlicher Schritt: Überprüfen Sie die Menge und Qualität der zurückgewonnenen sRNA (z.B. durch Kapillargelelektrophorese mit einem kleinen RNA-Kit; siehe Tabelle der Materialien).

2. Vorbereitung des vorgefertigten 3' HD Adapters

HINWEIS: Die Vorpremiere des 3' HD-Adapters erfolgte ähnlich dem von Chen et al¹⁸beschriebenen Protokoll. Beachten Sie, dass vorgefertigte Adapter direkt bestellt werden können (/5rApp/ Modifikation), aber dies ist ziemlich teuer.

1. Bestellen Sie 5' phosphoryliertes, 3' blockiertes 3' HD Adapter Oligonukleotid. Siehe Tabelle 1 für Sequenz und Änderungen. Beachten Sie, dass '3AmMO' eine 3' Aminomodifikatorgruppe ist, die meisten Lieferanten können Oligonukleotid mit dieser Modifikation produzieren. In nukleasefreiem Wasser auf 100 m verdünnen.
2. Richten Sie eine 100-L-Reaktion ein, die folgende Reagenzien enthält: 10 l Oligo (100 m), 10 l T4-RNA-Ligasepuffer (10x), 10 l ATP (10 mM), 40 l 50 % PEG8000, 5 l T4-RNA-Ligase 1 (50 Einheiten), 25 l nukleasefreies Wasser. Über Nacht bei 20 °C inkubieren.
3. Führen Sie eine klassische Phenol-Chlor-Extraktion des präadenylierten Oligonukleotids mit anschließender Ethanolfällung durch. Fügen Sie 100 l Säure (pH 4.5) Phenol: Chloroform und Wirbel hinzu. Drehen Sie für 5 min bei Raumtemperatur, maximale Geschwindigkeit. 90 L der oberen Phase vorsichtig in ein neues Rohr übertragen; 10 l von 3 M Natriumacetat pH 5,2, 1 l ultrareines Glykogen und 250 l kaltes 100% Ethanol hinzufügen.
4. Mindestens 30 min bei -20 °C halten. Zentrifuge 30 min bei einer Höchstgeschwindigkeit von 4 °C. Entfernen Sie den Überstand, waschen Sie das Pellet einmal mit 500 l kalt 80% Ethanol. Als Alternative zur Phenol-Chlorform-Extraktion und Ethanol-Ausfällung kann ein Nukleotid-Entfernungskit verwendet werden (siehe Materialtabelle). In 25 L Wasser wieder aufsetzen.
5. Messen Sie die Konzentration des Adapters mit einem Kit zur spezifischen Detektion von einsträngiger DNA (siehe Tabelle der Materialien). Verdünnung auf 80 ng/l (10 m).
6. Empfohlener zusätzlicher Schritt: Überprüfen Sie die Wirksamkeit der Präadenylierung, indem Sie zusammen mit unbehandeltem Oligonukleotid 1 L von 10 M Adapter auf ein 15% TBE-Urea-Gel(Materialtabelle) migrieren. Der vorgefertigte Adapter sollte etwas langsamer als unbehandeltes Oligonukleotid migrieren. Auf Wunsch kann der vorgefertigte Adapter gelgereinigt werden; wie oben beschrieben (Schritte 1.2-1.12).

3. Bibliotheksvorbereitung - Protokoll TS5

HINWEIS: Wir präsentieren hier das modifizierte TS-Protokoll 'TS5', das wir zuvor¹² beschrieben haben und das entweder mit Reagenzien aus dem Kit oder mit selbst bereitgestellten Reagenzien durchgeführt werden kann. Es sei darauf hingewiesen, dass wir mit einem anderen Protokoll, "TS7", ähnliche oder sogar etwas bessere Ergebnisse erzielt haben. Mit TS7 ist es jedoch schwieriger, Adapter-Dimer zu eliminieren. Wir haben es daher vorgezogen, TS5 im Detail zu beschreiben, aber TS7 kann einfach die Adapter ersetzt werden. Verwenden Sie für TS7 die Adaptersequenzen 'MidRand-Like (MRL)' (Tabelle 1). Beachten Sie, dass sich hier die randomisierten Bereiche in der Mitte der Adapter befinden. Primer für Reverse Transkription und PCR hybridisieren zu den Sequenzen nach dem randomisierten Bereich im 3'-Adapter und vor dem randomisierten Bereich im 5'-Adapter. Die Sequenzierung beginnt mit dem ersten randomisierten Nukleotid im 5'-Adapter.

1. 3' Adapterligation.
   1. Kombinieren Sie 1 l vorgefertigten 3' HD-Adapter (10 'M) mit 1 'L gereinigter kleiner RNA ('0,1-1'M) in einem 0,2 ml Mikrozentrifugenrohr. 2 min bei 72 °C in einem Thermocycler inkubieren und dann direkt auf Eis stellen.
   2. Fügen Sie 4 l von 50 % PEG 8000 (viskose Lösung; Pipet langsam), 1 l RNA-Ligasepuffer (10x), 1 l H₂O, 1 l T4-RNA-Ligase2 abgeschnitten und 1 l RNase-Hemmer hinzu. Über Nacht bei 16 °C inkubieren.
2. Eliminierung von nicht ligaierten 3' Adapter
   1. Fügen Sie 10 l nukleasefreies Wasser hinzu und mischen Sie es gut. Fügen Sie 6 l von 3 M NaOAc pH 5.2 oder 'Adapter Depletion Solution' aus dem Nf-Kit (Materialtabelle) hinzu und mischen Sie sie gut. Fügen Sie 40 l magnetische Reinigungsperlen (Materialtabelle) und 60 l Isopropanol hinzu und mischen Sie sie gut. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   2. Legen Sie die Probe in ein magnetisches Rack, bis die Lösung klar erscheint. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
   3. 180 l frisch zubereitetes 80 % Ethanol hinzufügen. Inkubieren Sie für 30 s, dann entfernen. Achten Sie darauf, frisch zubereitetes 80% Ethanol zu verwenden und nicht mit 80% Ethanol über einen längeren Zeitraum zu brüten.
   4. Drehen Sie das Rohr kurz und entfernen Sie Restflüssigkeit, die sich am Boden des Brunnens gesammelt haben könnte. Lassen Sie die Perlen 2 min trocknen, dann in 22 l von 10 mM Tris pH 8 oder Resuspension Puffer aus dem Nf-Kit wieder aufhängen. 2 min inkubieren, dann die Probe magnetisieren, bis die Lösung klar erscheint.
   5. Fügen Sie 6 L von 3 M NaOAc pH 5.2 oder 'Adapter Depletion Solution' aus dem Nf-Kit(Materialtabelle) zu einem neuen Rohr hinzu. Übertragen Sie 20 l des Überstandes aus dem vorherigen Schritt auf dieses neue Rohr und mischen Sie durch Pipettieren. Fügen Sie 40 l magnetische Perlen und 60 l von 100% Isopropanol hinzu und mischen Sie gut durch Pipettieren. Inkubieren Sie für 5 min.
   6. Magnetisieren Sie die Probe, bis die Lösung klar erscheint, entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
   7. 180 l frisch zubereitetes 80 % Ethanol hinzufügen. Inkubieren Sie für 30 s, dann entfernen. Take pflege frisch zubereitetes 80% Ethanol zu verwenden und nicht mit 80% Ethanol für längere Zeit zu inkubieren.
   8. Drehen Sie das Rohr kurz und entfernen Sie Restflüssigkeit, die sich am Boden des Brunnens gesammelt haben könnte. Lassen Sie die Perlen 2 min trocknen und in 10 l nukleasefreiem Wasser wieder aufhängen. 2 min inkubieren, dann die Probe magnetisieren, bis die Lösung klar erscheint.
   9. Übertragen Sie 9 L Überstand in ein neues Rohr. Fügen Sie 1 L T4-RNA-Ligasepuffer (10x) und 1 l Wasser hinzu. Alternativ können Sie aus dem TS-Kit 2 L Ligase-Puffer hinzufügen.
3. Ligation von 5' Adapter.
   1. Fügen Sie 1 L 5' HD-Adapter (10 'M; Tabelle 1) auf ein 200-L-PCR-Rohr in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel. 2 min bei 70 °C inkubieren und dann direkt auf Eis stellen.
   2. Fügen Sie 1 l von 10 mM ATP und 1 l T4-RNA-Ligase 1 hinzu. Gut durch sanftes Pipetieren gut mischen. Fügen Sie der 3' ligaierten RNA ab Schritt 3.2.9 3 l dieser Mischung hinzu und mischen Sie sie durch Pipettieren. 1 h bei 28 °C inkubieren.
4. Reverse Transkription (RT)
   1. Übertragen Sie die 3'- und 5'-Adapter-ligattierte RNA in ein neues 200-L-PCR-Rohr (halten Sie die restlichen 8 l bei -80 °C für die spätere Verwendung, falls erforderlich). Fügen Sie 1 L RT-Primer (10 M; Tabelle 1) und mischen durch Pipettieren. 2 min bei 70 °C inkubieren und dann direkt auf Eis stellen.
   2. Fügen Sie die folgenden Reagenzien für RT hinzu: 2 l 5x ersten Strangpuffer, 0,5 l mit 12,5 mM dNTP-Mischung, 1 l von 100 mM DTT, 1 L RNase-Inhibitor und 1 l Reverse-Transkriptase(Materialtabelle). 1 h bei 50 °C inkubieren.
5. PCR-Verstärkung
   1. Fügen Sie dem 12,5 l RT-Reaktionsgemisch folgende Reagenzien hinzu: 10 l PCR-Polymerase-Puffer, 2 l universelle P5-Grundierung (10 m; Tabelle 1), 2 L P7-Index-Primer (10 m; Tabelle 1), 1 l mit 12,5 mM dNTPs, 0,5 l DNA-Polymerase(Materialtabelle)und 22 l Wasser. Halten Sie die Reaktion auf Eis, bis sie verwendet wird.
   2. Führen Sie das folgende PCR-Programm aus: 98 °C für 30 s, 11 Zyklen (98 °C für 10 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 15 s) und 72 °C für 10 min. Halten Sie die Reaktion bei 4 °C, wenn Sie fertig sind.
      HINWEIS: Bezüglich der Anzahl der PCR-Zyklen: Wir führen in der Regel 11 Zyklen durch, aber dies sollte vom Benutzer optimiert werden. Versuchen Sie, die kleinstmögliche Anzahl von PCR-Zyklen durchzuführen.
6. Gelreinigung
   1. Führen Sie 5, 10 und 20 L PCR-Produkt auf einem nativen 6% TBE-Gel (siehe Tabelle der Materialien) zusammen mit einer geeigneten Leiter (siehe Tabelle der Materialien). Führen Sie das Gel für ca. 1 h bei 145 V (bis das Bromphenolblau den Boden erreicht; dieser Farbstoff wandert an der 65 bp Position).
   2. Entfernen Sie das Gel, und inkubieren Sie mit Nukleinsäure-Gel-Färbung (siehe Tabelle der Materialien) in Wasser für 10-15 min.
   3. Sehen Sie sich das Gel auf einem "Dark Reader"-Trans-Illuminator an (es wird dringend empfohlen, UV zu vermeiden, da dies die RNA beschädigen könnte) und schneiden Sie das Bibliotheksband bei 150 bp aus. Bereiten Sie ein System vor, um die RNA aus Gel zu lösen, wie in Schritt 1.5 beschrieben, und übertragen Sie das Gelstück in das 0,5 ml-Rohr.
   4. Zentrifuge in einer Mikrozentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit für 2 min. Entfernen Sie das 0,5 ml Rohr, das jetzt leer sein sollte.
   5. Fügen Sie dem 2 ml-Rohr, das das zerkleinerte Gel enthält, 300 l L Nuklease-freies Wasser hinzu und drehen Sie es mindestens 2 h bei Raumtemperatur oder bei 4 °C über Nacht.
   6. Die Suspension zerkleinerter Gelstücke in Wasser in eine Spinsäule und Zentrifuge für 2 min bei maximaler Geschwindigkeit übertragen.
   7. Fügen Sie 1 l (20 g/l) Glykogen, 30 l 3 M NaOAc und 975 l eiskaltes 100% Ethanol hinzu. Zentrifuge für 20 min bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 °C.
   8. Setzen Sie das Pellet in 20 l von 10 mM Tris pH8 wieder auf. Verwenden Sie 1 l für die Konzentrationsmessung und 1 l für die Qualitätskontrolle.

4. Datenanalyse

HINWEIS: Das unten beschriebene Datenanalyseverfahren basiert auf dem Linux-Betriebssystem Ubuntu 16.04 LTS.

1. Behandlung von Rohsequenzdateien
   1. Laden Sie die FASTQ-Sequenzdatei(n) herunter, die während der Sequenzierungsausführung generiert wurde. Führen Sie bei Bedarf das Demultiplexing mit bcl2fastq2 (Version V2.2.18.12; ein Handbuch kann unter dem folgenden Link heruntergeladen werden: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
      Verwenden Sie den folgenden Befehl:
      nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq --runfolder-dir Pathway_of_Run --ignore-missing-bcl --output-dir Pathway_of_Output_Directory --barcode-mismatches 1 --aggregated-tiles AUTO -r 16 -d 16 -p 16 -w 16
   2. Entfernen Sie Adaptersequenzen mit Cutadapt¹⁹ Version 1.15. Ein Handbuch kann hier heruntergeladen werden: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
      Verwenden Sie den folgenden Befehl:
      Pathway_to_cutadapt/ cutadapt -a TGGAATCTCGTGCCAAGG -n 5 -O 4 -m 10 -j 0 --nextseq-trim 10 -o Output_File_Read1_cutadapt.fastq.gz Input_File_Read1.fastq.gz
      Beachten Sie, dass die Sequenz im Befehl dem 3' HD-Adapter ohne die 4 zufälligen Nukleotide entspricht; diese werden daher in diesem Schritt nicht entfernt.
   3. Verwenden Sie seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) zum Entfernen der terminalen zufälligen Nukleotide in den Sequenzierungslesevorgängen. Verwenden Sie den folgenden Befehl (Variablennamen in Fettdruck):
      seqtk trimfq -b 4 -e 4 Output_File_Read1_cutadapt .fastq > Output_File_Read1 _getrimmt .fastq
   4. Verwenden Sie den folgenden awk-Befehl, um die Sequenzen zu verwerfen, die kürzer als 10 nt sind:
      awk 'BEGIN 'FS = ''t' ; OFS = "-n"-Header = 0 ; getline seq ; getline qheader ; getline qseq ; if (length(seq) >= 10) 'print header, seq, qheader, qseq'' Output_File_Read1_trimmed.fastq > Length_Filtered.fastq
2. Mapping der getrimmten Sequenzen
   1. Laden Sie die Datenbank, die dem Untersuchungsorganismus entspricht, von miRBase wie folgt herunter. Gehen Sie zu http://www.mirbase.org/ftp.shtml und laden Sie die Datei "mature.fa" herunter. Beachten Sie, dass die Sequenzen in RNA-Notation angegeben sind. Ersetzen Sie die U-Rückstände durch T durch den folgenden Befehl:
      sed -i '/>/! s/U/T/g' mature.fa
      HINWEIS: Dies ergibt eine vollständige Liste aller miRNAs in miRBase, die aus einer Vielzahl von Organismen stammen.
   2. Wählen Sie die miRNA-Sequenzen Ihres Interessenorganismus mit dem folgenden Befehl aus:
      awk 'name_of_the_organism»print; nr[NR+1]; next;; NR in nr' mature.fa > mature_name_of_the_organism_mirs.fa
   3. Ordnen Sie die Lesevorgänge der oben erstellten Datei mit Bowtie2²⁰ (Version 2.3.0) zu, sodass keine Nichtübereinstimmungen möglich sind. Erstellen Sie zunächst einen Index für Ihre Datei mit dem folgenden Befehl:
      bowtie2-build mature_name_of_the_organism_mirs.fa mature_name_of_the_organism_mirs
   4. Richten Sie die Sequenzierungslesevorgänge an der Datenbank aus, sodass ein Lesefehler vollständig einer miRNA der Datenbank zugeordnet werden muss, ohne dass nicht übereinstimmen. Verwenden Sie zu diesem Zweck das folgende Tool:
      bowtie2 -N 0 -L 10 --score-min C,0,0 --end-to-end --time -x mature_name_of_the_organism_mirs -U Length_Filtered.fastq -S Length_Filtered_ALIGNMENT.sam
      HINWEIS: Die Option :-score-min C,0,0 stellt sicher, dass die Ausrichtung ohne Übereinstimmungen erfolgt. Eine Erläuterung der verschiedenen Parameter im Tool finden Sie auf folgender Website: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml
   5. Um die Lesevorgänge zu verwerfen, die nicht ausgerichtet wurden, verwenden Sie den folgenden Befehl:
      samtools-Ansicht -F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT.sam > Reads_aligned_to_Mirs.sam
      HINWEIS: Als Ergebnis dieser Schritte sollten Sie nun die ausgerichteten Lesevorgänge erhalten haben, die miRNAs entsprechen.

Ergebnisse

Kritische Schritte sind die Isolierung des kleinen RNA-Anteils des Startgesamt-RNA-Materials (Abbildung 3) und des gewünschten Endbibliotheksprodukts (Abbildung 4). Beide Schritte beinhalten Polyacrylamid-Gel-Reinigung; kleine RNA wird aus 15% TBE Harnstoffgelen isoliert, während die endgültigen Bibliotheken aus 6% nativen TBE-Gelen isoliert sind. Kleine rna isoliert aus Gel kann auf einem kleinen RNA Kapillarelektrophorese Chip analysiert werden (Tab...

Diskussion

Die Vorbereitung der kleinen RNA-Bibliothek bleibt aufgrund von Verzerrungen schwierig, die hauptsächlich während der Adapterligationsschritte eingeführt werden. RNAs mit einer 2'-OMe-Modifikation an ihrem 3'-Ende wie pflanzliche miRNAs, piRNA bei Insekten, Nematoden und Säugetieren und kleine störende RNAs (siRNA) in Insekten und Pflanzen sind besonders schwer zu untersuchen, da die 2'-OMe-Modifikation 3' Adapterligation hemmt. Eine Reihe von Lösungen wurden in der Literatur vorgeschlagen, um sRNA-Bibliotheksvorbe...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)	ThermoFisher	AM9720
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	Nex England Biolabs	P0756S
Agencourt AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63880
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit	Agilent	5067-4626
Bioanalyzer Small RNA Kit	Agilent	5067-1548
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Sigma Aldrich	CLS8162-96EA
Dark Reader transilluminator	various suppiers
HotStart PCR Kit, with dNTPs	Kapa Biosystems	KK2501
NEXTflex small RNA-seq V3 kit	BIOO Scientific	NOVA-5132-05	optional
Novex TBE gels 6%	ThermoFisher	EC6265BOX
Novex TBE Urea gels 15%	ThermoFisher	EC6885BOX
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen	28304
Qubit 4 Quantitation Starter Kit	ThermoFisher	Q33227
Qubit ssDNA Assay Kit	ThermoFisher	Q10212
RNA Gel Loading Dye (2X)	ThermoFisher	R0641
RNA Gel Loading Dye (2X)	ThermoFisher	R0641
RNase Inhibitor, Murine	Nex England Biolabs	M0314S
SuperScript IV Reverse Transcriptase	ThermoFisher	18090200
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	ThermoFisher	S11494
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)	Nex England Biolabs	M0204S
T4 RNA Ligase 2, truncated	Nex England Biolabs	M0242S
TrackIt 50 bp DNA ladder	ThermoFisher	10488043
TruSeq Small RNA Library Prep Kit	Illumina	RS-200-0012/24/36/48	optional
UltraPure Glycogen	ThermoFisher	10814010
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher	EI0001
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher	EI0001
ZR small RNA ladder	Zymo Research	R1090
			the last two numbers correspond to the set of indexes