وصف مجاميع البروتين الفردية عن طريق الفحص النانوي بالأشعة تحت الحمراء والفحص المجهري للقوة الذرية

Summary

نحن نصف تطبيق الفحص النانوي بالأشعة تحت الحمراء والفحص المجهري للقوة الذرية عالية الدقة لتصور عملية التجميع الذاتي للبروتين في مجاميع oligomeric وfibrils الأميلويد، والتي ترتبط ارتباطا وثيقا مع بداية والتنمية من مجموعة واسعة من الاضطرابات العصبية البشرية.

Abstract

ظاهرة عدم طي البروتين والتجميع يؤدي إلى تشكيل المجاميع البروتين غير متجانسة للغاية، والتي ترتبط مع الظروف العصبية مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون. وعلى وجه الخصوص، تبين أن المجاميع ذات الوزن الجزيئي المنخفض، وهي قلة الأميلويد، تمتلك خصائص سمية سماوية عامة، وهي متورطة كسموم عصبية في العديد من أشكال الخرف. نحن نوضح استخدام الأساليب القائمة على الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) لمعالجة المهمة الصعبة المتمثلة في توصيف الخصائص المورفولوجية والهيكلية والكيميائية لهذه المجاميع، والتي يصعب دراستها باستخدام الهيكلية التقليدية الأساليب أو الأساليب البيوفيزيائية السائبة بسبب عدم تجانسها وطبيعتها العابرة. وتقترب التنظير المجهري للمسبار المسحي قادرة الآن على التحقيق في مورفولوجيا المجاميع النشوانية ذات الاستبانة دون النانومترية. نبين هنا أن الأشعة تحت الحمراء (IR) nanospectroscopy (AFM-IR)، الذي يستغل في وقت واحد دقة عالية من AFM وقوة التعرف على المواد الكيميائية من مطياف الأشعة تحت الحمراء، يمكن أن تذهب أبعد من ذلك وتمكين توصيف الخصائص الهيكلية للفرد المجاميع البروتين، وبالتالي تقديم رؤى في آليات التجميع. وبما أن النهج الذي نصفه يمكن تطبيقه أيضا على التحقيقات في تفاعلات تجمعات البروتين مع الجزيئات الصغيرة والأجسام المضادة، فإنه يمكن تقديم معلومات أساسية لتطوير مركبات علاجية جديدة لتشخيص أو علاج الاضطرابات العصبية.

Introduction

أكثر من 40 مليون شخص في جميع أنحاء العالم يتأثرون حاليا بالاضطرابات العصبية، مثل مرض الزهايمر (AD)¹ ومرض باركنسون (PD)² الأمراض. وبشكل أعم، يرتبط أكثر من خمسين علم أمراض على المستوى الجزيئي مع سوء طي البروتين والتجميع، وهي عملية تؤدي إلى انتشار مجاميع بروتين الفيبريلار غير القابلة للذوبان، والمعروفة باسم رواسب الأميلويد^{3، 4.}الأصول الجزيئية للتنكس العصبي وصلاتها مع التغيرات المطابقة البروتينية للبروتينات مما يؤدي إلى تشكيل الأميلويد، ومع ذلك، لا تزال غير واضحة، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى مستوى عال من التغاير، والطبيعة العابرة ونانوscale أبعاد المجاميع المرضية^4،5.

وقد استندت التحقيقات الناجحة للغاية من هياكل البروتين في العقود القليلة الماضية على نطاق واسع على استخدام أساليب السائبة، بما في ذلك الأشعة السينية البلورات، والفحص المجهري الإلكترون بالتبريد ومطياف الرنين المغناطيسي النووي^{5، 6 , 7 , 8 , 9}. ضمن هذه الفئة من التقنيات، ظهرت الأشعة تحت الحمراء (IR) مطياف كأداة تحليلية حساسة لكشف الخصائص الكيميائية للنظم البيولوجية مثل البروتينات⁸. تسمح أساليب الأشعة تحت الحمراء بالقياس الكمي للتغيرات الهيكلية الثانوية والرباعية للبروتين أثناء طيها وتجميعها. وبالإضافة إلى ذلك، من أجل المزيد من فك على المستوى المجهري التفاصيل الميكانيكية التي تنطوي عليها المناظر الطبيعية المعقدة للطاقة الحرة من البروتين أثناء تجميعها، كان تقدما كبيرا في تطوير أدوات الحركية الكيميائية لتمتد إلى معقدة مسارات التجميع الذاتي بما في ذلك تشكيل الفيبريلات الأميلويد^{5،6،7،10،11،12.} ومع ذلك، فإن الأساليب الطيفية السائبة لا توفر سوى معلومات متوسطة عن مجموعة غير متجانسة من الأنواع الموجودة في الحل أو المشاركة في خطوات مجهرية محددة، مما يجعل التحقيق في الخصائص البيوفيزيائية للفرد الأنواع المجمعة التي تتحدى على مستوى النانو^13،14.

وقد ظهرت في العقود الأخيرة عدة تقنيات للتنظير المجهري مع القدرة على العمل على مقاييس أصغر من حد الانعراج للضوء. وتشمل هذه الفئة من الأساليب الفحص المجهري الإلكتروني (EM) والفحص المجهري للقوة الذرية (AFM). في حين أن المسح المجهري الإلكتروني (SEM) والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال (TEM) يوفران صورًا ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) للعينة، فقد ظهر AFM في العقود الأخيرة كتقنية قوية ومتعددة الاستخدامات لدراسة المورفولوجيا ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد)، كما فضلا عن الخصائص النانوية الميكانيكا للعينة مع قرار دون نانومتر^{13،14،15،16،17،18،19، 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27.}الأساس المنطقي وراء دراسة تجميع البروتين عن طريق AFM هو أن هذا النهج يتيح التحقيق في مورفولوجيا الأنواع الفردية الموجودة في الحل^{13،14،16، 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31،32،33،34،35،36،37.} على وجه الخصوص، من خلال رصد العينة كدالة للوقت، يسمح AFM بالتحقيق في تطور مورفولوجيا الأنواع داخل العينة، مما يجعل من الممكن متابعة وتصور مسارات تشكيل الأميلويد^{23، 25،38،39،40،41،42.} وعلاوة على ذلك، يتيح AFM التحديد الكمي للمعلمات الهيكلية مثل ارتفاعات وأطوال الأنواع الفردية الموجودة في الحل^{13و19و30و31 ،32،33،34،35،36،37،40،43، 44 , 45 , 46 , 47 , 48}- غير أن دراسة خاصية فيزيائية حيوية واحدة، مثل علم المورفولوجيا، كثيرا ما لا تكون كافية عند دراسة النظم البيولوجية غير المتجانسة والمعقدة. طرق التصوير AFM أو SEM أو TEM وحدها لا تكشف بسهولة عن الخصائص الكيميائية للأنواع غير المتجانسة من المجاميع الأميلويد على مقياس النانو.

وقد أحرز تقدم كبير لتحليل العينات البيولوجية غير المتجانسة على هذا النطاق في الآونة الأخيرة مع تطوير وتطبيق في مجال تجميع البروتين من التصوير النانوبي بالأشعة تحت الحمراء (AFM-IR)^{24،26، 38،42،49،50،51،52.} يستغل هذا الأسلوب المبتكر الجمع بين الاستبانة المكانية لـ AFM (حوالي 1-10 نانومتر) مع قوة التحليل الكيميائي للالأشعة تحت الحمراء. وتستند تقنية AFM-IR إلى قياس تأثير الرنين المستحث بالحرارة الضوئية مدفوعاً بليزر الأشعة تحت الحمراء، وإلى قياس التوسع الحراري للعينة قيد التحقيق من طرف AFM. يمكن إضاءة العينة بواسطة ليزر الأشعة تحت الحمراء مباشرة من أعلى أو من أسفل في انعكاس داخلي كامل، وبالمثل كما هو الحال في مطياف الأشعة تحت الحمراء التقليدية^{24،42،52،53} . يمكن نبض ليزر الأشعة تحت الحمراء بترددات نموذجية بحسب مئات الكيلوهرتز (1-1000 كيلوهرتز) وضبطه على نطاق طيفي واسع، عادة بين 1000-3300 سم^-1. على الرغم من أن مصدر الليزر يغطي مساحة تبلغ حوالي 30 درجة مئوية، يتم تحديد الاستبانة المكانية لتقنية AFM-IR اسمياً من خلال قطر طرف AFM، الذي يكشف التوسع الحراري المحلي للنظام. AFM-IR مناسبة تماما لدراسة العينات البيولوجية لأن إشارة الأشعة تحت الحمراء يتناسب مع سمكها تصل إلى 1-1.5 ميكرومتر، وأطياف الأشعة تحت الحمراء الناتجة عموما تتفق مع أطياف الإرسال FTIR المقابلة^{13،54 ،55}. ولهذا السبب، يمكن تطبيق أساليب التحليل المعمول بها في التحليل الطيفي بسهولة، مثل دراسة التحولات الكيميائية، وتغيير شكل النطاق، وفك الإلتواء عن طريق تحليل المشتقات الثانية^52. وعموما، فإن الجمع بين الاستبانة المكانية للمركبات المضادة للمواد الكيميائية وقوة التعرف الكيميائي على مطياف الأشعة تحت الحمراء، يتيح AFM-IR الحصول في وقت واحد على مجموعة واسعة من الخصائص المورفولوجية والميكانيكية والكيميائية لعينة على مقياس النانو.

هنا، نقوم بتوضيح بروتوكول لتوصيف عملية تجميع البروتين الذي يستغل مزيج من اختبارات الفلورة في المختبر، والتصوير عالي الدقة AFM والأشعة تحت الحمراء نانوية AFM. وقد برع هذا النهج المشترك بالفعل في تقديم نتائج مفصلة في دراسة الخصائص الكيميائية والهيكلية للقطرات الصغيرة الفردية التي شكلتها المجاميع البروتين، في دراسة فصل مرحلة البروتين السائل السائل، وفي التحقيق في التغايرية والخصائص الفيزيائية الحيوية للأنواع المجمعة الفردية في النانومقياس^{23،26،38،45،50،53، 56و57}.

Protocol

1. تجميع الاختبارات على قارئات لوحة الفلورة

ملاحظة: البروتوكول الموضح هنا هو مثال على كيفية دراسة تجميع أي بروتين أو ببتيد بواسطة الحركية الكيميائية. على وجه الخصوص، فإنه يصف بروتوكول الأمثل لدراسة تجميع الببتيد Aβ42، الذي يشارك في بداية وتطور مرض الزهايمر^58،59. ويمكن تعديل بروتوكول مماثل واعتمادها نحو دراسة تجميع أي بروتين أو ببتيد.

1. الحصول على حل أحادي نقي للغاية من Aβ42 من خلال تقنيات تبادل أيون واستبعاد حجم اللونية للتمييز بين كسور البروتين التي تحتوي على Aβ42، وعزل الكسر الأحادي من الأشكال المجمعة الأخرى من Aβ42 التي تم الحصول عليها^{58 , 59}.
2. تمييع الببتيد Aβ42 في 20 مل من احتياطي فوسفات الصوديوم، 200 درجة مئوية EDTA عند درجة الحموضة 8.0⁵⁸ إلى التركيز النهائي المطلوب تتراوح بين 1-5 ميكرومتر، في أنابيب منخفضة الربط 1.5 مل. وينبغي ألا تحتوي العينات التي يتم جمعها لأغراض قياسات AFM على صبغة الفلورسنت المستخدمة في فحص التجميع (الثيوفلافين T, ThT)، لأنها قد تقدم قطعاً أثرية أثناء ترسيب العينات لتحليل هاف. وهكذا، إعداد ثلاثة توائم من حلين متطابقين: '1' الأول الذي يحتوي على Aβ42 الأحادي ة لمتابعة عملية التجميع من قبل AFM؛ '2' الأول الذي يحتوي على Aβ42 الأحادية المنضوية لمتابعة عملية التجميع من جانب AFM؛ '2' أن يكون الأول يحتوي على Aβ42 الأحادية المنضوية لمتابعة عملية التجميع من جانب AFM؛ '2' أن يكون الأول يحتوي على Aβ42 الأحادية ال 2) الثاني الذي يحتوي على aβ42 أحادي مع إضافة 20 μM ThT كمتتبع لرصد حركية التجميع.
   ملاحظة: من المهم تنفيذ الخطوتين 1.1 و 1.2 على الجليد. هذا الإجراء هو التأكد من أن الحل Aβ42 أحادية لا تجميع حتى بدأت في قارئ لوحة. عند التعامل مع العينات، الأنابيب بعناية أمر ضروري لتجنب إدخال أي فقاعات الهواء التي قد تؤثر على عينة البروتين.
3. ماصة 80 ميكرولتر من كل عينة في كل بئر من 96 جيدا، لوحة نصف منطقة من البوليسترين الأسود مع أسفل واضحة والأسطح غير ملزمة.
4. ختم لوحة مع احباط لتقليل تبخر العينة على مدى التجميع.
5. معادلة درجة حرارة قارئ لوحة إلى 37 درجة مئوية.
6. إعداد بروتوكول التجميع لقراءة قياسات الفلورة على فترات زمنية محددة، في الطول الموجي للإثارة من 440 نانومتر وطول موجة الانبعاثات 480 نانومتر. وينبغي الشروع في التجميع في ظروف هادئة.
7. أدخل اللوحة في قارئ اللوحة.
   ملاحظة: من المهم أن تكون حذراً أثناء التعامل مع اللوحة للتأكد من عدم تشغيل التجميع قبل بدء تشغيل قارئ اللوحة. استخدم إعدادات ضبط الكسب لضمان القراءة المثلى لفلورة كل عينة.
8. بدء القياس.
   ملاحظة: يتم الانتهاء من تجربة التجميع عندما يصل منحنى الفلورة السينية ThT إلى هضبة⁵⁸.

2. إعداد عينة لقياسات AFM ونانو الأشعة تحت الحمراء

1. الغراء أعلى جودة الصف V1 الميكا القرص إلى جودة عالية المغناطيسي الفولاذ المقاوم للصدأ القرص باستخدام علامات التبويب لاصقة أو الشريط على الوجهين.
2. حفر الميكا عن طريق وضع قطعة من شريط لاصق على سطح الميكا وسحب قبالة الطبقة العليا من الميكا. هذا الإجراء سوف تنتج نظيفة، سطح مستو ذري، ومناسبة لترسب العينة.
   ملاحظة: يجب أن يكون السطح المحفور موحدًا وسلسًا.
   تحذير: لا تلمس أو تتنفس مباشرة فوق الميكا محفورة حديثا، وهذا سوف يقدم التحف.
3. إيقاف/إيقاف قياس قارئ اللوحة لجمع نقطة الاهتمام الزمنية أثناء عملية تجميع البروتين.
4. إزالة احباط الختم وجمع 10 ميكرولتر aliquot من العينات دون ThT من البئر إلى أنابيب منخفضة الربط 1.5 مل.
5. إيداع 10 ميكرولتر من العينة على الميكا محفورة حديثا. لAFM-IR القياسات يجب أن تودع عينات على الركيزة الذهب جردت حديثا.
6. احتضان الحل على الميكا لمدة دقيقة واحدة للسماح physisorbtion.
   ملاحظة: وقت الحضانة أطول من شأنه أن يسمح امتصاص أفضل على السطح ولكن قد تحفز التنظيم الذاتي الاصطناعي والتجمع الذاتي²⁵. لتجنب هذه الآثار ، يمكن استغلال ترسب الرش²⁵.
7. شطف ثلاث مرات مع 1 مل من الماء النقي جدا.
8. يجف تحت تدفق لطيف من النيتروجين لقياس العينة في بيئة الهواء.

3. AFM التصوير من مورفولوجيا مجاميع البروتين

ملاحظة: يمكن إجراء قياسات مورفولوجيا في كل من الاتصال والوضع الديناميكي، في الخطوات التالية يتم وصف هذا الأخير لأنه يقلل من القوى الجانبية لقياس مورفولوجيا 3D للعينة مع دقة عالية. وسيتم إجراء قياسات AFM-IR في وضع الاتصال لتعزيز نسبة الإشارة إلى الضوضاء AFM-IR.

1. تشغيل نظام AFM ما لا يقل عن 30 دقيقة قبل القياسات من أجل تمكين النظام من الوصول إلى الاستقرار الحراري. انقر على الإعداد، ثم على التحقيق. في نافذة تغيير التحقيق انقر على التالي لإعداد Z، مرحلة التركيز.
2. إيقاف تشغيل مفتاح شعاع AFM (إذا كان على). فتح أقفال dovetail، وقطع الرأس من النظام وفي نافذة تغيير التحقيق انقر على التالي.
3. قم بتركيب الشمعدانات AFM على حامل المسبار. ربط الرأس إلى النظام وقفل أقفال dovetail.
   ملاحظة: تحتوي الكانتيليفرز المثلى لدراسة العينات البيولوجية في الوضع الديناميكي AFM على ثابت ربيعي يتراوح بين 2-40 نيوتن^{متر -1} ورادي قمة تتراوح بين 2-8 نانومتر^14.
4. تشغيل مفتاح شعاع الليزر AFM وفي نافذة تغيير التحقيق انقر على التالي.
5. في النافذة المنبثقة انقر على لا إذا لم يتغير نوع cantilever. ضبط مقابض المحاذاة البصرية للعثور على cantilever. ضبط التركيز على cantilever وانقر على التالي.
6. في النافذة المنبثقة انقر على نعم إذا كان التركيز على cantilever.
7. وضع شعاع الليزر في نهاية cantilever باستخدام المقابض السيطرة على موقف الليزر الكشف. قم بتعظيم الإشارة الإجمالية التي تقاس بالصمام الضوئي المكون من أربعة أرباع إلى ما لا يقل عن >1 V باستخدام المقابض التي تتحكم في موضع شعاع الليزر المنحرف على الصمام الضوئي الحساس (PSPD). في نافذة تغيير التحقيق انقر فوق التالي ثم على إغلاق.
8. انتظر 15 دقيقة حتى تصل إلى الاستقرار الحراري. تعديل موقف شعاع الليزر المنحرف على PSPD إذا لزم الأمر.
9. انقر على NCM SWEEP، اختر السعة المطلوبة من التذبذب ، انقر على مرحلة الاستخدام، انقر على السيارات ولحن cantilever على مقربة من الحد الأقصى من أول رنين حر من التذبذب ، والذي هو ما يقرب من 300 كيلو هرتز ل cantilever مع ثابت الربيع من 40 N م^-1.
   ملاحظة: ضبط cantilever للخروج من الحد الأقصى من الرنين الحر يضمن استقرار أعلى من القياسات¹⁴.
10. ضع العينة على حامل العينة. اختر معلمات التصوير المناسبة. معدل المسح النموذجي هو 0.3−1.0 هرتز لمنطقة المسح الضوئي من 1 × 1 ميكرومتر² إلى 5 × 5 ميكرومتر². الدقة النموذجية المطلوبة بين 256 × 256 و 1024 × 1024 بكسل. انقر على منطقة المسح الضوئي لاختيار حجم المسح الضوئي ورقم البكسل.
11. تركيز طريقة العرض البصرية على العينة. انقر على نهج للاقتراب من سطح العينة. بمجرد الانتهاء من الاقتراب انقر على رفع 100 ميكرومتر لرفع طرف AFM 100 ميكرومتر فوق سطح العينة. انقر فوق توسيع الصورة البصرية للعينة. انقر على شريط "مرحلة التركيز" لتركيز طريقة العرض على سطح العينة.
12. استخدام الأسهم للتحرك في المنطقة من عينة من الفائدة. إشراك السطح عن طريق الضغط على زر النهج. انقر على زر مسح الخط، وتحقق مما إذا كان الطرف يتبع السطح بشكل جيد، إذا لزم الأمر، وضبط نقطة تعيين.
13. ابدأ تصوير سطح العينة عن طريق الضغط على زر المسح الضوئي. أثناء التصوير، لتجنب قوة التصوير الكبيرة والحفاظ على الاتساق داخل عينات مستقلة، والحفاظ على نظام ثابت من تغيير المرحلة لا تتجاوز Δ20 °^42.
14. أدخل اسم الملف واختر الدليل الأساسي حيث سيتم حفظ الصورة المكتسبة.

4. قياسات الأشعة تحت الحمراء nanospectroscopy من المجاميع البروتين

1. قم بتشغيل نظام AFM-IR وليزر الأشعة تحت الحمراء^{(IR) 60} 30-60 دقيقة قبل قياسات التثبيت الحراري. الليزر النموذجي لأدوات AFM-IR هي مذبذبات المعلمة البصرية (OPO) والليزر تتالي الكم (QCL).
2. افتح البرنامج المدمج للتحكم في الأداة. انقر فوق الملف ثم على جديد لفتح ملف nanoIR جديد. اضغط على الزر الأحرف الأولى لبدء تشغيل نظام AFM-IR.
3. فتح غطاء الصك وجبل على نظام AFM-IR مسبار السيليكون الذهب المغلفة مع دائرة نصف قطرها الاسمية من 30 نانومتر وثابت الربيع من 0.2 N / م لقياس العينة في وضع الاتصال.
4. انقر على تحميل في التحقيق AFM القسم ثم التالي. في التركيز على قسم التحقيق انقر على الأسهم لتركيز الكاميرا على cantilever. في المقطع عينة حركة XY، استخدم الأسهم لوضع الهواء عبر في نهاية cantilever.
5. تدوير المقابض السيطرة على موقف الليزر الكشف لوضع الليزر في نهاية cantilever. تدوير المقابض الليزر للكشف عن وتعظيم المبلغ الذي يقاس بأربعة أرباع الصمام الضوئي إلى قيمة >3 V. تدوير مقبض انحراف لضبط انحراف cantilever إلى -1 V ثم انقر فوق التالي. أغلق غطاء الأداة.
6. في القسم التركيز على عينة استخدام الأسهم لتركيز الكاميرا على العينة. ثم، في نموذج المقطع حركة XY استخدام الأسهم للتحرك في المنطقة من مصلحة العينة وانقر على النهج والانخراط.
7. في إطار المجهر حدد كمدخلات القنوات ذات الأهمية لرسم خريطة الخصائص البيوفيزيائية للعينة. على وجه الخصوص، واختيار الارتفاع للمورفولوجيا، السعة 2 لامتصاص الأشعة تحت الحمراء وتردد PLL لرسم خريطة طرف عينة رنين الاتصال.
8. في قسم المسح الضوئي AFM من إطار عناصر التحكم، استخدم معلمات مشابهة كما في القسم 3 (أي معدل المسح الضوئي 0.1−1.0 هرتز، بين 256 × 256 و1024 × 1024 بكسل). اختر كقيمة للمكاسب وفقًا لخشونة العينة: التكامل الأول = 1-10 وP النسبي = 10-30. ثم، انقر على المسح الضوئي للحصول على خريطة مورفولوجيا.
   ملاحظة: يمكن قياس المورفولوجيا بشكل مماثل في وضع التنصت الديناميكي، ولكن يتم إجراء قياسات AFM-IR هنا في وضع الاتصال للحصول على إشارة أعلى إلى نسب الضوضاء.
9. بعد الانتهاء من رسم الخرائط من مورفولوجيا، في نافذة المجهر، انقر على خريطة الارتفاع لوضع التحقيق على الجزء العلوي من تجميع واحد. ثم في قسم nanoIR من نافذة عناصر التحكم، انقر فوق بدء تشغيل الأشعة تحت الحمراء لإلقاء الضوء على العينة باستخدام ليزر الأشعة تحت الحمراء.
10. لتركيز الليزر بالأشعة تحت الحمراء على cantilever، انقر على تحسين. في هذا الإطار، اكتب number موجة حيث العينة ستكون لها امتصاص عالية وانقر فوق إضافة. بالنسبة للبروتين، تبلغ القيمة النموذجية 1655 سم^-1. انقر على المسح الضوئي للعثور على موقف الليزر الأشعة تحت الحمراء وانقر على التحديث لمحاذاة موقفها مع cantilever. أغلق النافذة.
11. في القسم العام من إعداد nanoIR، اكتب number موجة حيث من المتوقع امتصاص عالية في المجال النسبي. ثم قم بإلغاء تنشيط خيار "تصفية تمرير النطاق" وانظر إلى قراءة العداد وفي تحويل فورييه السريع (FFT) للاستجابة. في إطار FFT نقل المؤشر الأخضر لقراءة تردد الرنين من cantilever. قيمة نموذجيّة من ال [فّت] من الرنين من ال [كنتلفرس] حوالي 300 [كهز]. اكتب قيمة تردد الرنين هذه في القسم العام في حقل مركز freq. واستخدم نافذة freq. من 50 كيلو هرتز.
    ملاحظة: حدد قوة الليزر منخفضة بما يكفي لعدم تشبع قراءة العداد ويكون التشويه في استجابة cantilever وعدم تسخين العينة.
12. انقر على نافذة لحن نبض الليزر لاستخدام وضع الرنين المحسن. اختر مركز تردد 300 كيلو هرتز، ومجموعة من الأنيقات 50 كيلو هرتز ودورة عمل الليزر بنسبة 5%. انقر على الحصول على اكتساح معدل نبض الليزر. باستخدام المؤشر في الرسم البياني، ضبط نبض الليزر إلى تردد الاستجابة الميكانيكية للتوسع الحراري للعينة استيعاب ضوء الأشعة تحت الحمراء. ثم حدد الخيار PLL لمراقبة رنين جهة الاتصال بين العينة والطرف. اضغط على زر الصفر في إطار PLL ووضع علامة تمكين لتتبع رنين جهة الاتصال طرف العينة. اختيار ربح متكامل I = 0.5 والربح النسبي P = 10. أغلق النافذة.
13. فتح مرة أخرى نافذة التحسين والعثور على موقف الليزر الأشعة تحت الحمراء لما لا يقل عن 3 أرقام الموجي المقابلة لنطاقات امتصاص الرئيسية للعينة (أميد الفرقة I-II-III) ولعدد موجة واحد على الأقل لكل رقاقة من الليزر.
14. انقر على أدوات | معايرة خلفية الأشعة تحت الحمراء | جديد. في النافذة حدد المنطقة الطيفية ذات الأهمية (1800-1200 سم^-1 لدراسة عينات البروتين)؛ اختيار نفس معدل النبض كما هو محدد في الخطوة 4.12 ودورة عمل بنسبة 5٪؛ انقر على اكتساب سريع وحدد سرعة الليزر، ومجموعة نموذجية لليزر تتالي الكم بين 20−500 سم^-1. انقر على الحصول على لقياس خلفية الليزر الأشعة تحت الحمراء. وسيستخدم هذا الطيف الضوئي لتطبيع الأطياف المحلية النانومترية المقاسة. أغلق النافذة.
    ملاحظة: في حالة عدم توفر وضع محسّن ليزر ورنين سريع، قم بتخطي الخطوة 4.12 وحدد الأطياف المخطوّفة بدلاً من السرعة في كل من الخلفية ونوافذ اكتساب أطياف الأشعة تحت الحمراء. ومع ذلك، لن يتم الوصول إلى حساسية تجميعية واحدة.
15. في إعدادات أطياف الأشعة تحت الحمراء، اختر دقة طيف الأشعة تحت الحمراء بين 1-4 سم^-1 وعدد من المتوسطات المشتركة التي لا تقل عن 64 x. انقر على الحصول على لقياس طيف الأشعة تحت الحمراء المترجمة نانوية في نطاق البروتين (1800-1200 سم^-1).
16. للحصول على خريطة كيميائية ذات مقياس نانوي، حدد خيار التصوير بالأشعة تحت الحمراء، واختر عدد الأمواج ذات الفائدة (على سبيل المثال، 1655 سم^-1 للشريط amid i) وانقر على المسح الضوئي في نافذة المسح الضوئي AFM.
17. بمجرد اكتمال التعيين، انتقل إلى ملف وحفظ القياسات. لتحليل الخرائط المكتسبة من مورفولوجيا، والاتصال بالرنين والكيمياء، فضلا عن الأطياف المحلية نانوية، استخدم المدمج في AFM برنامج معالجة الصور. يمكن حفظ Spectra والصور كملفات .csv أو .axz لمزيد من التحليل التفصيلي مع البرامج التجارية.

5 - معالجة الصور وتحليل الأبعاد الشاملة لعدة أقسام

1. تسطيح الصور الخام^{14،17،19،41،42،59} باستخدام المدمج في AFM برامج معالجة الصور أو البرامج التجارية.
   ملاحظة: ينبغي إخفاء المجاميع من الحساب لتجنب القطع الأثرية من التحليل والتقليل من تقدير ارتفاعها المقاس.
2. تسطيح الصورة بواسطة 0 ترتيب مستوى تناسب الطرح.
3. تسوية الصورة حسب المستوى ثم سطراً سطراً بترتيب تراجع^{1 st،} يتم تكرار الخطوة الثانية حتى يتم الوصول إلى خط الأساس المسطح في ملف تعريف سطر الصورة.
4. إذا كانت العينة مزدحمة جدا، ويحتوي على المجاميع عالية بشكل استثنائي أو الماسح الضوئي القوس التحف موجود، وتسطيح الصورة باستخدام 2^nd ترتيب الانحدار تناسب.
5. قياس الارتفاع الكلي والعرض من ملف تعريف خط مأخوذ عمودي إلى محور fibril^{14،17،19،41،42،59.}
6. قياس طول الفيبريل موازية للمحور الفيبريل^{14،17،19،41،42،59.}

النتائج

ويبين الشكل 1مسار زمني تمثيلي لتجميع Aβ42، مقيساً بـ "قياس الفلورة" (ThT) . تتميز عملية التجميع عادة بمنحنى السيني، حيث يتم ملاحظة مرحلة التأخر في البداية، ويليها مرحلة نمو حاد، قبل أن يصل المنحنى إلى هضبة عندما يتم الوصول إلى حالة توازن^{ثابتة6،7} <...

Discussion

الخطوة الحاسمة الأولى في هذا البروتوكول هي إعداد البروتينات الأحادية، كما هو الحال في حل Aβ42 الموضح في الخطوتين 1.1 و1.2. من الضروري الشروع في عملية التجميع من حل أحادي النضوس، حيث أن وجود الأنواع القلة أو المجمعة قد يؤدي إلى ضعف إمكانية استنساخ حركية التجميع^58،والحث على المصنوع?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM-IR system	Anasys Instruments	nanoIR 2 or 3	Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate	Corning	3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape	Corning	6570
Double Sided Adhesive Discs	AGAR Scientific	AGG3347N
FLUOstar Omega	BMG Labtech	415-101	Platereader
Mica Disc 10mm V1	AGAR Scientific	AGF7013
Park NX10 AFM system	Park Systems	N/A	Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips	Platypus Technologies	AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers	Park Systems	PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL	Eppendorf	30108132
Silicon gold coated cantilevers	Anasys Instruments	PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm	AGAR Scientific	AGF7001