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摘要

我们描述了红外纳米光谱学和高分辨率原子力显微镜的应用，将蛋白质自组装过程可视化为寡聚体和淀粉样纤维蛋白，这与发病和发展密切相关广泛的人类神经退行性疾病。

摘要

蛋白质误折叠和聚集的现象导致形成高度异质蛋白聚集体，这些聚合与神经退行性疾病（如阿尔茨海默氏症和帕金森病）相关。特别是低分子量聚合物，淀粉样寡聚物，已被证明具有一般细胞毒性，并被牵连为神经毒素在许多形式的痴呆症。我们说明了使用基于原子力显微镜（AFM）的方法，以解决这些骨料的形态、结构和化学特性的特性这一具有挑战性的任务，这些特性很难使用传统的结构来研究。方法或散装生物物理方法，因为它们的异质性和瞬态性。扫描探针显微镜方法现在能够研究淀粉样粒体具有亚纳米分辨率的形态。我们在这里表明，红外（IR）纳米光谱（AFM-IR），同时利用AFM的高分辨率和红外光谱的化学识别能力，可以更进一步，使个体的结构特性的表征蛋白质聚合，从而提供对聚合机制的见解。由于我们描述的方法也可以应用于研究蛋白质组件与小分子和抗体的相互作用，它可以提供基本信息，以开发新的治疗化合物来诊断或治疗神经退行性疾病。

引言

目前，全世界有超过4000万人受到神经退行性疾病的影响，如阿尔茨海默氏症（AD）1和帕金森氏症（PD）2型疾病。 更一般地，超过五十种病理学在分子水平上与蛋白质误折叠和聚集有关，这一过程导致不溶性纤维蛋白聚集物的增殖，称为淀粉样矿床3， 4.神经退化的分子起源及其与蛋白质形成蛋白的构象变化的联系，然而，仍然不清楚，这在很大程度上是由于异质性、瞬态性和纳米尺度的高水平病理聚合体4，5的尺寸。

在过去的几十年中，蛋白质结构的研究非常成功，广泛基于批量方法的使用，包括X射线晶体学、低温电子显微镜和核磁共振光谱学5，6,7,8,9.在这类技术中，红外（IR）光谱技术已成为一种敏感的分析工具，可以揭示蛋白质8等生物系统的化学性质。红外方法允许在蛋白质误折叠和聚合期间对蛋白质二次和四元结构进行定量。此外，为了在微观层面上进一步破译蛋白质聚合过程中复杂的自由能量景观所涉及的机械细节，一个重大进展是开发化学动力学工具，以扩展到复杂的自组装途径包括淀粉样纤维蛋白形成5，6，7，10，11，12。然而，散装光谱方法只提供关于溶液中存在的物种的异质组合或涉及特定微观步骤的平均信息，从而对个体的生物物理特性进行了调查在纳米级13、14级挑战的聚合物种。

在过去的几十年中，出现了几种显微镜技术，其操作能力小于光的衍射极限。此类方法包括电子显微镜 （EM） 和原子力显微镜 （AFM）。扫描电子显微镜 （SEM） 和传输电子显微镜 （TEM） 提供标本的二维 （2D） 图像，而 AFM 在过去几十年中已成为一种功能强大且用途广泛的技术，用于研究三维 （3D） 形态，如以及亚纳米分辨率13、14、15、16、17、18、19的样品的纳米力学特性。20,21,22,23,24,25,26,27.研究通过AFM的蛋白质聚集的理由是，这种方法能够研究溶液13、14、16中个别物种的形态。 17，19，20，21，25，27，28，29，30 31，32，33，34，35，36，37。特别是，通过监测样本作为时间的函数，AFM允许调查样本内物种形态的演变，从而能够跟踪和可视化淀粉样蛋白形成的途径23。 25，38，39，40，41，42。此外，AFM 能够量化结构参数，如溶液13、19、30、31中存在的单个物种的横截面高度和长度 ，32，33，34，35，36，37，40，43，44,45,46,47,48.然而，在研究异质和复杂的生物系统时，对单一生物物理特性的研究，例如形态学，往往是不够的。AFM、SEM 或 TEM 成像方法本身并不能轻易揭示纳米尺度上异构淀粉样聚合体的化学性质。

随着红外纳米光谱（AFM-IR）24、26、24、26、24、26 、24、26 、24、26、24、26、26 、26 、26 、26 、26 、26 、26 、26、26、24、24、26、24、26、26、26、24、26、26、24、26、26、24、26、24、26、26、24、26、24、26、26、26、24、26号蛋白质聚集领域的开发 38，42，49，50，51，52.这种创新方法利用了AFM（±1~10nm）的空间分辨率与红外化学分析能力的结合。AFM-IR 技术基于红外激光驱动的光热感应共振效应的测量，以及 AFM 尖端所调查样品的热膨胀的测量。样品可以直接由红外激光从顶部或底部在总内部反射中照亮，类似于传统的红外光谱24、42、52、53.红外激光器的典型频率可按数百千赫（1~1000 kHz）的顺序进行脉冲，并在宽光谱范围内进行调谐，通常在1000~3300厘米-1之间。虽然激光源的直径为 ±30 μm，但 AFM-IR 技术的空间分辨率名义上由 AFM 尖端直径确定，该直径可检测系统的局部热膨胀。AFM-IR 非常适合研究生物样品，因为红外信号与其厚度成正比，高达 1~1.5 μm，并且生成的红外光谱通常与相应的 FTIR 透射光谱13、54 一致 ， 55.因此，在光谱学中可以容易地应用既定的分析方法，例如通过第二导数分析研究化学变化、带形变化和去卷积。总体而言，AFM 的空间分辨率与红外光谱的化学识别能力相结合，使样品能够在纳米尺度上同时采集各种形态、机械和化学特性。

在这里，我们演示了蛋白质聚合过程的表征方案，该协议利用体外荧光测定、高分辨率 AFM 成像和纳米级 AFM-IR 的组合。这种组合方法在研究蛋白质聚合形成的单个微液滴的化学和结构特性、液-液蛋白相分离的研究以及在纳米尺度23、26、38、45、50、53， 56，57.

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研究方案

1. 荧光板读取器上的聚合测定

注:此处描述的协议是如何通过化学动力学研究任何蛋白质或肽的聚合的示例。特别是，它描述了一个优化的协议，以研究A+42肽的聚合，它参与阿尔茨海默氏病的发病和进展58，59。类似的方案可以调整和采用，以研究任何蛋白质或肽的聚合。

  1. 通过电离交换和大小排除色谱技术获得A+42的超纯单体溶液，以区分含有A+42的蛋白质成分，并将单体部分与其他A+42聚合形式分离为58,59.
  2. 在 20 mM 磷酸钠缓冲液中稀释 A+42 肽，在 pH 8.058时将 200 μM EDTA 稀释至 1.5 mL 低结合管中所需的最终浓度范围为 1⁄5 μM。为 AFM 测量收集的样品不应包含聚合测定中使用的荧光染料（Thioflavin T、ThT），因为它可能在 AFM 分析的样品沉积过程中引入人工制品。因此，准备两个相同溶液的三元数:i） 第一个包含单体 A+42 的 AFM 遵循聚合过程;ii） 包含 A_42 单体的第二个，添加 20 μM ThT 作为示踪剂来监测聚合的动力学。
    注: 在冰上执行步骤 1.1 和 1.2 非常重要。此过程是为了确保单体 A_42 溶液在板读器中启动之前不会聚合。处理样品时，小心移液对于避免引入可能影响蛋白质样品的任何气泡至关重要。
  3. 每个孔中每个样品的移液器 80 μL，每个样品的 96 孔半区域板为黑色聚苯乙烯，底部为透明且不结合的表面。
  4. 用箔片密封板，以尽量减少样品在聚集过程中的蒸发。
  5. 将板式读取器的温度平衡到 37°C。
  6. 设置聚合协议，以固定时间点间隔读取荧光测量，激发波长为 440 nm，发射波长为 480 nm。聚合应在静止条件下启动。
  7. 将板插入板读取器。
    注: 处理板时必须小心，以确保在启动板读取器之前不会触发聚合。使用增益调整设置确保每个样品的荧光得到最佳读出。
  8. 开始测量。
    注:当ThT荧光sigmoidal曲线达到58的高原时，聚合实验结束。

2. AFM 和纳米红外测量的样品制备

  1. 使用粘合卡舌或双面胶带将最高质量的 V1 云母盘粘附到高品质磁性不锈钢光盘中。
  2. 将一块胶带放在云母表面并拉出云母的顶层，蚀刻云母。此过程将产生清洁、原子平坦的表面，适合样品沉积。
    注:蚀刻表面必须均匀光滑。
    注意:不要触摸或呼吸正上方新鲜蚀刻的云母，因为这将引入人工制品。
  3. 暂停/停止板读取器测量，以收集蛋白质聚合过程中的时间点。
  4. 取出密封箔，将10 μL无ThT的样品从井中收集到1.5 mL低粘结管中。
  5. 将样品的 10 μL 沉积在刚蚀刻的云母上。对于 AFM-IR 测量，样品必须沉积在刚剥离的黄金基板上。
  6. 在云母上孵育溶液1分钟，以便进行物理治疗。
    注:较长的孵育时间可以更好地吸收表面，但可能诱导人工自组织和自组装25。为了避免这些影响，喷雾沉积可能被利用25。
  7. 用1 mL的超纯水冲洗三次。
  8. 在温和的氮气流下干燥，以测量空气环境中的样品。

3. 蛋白质聚合形态的AFM成像

注: 形态测量可以在接触和动态模式下执行，在以下步骤中，描述后者，因为它减少了横向力，以高分辨率测量样品的 3D 形态。AFM-IR 测量将在接触模式下执行，以提高 AFM-IR 信噪比。

  1. 在测量前至少 30 分钟打开 AFM 系统，以使系统达到热稳定性。单击"设置"，然后单击"探测"。在"探测更改"窗口中，单击"下一步"准备Z，对焦阶段。
  2. 关闭 AFM 光束开关（如果打开）。解锁尾锁，断开头部与系统的连接，并在"探测更改"窗口中单击"下一步"。
  3. 将 AFM 悬臂安装在探头支架上。将头连接到系统并锁定尾部锁。
    注:在动态模式下研究生物样品的最佳吊臂具有2~40 Nm-1和2~8 nm14之间的顶半径差。
  4. 打开 AFM 激光束开关，在探头更改窗口中单击"下一步"。
  5. 在弹出窗口中，如果悬臂类型未更改，请单击"否"。调整光学定位旋钮以查找悬臂。将焦点调整到悬臂上，然后单击"下一步"。
  6. 在弹出窗口中，如果焦点位于悬臂上，请单击"是"。
  7. 使用控制检测激光器的旋钮将激光束置于悬臂末端。使用控制位置敏感光电二极管 （PSPD） 上偏转激光束位置的旋钮，将四象限光电二极管测量的总信号最大化至至少 >1 V。在"探测更改"窗口中单击"下一步"，然后单击"关闭"。
  8. 等待 15 分钟，使悬臂达到热稳定性。如有必要，调整偏转激光束在 PSPD 上的位置。
  9. 单击NCM SWEEP，选择所需的振荡振幅，单击"使用相位"，单击自动，并调整悬臂接近其第一次自由共振振荡的最大值，该振荡约为 300 kHz悬臂的弹簧常数为40 Nm-1。
    注:将悬臂调出其自由共振的最大最大值可确保测量值14的更高稳定性。
  10. 将样品放在样品架上。选择合适的成像参数。对于 1 x 1 μm2到 5 x 5 μm2的扫描区域，典型扫描速率为 0.3±1.0 Hz。所需的典型分辨率介于 256 x 256 和 1024 x 1024 像素之间。单击"扫描区域"以选择扫描大小和像素数。
  11. 将光学视图聚焦在样品上。单击"接近"以接近样本表面。接近完成后，单击提升100 μm将 AFM 尖端升高到样品表面上方 100 μm。单击"展开"样本的光学图像。单击"焦点阶段"栏将视图聚焦在示例表面。
  12. 使用箭头在感兴趣示例的区域中移动。按下"接近"按钮，使表面接合。单击"线扫描"按钮，并检查笔尖是否很好地跟随表面，如有必要，调整设定点。
  13. 按"扫描"按钮开始对样品表面进行成像。在成像过程中，为了避免大的成像力并保持独立样品内的一致性，保持不超过[20°42]的相变的恒定状态。
  14. 输入文件名并选择将保存获取图像的基本目录。

4. 蛋白质聚合体的红外纳米光谱测量

  1. 在测量热稳定性之前，请打开 AFM-IR 系统和红外 （IR） 激光60 30–60 分钟。AFM-IR 仪器的典型激光器是光学参数振荡器 （OPO） 和量子级联激光器 （QCL）。
  2. 打开内置软件来控制仪器。单击文件，然后打开新文件以打开新的nanoIR文件。按初始按钮启动 AFM-IR 系统。
  3. 打开仪器盖并将其安装在 AFM-IR 系统上，将一个标称半径为 30 nm、弹簧常数为 0.2 N/m的硅镀金探头安装在 AFM-IR 系统上，以在接触模式下测量样品。
  4. 单击AFM 探测部分中的"加载"，然后单击下一个。在聚焦探头部分时，单击箭头将相机聚焦在悬臂上。在部分示例 XY 运动中，使用箭头将交叉空气置于悬臂的末端。
  5. 旋转控制检测激光位置的旋钮，将激光定位在悬臂末端。旋转激光旋钮以检测四象限光电二极管测量的总和并将其最大化到值 >3 V. 旋转偏转旋钮以将悬臂偏转调整到 -1 V，然后单击下一个。关闭仪器盖。
  6. 在"对示例的聚焦"部分中，使用箭头将相机聚焦在样本上。然后，在部分示例 XY 移动中使用箭头在示例感兴趣的区域中移动，然后单击方法并参与。
  7. 在显微镜窗口中选择作为输入感兴趣的通道来映射样品的生物物理特性。特别是，选择形态高度，振幅2为红外吸收，PLL频率图尖样品接触共振。
  8. 在控件窗口的AFM 扫描部分中，使用与第 3 节类似的参数（即扫描速率 0.1±1.0 Hz，介于 256 x 256 和 1024 x 1024 像素之间）。根据样本粗糙度选择增益值:积分 I = 1⁄10，比例 P = 10*30。然后，单击扫描以获取形态图。
    注: 在动态攻丝模式下，形态可以类似地测量，但 AFM-IR 测量在接触模式下执行，以具有较高的信噪比。
  9. 形态图绘制完成后，在显微镜窗口中，单击高度图将探头放置在一个聚合的顶部。然后在控制窗口的纳米IR部分，单击启动IR以用红外激光照亮样品。
  10. 要将红外激光聚焦在悬臂上，请单击优化。在此窗口中，写入一个波号，其中样本将具有高吸收度，然后单击"添加"。对于蛋白质，典型值为1655厘米-1。单击扫描以查找红外激光位置，然后单击更新以将其位置与悬臂对齐。关闭窗口。
  11. 在纳米红外设置的一般部分中，在相对字段中需要高吸收度的地方写入波数。然后，停用带通滤波器选项，查看仪表读数和悬臂响应的快速傅立叶变换 （FFT）。在 FFT 窗口中，移动绿色光标以读取悬臂的谐振频率。悬臂共振的FFT的典型值约为300 kHz。在freq. 中心场的一般部分中写入此谐振频率值，并使用 50 kHz 的freq. 窗口。
    注:选择足够低的激光功率，使仪表读数不饱和，使悬臂响应失真，且样品不会过热。
  12. 单击激光脉冲调谐窗口以使用谐振增强模式。选择 300 kHz 的频率中心、50 kHz 的调谐范围和 5% 的激光占空比。点击获取以扫描激光的脉冲速率。通过使用图中的光标，将激光脉冲调谐到吸收红外光的样品热膨胀的机械响应频率。然后，选择选项 PLL 以监控样品和尖端之间的接触共振。按 PLL 窗口中的零按钮，勾选启用以跟踪采样尖端触点谐振。选择积分增益 I = 0.5，按比例增益 P = 10。关闭窗口。
  13. 再次打开优化窗口，找到红外激光器的位置，找到至少3个波数的位置，这些波数对应于样品的主要吸光带（酰石带I-II-III），以及激光的每个芯片至少一个波数。
  14. 点击工具|红外背景校准|新建.在窗口中选择感兴趣的光谱区域（1800~1200cm-1来研究蛋白质样品）;选择步骤 4.12 中确定的相同脉冲速率和 5% 的占空比;点击快速采集并选择激光速度，量子级联激光的典型范围在20~500厘米-1之间。点击采集以测量红外激光背景。该背景光谱将用于测量的纳米尺度局部光谱的规范化。关闭窗口。
    注: 如果快速激光和谐振增强模式不可用，请跳过步骤 4.12，在背景和红外光谱采集窗口中选择阶梯光谱而不是快速。但是，不会达到单个聚合灵敏度。
  15. 在红外光谱设置中，选择 1⁄4cm-1之间的红外光谱分辨率和至少 64 倍的共同平均值。点击采集，测量蛋白质范围内的纳米级局部红外光谱（1800~1200cm-1）。
  16. 要获取纳米级解析化学图，请选择红外成像选项，选择感兴趣的波数（例如，1655cm-1用于胺带 I），然后单击AFM 扫描窗口中的扫描。
  17. 映射完成后，转到文件并保存测量值。要分析获得的形态图、接触共振和化学图以及纳米级局部光谱，请使用内置的AFM图像处理软件。光谱和图像可以保存为 .csv 或 .axz 文件，以便使用商业软件进行进一步的详细分析。

5. 横截面尺寸的图像处理与分析

  1. 使用内置的AFM图像处理软件或商业软件拼合原始图像14，17，19，41，42，59。
    注: 应从计算中屏蔽聚合体，以避免分析伪影和低估其测量高度。
  2. 将图像拼平 0 阶平面适合减法。
  3. 以平面平展图像，然后按 1级回归顺序逐行平展图像，重复第二步，直到达到图像线轮廓中的平面基线。
  4. 如果样本非常拥挤，包含非常高的聚合体或存在扫描仪弓形艺术品，则使用第 2个回归顺序拟合将图像拼平。
  5. 从垂直于纤维轴14、17、19、41、42、59的线轮廓测量聚合高度和宽度。
  6. 测量与纤维轴14、17、19、41、42、59平行的纤维长度。

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结果

A_42聚合的代表性时间过程，由ThT荧光测定测量，如图1所示。聚合过程通常以 sigmoidal 曲线为特征，其中最初观察到滞后阶段，然后是陡峭的生长阶段，在达到平衡稳定状态达到6、7时曲线达到稳定状态之前,58.必须确保使用优化的聚合协议来生成高质量的数据，以研究与聚合过程有关的分子细节

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讨论

该协议的第一个关键步骤是制备单体蛋白，如步骤1.1和1.2中描述的A_42溶液。从高度纯、单一的溶液启动聚合过程至关重要，因为寡头或聚合物种的存在可能导致聚合动力学58的可重复性差，并诱导 AFM 中的人工制品测量（例如，纤维素物种在聚集的初始阶段将明显），这可能导致对数据的误解。基于ThT荧光测定的淀粉样形成的高度可重复动力学数据，与化学动力学5、6、7...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

作者感谢瑞士国家科学基金会（SNF）的财政支持（赠款号P2ELP2_162116和P300P2_171219），达尔文学院，伊拉斯谟®计划的财政支持（赠款号2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3）和导致这些结果的研究通过ERC赠款PhysProt（协议号337969）、纽曼基金会（T.P.J.K.）和剑桥错折疾病中心（C.G.、M.V.和T.P.J.K.）。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
AFM-IR systemAnasys InstrumentsnanoIR 2 or 3Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS MicroplateCorning3881
Corning Microplate Aluminium Sealing TapeCorning6570
Double Sided Adhesive DiscsAGAR ScientificAGG3347N
FLUOstar OmegaBMG Labtech415-101Platereader
Mica Disc 10mm V1AGAR ScientificAGF7013
Park NX10 AFM systemPark SystemsN/AAtomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold ChipsPlatypus TechnologiesAU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantileversPark SystemsPPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mLEppendorf30108132
Silicon gold coated cantileversAnasys InstrumentsPR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mmAGAR ScientificAGF7001

参考文献

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