JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

赤外線ナノ分光法と高分解能原子間近顕微鏡の応用を用いて、タンパク質自己組織化のプロセスをオリゴメラ凝集体とアミロイド線維に可視化し、発症と発達に密接に関連している。ヒト神経変性疾患の広い範囲の。

要約

タンパク質の誤折と凝集の現象は、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性状態に関連する高度に異種タンパク質凝集体の形成をもたらします。特に低分子量凝集体は、アミロイドオリゴマーが、一般的な細胞傷害性を有することが示されており、認知症の多くの形態において神経毒として関与している。原子間力顕微鏡(AFM)に基づく方法を用いて、従来の構造を用いて研究が困難なこれらの集合体の形態的、構造的、化学的特性を特徴付けるという困難な課題に取り組む方法を示す。その不均一性と一過性の性質のために、方法またはバルク生物物理学的方法。スキャンプローブ顕微鏡アプローチは、サブナノメートル分解能を持つアミロイド凝集体の形態を調製できるようになりました。ここでは、AFMの高分解能とIR分光法の化学認識力を同時に利用する赤外線(IR)ナノ分光法(AFM-IR)が、個々の構造特性の特性をさらに高め、特性の特性を高めることができることを示します。タンパク質凝集体を提供し、集約メカニズムに関する洞察を提供します。我々が説明するアプローチは、低分子および抗体とのタンパク質アセンブリの相互作用の調査にも適用することができるので、診断または治療するための新しい治療化合物を開発するための基本的な情報を提供することができます神経変性疾患。

概要

現在、世界中で4,000万人以上の人々が、アルツハイマー病(AD)1やパーキンソン病(PD)2疾患などの神経変性疾患の影響を受けています。より一般的には、50以上の病理がタンパク質の誤折と凝集と分子レベルで関連しており、アミロイド沈着物として知られる不溶性線維性タンパク質凝集体の増殖につながるプロセス、 4.神経変性の分子起源とアミロイド形成につながるタンパク質のタンパク質立体構造変化との関連は、しかし、不均一性、一過性、ナノスケールの高いレベルのために、大部分は不明のままである。病理学的凝集体の次元4、5。

過去数十年のタンパク質構造の非常に成功した調査は、X線結晶学、クライオ電子顕微鏡および核磁気共鳴分光法5を含むバルク法の使用に広く基づいている。6,7,8,9.このクラスの技術の中で、赤外線(IR)分光法は、タンパク質8などの生物学的システムの化学的特性を解明するための敏感な分析ツールとして出現した。IR法は、タンパク質の二次的および四次構造変化の定量化を可能にします。さらに、凝集中のタンパク質の複雑な自由エネルギー景観に関与する機械的詳細を顕微鏡レベルでさらに解読するために、複雑にまで広がる化学運動学ツールの開発が大きな進歩を遂げました。アミロイド線維形成5、6、7、10、11、12を含む自己組み立て経路。しかし、バルク分光法は、溶液中に存在する種の異種アンサンブルに関する平均的な情報のみを提供し、特定の顕微鏡ステップに関与しているため、個々の生物物理学的特性の調査を行うナノスケールレベル13、14で挑戦する集約種。

光の回折限界よりも小さいスケールで動作する能力を持ついくつかの顕微鏡検査技術は、過去数十年で出現しています。このクラスの方法には、電子顕微鏡(EM)および原子間力顕微鏡(AFM)が含まれる。走査電子顕微鏡(SEM)と透過電子顕微鏡(TEM)は標本の2次元(2D)画像を提供する一方で、AFMは過去数十年にわたり、3次元(3D)形態を研究するための強力で汎用性の高い技術として登場しました。サブナノメートル分解能13、14、15、16、17、18、19、サンプルのナノ機械的特性と同様に、 20歳,21歳,22歳,23歳,24歳,25名,26歳,27.AFMを介してタンパク質凝集を研究する背後にある根拠は、このアプローチは、溶液13,14,16に存在する個々の種の形態の調査を可能にする、 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37.特に、時間の関数としてサンプルをモニタリングすることにより、AFMは、サンプル内の種の形態の進化の調査を可能にし、アミロイド形成23の経路を追従および可視化することを可能にする。 25,38,39,40,41,42.さらに、AFMは、溶液13、19、30、31に存在する個々の種の断面高さおよび長さなどの構造パラメータの定量を可能にする ,32,33,34,35,36,37,40,43,44歳,45歳,46歳,47歳,48.しかし、形態学のような単一の生物物理学的性質の研究は、多くの場合、異種および複雑な生物学的システムを研究する際に十分ではない。AFM、SEMまたはTEMイメージング法だけでは、ナノスケールでのアミロイド凝集体の異種種の化学的特性を容易に明らかにしない。

この規模での異種生体試料の解析に大きな進歩が見られ、最近では、赤外線ナノ分光法(AFM-IR)24,26のタンパク質凝集分野への応用が進み、 38,42,49,50,51,52.この革新的な方法は、AFM(~1−10nm)の空間分解能とIRの化学分析力の組み合わせを利用します。AFM-IR技術は、IRレーザーによって駆動される光熱誘導共鳴効果の測定と、AFM先端によって調査中のサンプルの熱膨張の測定に基づいています。サンプルは、従来の赤外線分光法24、42、52、53と同様に、全体的な内部反射で上から直接または下からIRレーザーによって照射することができる.IRレーザーは数百キロヘルツ(1−1000 kHz)の順序で典型的な周波数で脈打ち、広いスペクトル範囲、典型的には1000−3300 cm-1の間で調整することができる。レーザー光源は直径約30μmの面積をカバーしますが、AFM-IR技術の空間分解能は、システムの局所的な熱膨張を検出するAFM先端径によって公称的に決定されます。AFM-IRは、IR信号が1−1.5 μmまでの厚さに比例し、得られるIRスペクトルは一般的に対応するFTIR透過スペクトル13、54と一致しているため、生物学的サンプルの研究に適しています。 、55.このため、分光法における確立された分析方法は、化学シフトの研究、バンド形状変化および第2誘導体分析による非畳み込み52の研究など容易に適用することができる。全体的に、AFMの空間分解能とIR分光法の化学認識力を組み合わせることで、AFM-IRはナノスケールでのサンプルの形態的、機械的、化学的特性の広い範囲の同時取得を可能にします。

ここでは、インビトロ蛍光アッセイ、高分解能AFMイメージングおよびナノスケールAFM-IRの組み合わせを利用するタンパク質凝集プロセスの特性評価のためのプロトコルを例示する。この組み合わせアプローチは、タンパク質凝集体によって形成された個々のマイクロ液滴の化学的および構造的特性の研究、液体液タンパク質相分離の研究において、およびナノスケール23、26、38、45、50、53における個々の凝集種の不均一性および生物物理学的特性を調べている 56、57。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

1. 蛍光プレートリーダーの凝集アッセイ

注:ここで説明するプロトコルは、化学動態によるタンパク質またはペプチドの凝集を研究する方法の一例です。特に、アルツハイマー病58、59の発症および進行に関与するAβ42ペプチドの凝集を研究するために最適化されたプロトコルを記述する。同様のプロトコルは、任意のタンパク質またはペプチドの凝集を研究する方に調整および採用することができる。

  1. イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィー技術を介してAβ42の非常に純粋なモノマー溶液を得て、Aβ42を含むタンパク質画分を区別し、単量体画をAβ42の他の凝集形態から分離する58を得た。,59.
  2. 20 mMリン酸ナトリウムバッファーでAβ42ペプチドを希釈し、pH 8.058で200 μM EDTAを1−5 μMの間の所望の最終濃度に、1.5 mLの低結合チューブで希釈する。AFM測定用に収集されたサンプルには、AFM分析用のサンプル堆積時にアーティファクトが導入される可能性があるため、凝集アッセイに使用される蛍光色素(チオブラビンT、ThT)を含めるべきではありません。したがって、2つの同一の溶液の三量三角形を準備する:i)AFMによる凝集のプロセスに従うモノメリックAβ42を含む最初の;ii)凝集の動態を監視するトレーサーとして20μM ThTを添加したAβ42モノマーを含有する第2。
    注: 氷の上で手順 1.1 と 1.2 を実行することが重要です。この手順は、単調なAβ42溶液がプレートリーダーで開始されるまで凝集しないことを確実にする。サンプルを取り扱う場合、タンパク質サンプルに影響を与える可能性のある気泡の導入を避けるためには、慎重なピペッティングが不可欠です。
  3. 明確な底面および非結合表面を持つ黒いポリスチレンの96ウェル、半面積プレートの各ウェルの各サンプルのピペット80 μL。
  4. 凝集の過程でサンプルの蒸発を最小限に抑えるために、ホイルでプレートを密封します。
  5. プレートリーダーの温度を37°Cに平衡化します。
  6. 440 nm の励起波長と 480 nm の発光波長で、一定の時間間隔で蛍光測定値を読み取る集約プロトコルを設定します。集約は静止状態で開始する必要があります。
  7. プレートリーダーにプレートを挿入します。
    注: プレートリーダーを起動する前に集約がトリガされないように、プレートの取り扱い時には注意が必要です。ゲイン調整設定を使用して、各サンプルの蛍光を最適に読み出します。
  8. 測定を開始します。
    注:集約実験は、ThT蛍光シグモイド曲線が高原58に達したときに終了する。

2. AFMおよびナノIR測定用のサンプル調製

  1. 接着剤のタブまたは両面テープを使用して高品質の磁気ステンレス鋼ディスクに最高品質のグレードのV1マイカディスクを接着します。
  2. 粘着テープをマイカ表面に置き、マイカの最上層を引っ張り出すことで、エッチマイカを取り出します。この手順は、サンプル堆積に適した、クリーンで原子的に平らな表面を生成します。
    注: エッチングサーフェスは均一で滑らかでなければなりません。
    注意:これはアーティファクトを導入しますので、新たにエッチングされたマイカの上に直接触れたり、呼吸したりしないでください。
  3. プレートリーダー測定を一時停止/停止し、タンパク質の凝集プロセス中に対象となる時間ポイントを収集します。
  4. シールホイルを取り外し、TTを除くサンプルの10 μLアリコートをウェルから1.5 mLの低結合チューブに集えます。
  5. 新鮮にエッチングされたマイカにサンプルの10 μLを堆積します。AFM-IR測定用サンプルは、新たに取り除かれた金基板に堆積する必要があります。
  6. マイカ上の溶液を1分間インキュベートして、生理を可能にする。
    注:より長いインキュベーション時間は、表面上のより良い吸収を可能にするが、人工的な自己組織化と自己組み立て25を誘発する可能性があります。これらの影響を避けるために、スプレー堆積は25を利用することができる。
  7. 1mLの超純水で3回すすいでください。
  8. 窒素の穏やかな流れの下で乾燥し、空気中のサンプルを測定します。

3. タンパク質凝集体の形態のAFMイメージング

注:形態測定は接触モードと動的モードの両方で行うことができ、次のステップでは、サンプルの3D形態を高解像度で測定する横力を減少させるため、後者について説明する。AFM-IR測定は、AFM-IR信号対雑音比を高めるために接触モードで行われます。

  1. 測定の30分前にAFMシステムの電源を入れ、システムが熱安定性に達できるようにします。[セットアップ]をクリックし、[プローブ]をクリックします。[プローブ変更]ウィンドウで[次へ]をクリックしてZ を準備します。
  2. AFM ビーム スイッチをオフにします(オンの場合)。鳩尾ロックのロックを解除し、システムから頭部を切断し、プローブ変更ウィンドウで[次へ]をクリックします。
  3. プローブホルダーにAFM片持ち式を取り付けます。頭部をシステムに接続し、鳩尾ロックをロックします。
    注:動的モードAFMで生物学的サンプルを研究するための最適片持ちは、2−40 N m-1と2−8 nm14の間の頂点半径の間のスプリング定数を持っています。
  4. AFMレーザービームスイッチをオンにし、プローブ変更ウィンドウで[次へ]をクリックします。
  5. ポップアップウィンドウで、片持ち型が変わらない場合は[いいえ]をクリックします。光学アライメントノブを調整して片持ちを見つけます。片持ちにフォーカスを調整し、[次へ]をクリックします。
  6. ポップアップウィンドウで、フォーカスが片持ち上げの場合は[はい]をクリックします。
  7. 検出レーザーのノブ制御位置を使用して、片持ち端の端にレーザー光を配置します。4象限フォトダイオードで測定した総信号を、位置感受性光ダイオード(PSPD)上の偏向レーザー光線の位置を制御するノブを使用して、少なくとも>1 Vまで最大化する。[プローブの変更]ウィンドウで [次へ] をクリックし、[閉じる]をクリックします。
  8. 片持ちが熱安定性に達するまで15分待ちます。必要に応じて、PSPD上の偏向レーザービームの位置を調整します。
  9. NCM SWEEPをクリックし、発振の所望の振幅を選択し、[使用フェーズ]をクリックし、自動をクリックし、振動の最初の自由な共振の最大値に近い片持ちを調整します。40 N m-1のばね定数を持つ片持ち。
    注:自由な共鳴の最大値から片持ち式をチューニングすると、測定値14の安定性が向上します。
  10. サンプルホルダーにサンプルを置きます。適切なイメージング パラメータを選択します。一般的なスキャンレートは、1 x 1 μm2 ~ 5 x 5 μm2のスキャン領域で 0.3~1.0 Hz です。一般的な解像度は 256 x 256 ~ 1024 x 1024 ピクセルです。[スキャン領域]をクリックして、スキャン サイズとピクセル番号を選択します。
  11. サンプルに光学ビューを集中します。[アプローチ]をクリックしてサンプル サーフェスに近づきます。アプローチが完了したら、リフト100 μmをクリックして、サンプルの表面の上にAFM先端100 μmを上昇させます。サンプルの光学画像を[展開]をクリックします。フォーカスステージバーをクリックすると、サンプルの表面にビューがフォーカスされます。
  12. 矢印を使用して、対象のサンプルの領域内を移動します。アプローチボタンを押して表面を係合します。[ライン スキャン]ボタンをクリックし、必要に応じて先端がサーフェスによく従っているかどうかを確認します。
  13. スキャンボタンを押してサンプル表面のイメージングを開始します。イメージング中、大きなイメージング力を回避し、独立したサンプル内の一貫性を保つために、Δ20°42を超えない相変化の一定の体制を維持する。
  14. ファイル名を入力し、取得したイメージが保存される基本ディレクトリを選択します。

4. タンパク質凝集体の赤外線ナノ分光測定測定

  1. 熱安定化の測定の前に、AFM-IRシステムと赤外線(IR)レーザー60 30−60分をオンにします。AFM-IR計測器の代表的なレーザーは、光学パラメータ発振器(OPO)と量子カスケードレーザ(QCL)です。
  2. 内蔵ソフトウェアを開き、計測器を制御します。ファイルをクリックし、新しいnanoIRファイルを開くためにnewをクリックします。ボタンの初期化を押して、AFM-IR システムを起動します。
  3. 器械カバーを開き、AFM-IRシステムに30 nmの公称半径および0.2 N/mのばね定数のシリコン金コーティングされた調査を取付け、接触モードでサンプルを測定する。
  4. セクションAFM プローブの[ロード]をクリックし、次に .プローブセクションに焦点を当てて、片持ち式にカメラを集中させるために矢印をクリックします。セクションサンプルXYムーブメントでは、矢印を使用して片持ちの端にクロスエアーを配置します。
  5. 検出レーザーの位置を制御するノブを回転させ、片持ち端にレーザーを配置します。レーザーノブを回転させて、4象限フォトダイオードで測定された合計を値>3 V に回転させ、片持ち偏向を-1 V に調整し、次にクリックします。器械のカバーを閉じる。
  6. セクションでは、サンプルに焦点を当てて、サンプルにカメラを焦点を合わせるために矢印を使用します。次に、セクションサンプルでXYの動きは、サンプルの対象領域に移動し、アプローチをクリックして従事する矢印を使用します。
  7. 顕微鏡ウィンドウでは、サンプルの生物物理学的特性をマッピングするために目的のチャネルを入力として選択します。特に、形態の高さを選択し、IR 吸収の振幅 2とPLL 周波数を選択して、先端サンプル接触共鳴をマッピングします。
  8. コントロールウィンドウのAFM スキャンセクションでは、セクション 3 と同様のパラメータを使用します (つまり、スキャン レート 0.1−1.0 Hz、256 x 256 x 1024 x 1024 ピクセル)。サンプル粗さに従ってゲインの値として選択します: 積分 I = 1−10 と比例 P = 10−30.次に、スキャンをクリックして形態マップを取得します。
    注:形態はダイナミックタッピングモードでも同様に測定できますが、AFM-IR測定はコンタクトモードで行われ、信号対雑音比が高くなります。
  9. 形態のマッピングが完了したら、顕微鏡ウィンドウで、高さマップをクリックして、プローブを1つの集合体の上部に配置します。次に、コントロールウィンドウのnanoIRセクションで、開始IRをクリックして、IRレーザーでサンプルを照らします。
  10. 赤外レーザーを片持ちに合わせるには、最適化をクリックします。このウィンドウで、サンプルの吸光度が高いウェーブナンバーを書き込み、[add を追加]をクリックします。タンパク質の場合、一般的な値は 1655 cm-1です。スキャンをクリックしてIRレーザー位置を見つけ、更新をクリックして片持ちでその位置を整列します。ウィンドウを閉じます。
  11. nanoIR設定のセクション一般部では、相対界の高い吸光度が予想される波数を書き込む。次に、バンドパスフィルタオプションを無効にし、メーターの読み取り値と片持ち応答の高速フーリエ変換(FFT)を見ます。FFT ウィンドウで緑色のカーソルを移動して、片持ちの共振周波数を読み取ります。片持ちの共振のFFTの典型的な値は約300 kHzです。この共振周波数値をfreq. centerフィールドの一般的なセクションに書き込み、50 kHz のfreq. ウィンドウを使用します。
    注:メーターの読み取り値を飽和させず、片持ち応答に歪みを持ち、サンプルを過熱しないように十分に低いレーザーパワーを選択します。
  12. 共振強化モードを使用するには、レーザーパルスチューンウィンドウをクリックします。300 kHzの周波数センター、50 kHzのチューンレンジ、5%のレーザーのデューティサイクルを選択します。レーザーの脈拍数を掃引するために取得をクリックします。グラフ内のカーソルを使用して、レーザーパルスをIR光を吸収する試料の熱膨張の機械的応答の周波数に調整する。次に、オプション PLL を選択して、サンプルと先端の間の接触共鳴を監視します。PLLウィンドウのゼロボタンを押すと、チェックを入れ、サンプルチップ接触の共振を追跡できます。積分ゲイン I = 0.5 と比例ゲイン P = 10 を選択します。ウィンドウを閉じます。
  13. 最適化ウィンドウをもう一度開き、サンプルの主要な吸光バンド(アミドバンドI-II-III)に対応する少なくとも3つの波数のIRレーザーの位置と、レーザーの各チップに対して少なくとも1つの波数を見つけます。
  14. ツールをクリック |IR背景校正|新しい.ウィンドウで目的の分光領域を選択します (1800−1200 cm-1タンパク質サンプルを研究する);ステップ4.12で決定したのと同じ脈拍数を選択し、デューティサイクルを5%にします。高速取得をクリックしてレーザー速度を選択し、量子カスケードレーザーの典型的な範囲は20−500 cm-1の間です。取得をクリックして、IRレーザーの背景を測定します。この背景スペクトルは、測定されたナノスケール局所スペクトルの正規化に使用されます。ウィンドウを閉じます。
    注:高速レーザーと共振強化モードが使用できない場合は、ステップ4.12をスキップし、バックグラウンドとIRスペクトル集録ウィンドウの両方で高速ではなくステップスペクトルを選択します。ただし、単一の集約感度に達しません。
  15. IRスペクトル設定で、1-4 cm-1と少なくとも 64 倍の共平均の数の間の IR スペクトル解像度を選択します。タンパク質範囲(1800−1200 cm-1)のナノスケール局在IRスペクトルを測定するには、[取得]をクリックします。
  16. ナノスケールの解決済みケミカルマップを取得するには、IRイメージングオプションを選択し、対象の波数(アミドバンドIの場合は1655cm-1など)を選択し、AFMスキャンウィンドウでスキャンをクリックします。
  17. マッピングが完了したら、ファイルに移動し、測定値を保存します。取得した形態、接触共鳴、化学の地図とナノスケールの局所スペクトルを解析するには、内蔵のAFM画像処理ソフトウェアを使用します。スペクトルと画像は、商用ソフトウェアでさらに詳細な分析のために.csvまたは.axzファイルとして保存することができます。

5. 断面寸法の画像処理と解析

  1. 生画像14、17、19、41、42、59を平坦化し、内蔵のAFM画像処理ソフトウェアまたは商用ソフトウェアを使用する。
    注: 集計は、分析のアーティファクトを避け、測定された高さの過小評価を避けるために、計算からマスクする必要があります。
  2. イメージを 0 オーダー平面適合減算で平坦化します。
  3. 画像を平面で平坦化し、次いで1番目の回帰順で1行ずつ平坦化し、2番目のステップは、画像のラインプロファイルの平坦なベースラインに達するまで繰り返される。
  4. サンプルが非常に混雑している場合、非常に高い凝集体またはスキャナ弓アーティファクトが存在する、第2回回帰順序適合を用いて画像を平坦化する。
  5. フィブリル軸14、17、19、41、42、59に垂直に撮影された線プロファイルから集約の高さと幅を測定します。
  6. フィブリル軸14、17、19、41、42、59に平行な線維長を測定する。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

ThT蛍光アッセイによって測定されたAβ42凝集の代表的な時間経過を図1に示す。集約プロセスは、一般的に、ラグ相が最初に観察されるシグモイド曲線によって特徴付けられ、その後、平衡定常状態に達したときに曲線が高原に達する前に急激な成長相が続きます。,58.集約プロセスに関する分子の詳?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

このプロトコルの最初の重要なステップは、ステップ1.1および1.2で説明するAβ42溶液の場合のような単量体タンパク質の調製である。オリゴマーまたは凝集種の存在は、凝集運動学58の再現性が悪い可能性があり、AFMでアーティファクトを誘導する可能性があるため、非常に純粋な単量体溶液から集約プロセスを開始することが不可欠です。測定(例えば、フィブリル種は、?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

著者らは、スイス国立科学財団(SNF)の財政支援(助成番号P2ELP2_162116とP300P2_171219)、ダーウィンカレッジ、エラスムス+プログラム(助成番号2018-1-LT01-KA103-046719-154000)に感謝します。これらの成果につながる研究は、ERC助成金フィスプロト(契約番号337969)、ニューマン財団(T.P.J.K.)および欧州連合の第7フレームワークプログラム(FP7/2007-2013)の下で欧州研究評議会から資金を受け取っています。ケンブリッジ・センター・フォー・フォールディング・疾患(C.G.、M.V.、T.P.J.K.)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AFM-IR systemAnasys InstrumentsnanoIR 2 or 3Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS MicroplateCorning3881
Corning Microplate Aluminium Sealing TapeCorning6570
Double Sided Adhesive DiscsAGAR ScientificAGG3347N
FLUOstar OmegaBMG Labtech415-101Platereader
Mica Disc 10mm V1AGAR ScientificAGF7013
Park NX10 AFM systemPark SystemsN/AAtomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold ChipsPlatypus TechnologiesAU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantileversPark SystemsPPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mLEppendorf30108132
Silicon gold coated cantileversAnasys InstrumentsPR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mmAGAR ScientificAGF7001

参考文献

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  2. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 1-21 (2017).
  3. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: A summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86, 27-68 (2017).
  5. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 384-396 (2014).
  6. Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11, 252-272 (2016).
  7. Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326, 1533-1537 (2009).
  8. Barth, A. Infrared spectroscopy of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767, 1073-1101 (2007).
  9. Fitzpatrick, A. W. P., et al. Atomic structure and hierarchical assembly of a cross- amyloid fibril. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5468-5473 (2013).
  10. Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9758-9763 (2013).
  11. Michaels, T. C. T., Lazell, H. W., Arosio, P., Knowles, T. P. J. Dynamics of protein aggregation and oligomer formation governed by secondary nucleation. Journal of Chemical Physics. 143, (2015).
  12. Šarić, A., Michaels, T. C. T., Zaccone, A., Knowles, T. P. J., Frenkel, D. Kinetics of spontaneous filament nucleation via oligomers: Insights from theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 145, 211926(2016).
  13. Ruggeri, F. S., Habchi, J., Cerreta, A., Dietler, G. AFM-based single molecule techniques: Unraveling the amyloid pathogenic species. Current Pharmaceutical Design. 22, 3950-3970 (2016).
  14. Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Atomic force microscopy for single molecule characterisation of protein aggregation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 664, 134-138 (2019).
  15. Iljina, M., et al. Nanobodies raised against monomeric α-synuclein inhibit fibril formation and destabilize toxic oligomeric species. BMC Biology. 15, 1-14 (2017).
  16. Schilling, C., et al. Sequence-Optimized Peptide Nanofibers as Growth Stimulators for Regeneration of Peripheral Neurons. Advanced Functional Materials. 1809112, 1-15 (2019).
  17. Chiki, A., et al. Mutant exon1 huntingtin aggregation is regulated by T3 phosphorylation-induced structural changes and crosstalk between T3 phosphorylation and acetylation at K6. Angewandte Chemie - International Edition. 56, 5202-5207 (2017).
  18. Sieste, S., et al. Water-dispersible polydopamine-coated nanofibers for stimulation of neuronal growth and adhesion. Advanced Healthcare Materials. 7, 1-11 (2018).
  19. De, S., et al. Different soluble aggregates of Aβ42 can give rise to cellular toxicity through different mechanisms. Nature Communications. 10, 1541(2019).
  20. Chang, K. C., Chiang, Y. W., Yang, C. H., Liou, J. W. Atomic force microscopy in biology and biomedicine. Tzu Chi Medical Journal. 24, 162-169 (2012).
  21. Variola, F. Atomic force microscopy in biomaterials surface science. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 2950-2959 (2015).
  22. Drolle, E., Hane, F., Lee, B., Leonenko, Z. Atomic force microscopy to study molecular mechanisms of amyloid fibril formation and toxicity in Alzheimer’s disease. Drug Metabolism Reviews. 46, 207-223 (2014).
  23. Ruggeri, F. S., et al. Identification and nanomechanical characterization of the fundamental single-strand protofilaments of amyloid α-synuclein fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7230-7235 (2018).
  24. Ruggeri, F. S., et al. Infrared nanospectroscopy characterization of oligomeric and fibrillar aggregates during amyloid formation. Nature Communications. 6, 1-9 (2015).
  25. Ruggeri, F. S., et al. Microfluidic deposition for resolving single-molecule protein architecture and heterogeneity. Nature Communications. 9, (2018).
  26. Qamar, S., et al. FUS phase peparation is modulated by a molecular chaperone and methylation of arginine cation-π interactions. Cell. 173, 720-734 (2018).
  27. Habchi, J., et al. Cholesterol catalyses Aβ42 aggregation through a heterogeneous nucleation pathway in the presence of lipid membranes. Nature Chemistry. 10, 673-683 (2018).
  28. Sweers, K. K. M., Stöckl, M., Bennink, M. L., Subramaniam, V. Characterizing nanoscale morphologic and mechanical properties of α-Synuclein amyloid fibrils with atomic force microscopy. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding & Aggregation. Uversky, V. N., Lyubchenko, Y. L. , London, UK. 309-322 (2014).
  29. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly Insights from scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 173, 1-13 (2011).
  30. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Devlin, G. L., Dobson, C. M., Welland, M. E. Analysis of structural order in amyloid fibrils. Nanotechnology. 18, (2007).
  31. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. , 6546-6561 (2016).
  32. Knowles, T. P. J., Oppenheim, T. W., Buell, A. K., Chirgadze, D. Y., Welland, M. E. Nanostructured films from hierarchical self-assembly of amyloidogenic proteins. Nature Nanotechnology. 5, 204-207 (2010).
  33. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Craig, A., Dobson, C. M., Welland, M. E. Spatial persistence of angular correlations in amyloid fibrils. Physical Review Letters. 96, 1-4 (2006).
  34. Knowles, T. P. J., et al. Twisting transition between crystalline and fibrillar phases of aggregated peptides. Physical Review Letters. 109, 158101(2012).
  35. Knowles, T. P., et al. Role of intermolecular forces in defining material properties of protein nanofibrils. Science. 318, 1900-1903 (2007).
  36. Smith, J. F., Knowles, T. P. J., Dobson, C. M., MacPhee, C. E., Welland, M. E. Characterization of the nanoscale properties of individual amyloid fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 15806-15811 (2006).
  37. Sokolov, D. V. Atomic force microscopy for protein nanotechnology. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 300, 323-367 (2013).
  38. Ruggeri, F. S., et al. Influence of the β-sheet content on the mechanical properties of aggregates during amyloid fibrillization. Angewandte Chemie - International Edition. 54, 2462-2466 (2015).
  39. Jeong, J. S., Ansaloni, A., Mezzenga, R., Lashuel, H. A., Dietler, G. Novel mechanistic insight into the molecular basis of amyloid polymorphism and secondary nucleation during amyloid formation. Journal of Molecular Biology. 425, 1765-1781 (2013).
  40. Adamcik, J., Mezzenga, R. Study of amyloid fibrils via atomic force microscopy. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 17, 369-376 (2012).
  41. Deguire, S. M., et al. N-terminal huntingtin (Htt) phosphorylation is a molecular switch regulating Htt aggregation, helical conformation, internalization, and nuclear targeting. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
  42. Ruggeri, F. S., et al. Nanoscale studies link amyloid maturity with polyglutamine diseases onset. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  43. Adamcik, J., et al. Understanding amyloid aggregation by statistical analysis of atomic force microscopy images. Nature Nanotechnology. 5, 423-428 (2010).
  44. Lin, Y. C., Komatsu, H., Ma, J., Axelsen, P. H., Fakhraai, Z. Quantitative analysis of amyloid polymorphism using height histograms to correct for tip convolution effects in atomic force microscopy imaging. RSC Advances. 6, 114286-114295 (2016).
  45. Mannini, B., et al. Stabilization and characterization of cytotoxic Aβ40 oligomers isolated from an aggregation reaction in the presence of zinc ions. ACS Chemical Neuroscience. , (2018).
  46. Medalsy, I., Hensen, U., Muller, D. J. Imaging and quantifying chemical and physical properties of native proteins at molecular resolution by force-volume AFM. Angewandte Chemie - International Edition. 50, 12103-12108 (2011).
  47. Dufrêne, Y. F., Martínez-Martín, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Müller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve–based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
  48. Takai, E., et al. Scanning electron microscope imaging of amyloid fibrils. American Journal of Biochemistry and Biotechnology. 10, 31-39 (2014).
  49. Dazzi, A., et al. AFM-IR: Combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Applied Spectroscopy. 66, 1365-1384 (2012).
  50. Volpatti, L. R., et al. Micro- and nanoscale hierarchical structure of core-shell protein microgels. Journal of Materials Chemistry B. 4, 7989-7999 (2016).
  51. Galante, D., et al. A critical concentration of N-terminal pyroglutamylated amyloid beta drives the misfolding of Ab1-42 into more toxic aggregates. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 79, 261-270 (2016).
  52. Ruggeri, F. S., et al. Identification of oxidative stress in red blood cells with nanoscale chemical resolution by infrared nanospectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 19, 1-14 (2018).
  53. Ramer, G., Ruggeri, F. S., Levin, A., Knowles, T. P. J., Centrone, A. Determination of polypeptide conformation with nanoscale resolution in water. ACS Nano. 12 (7), 6612-6619 (2018).
  54. Dazzi, A., Prater, C. B. AFM-IR: Technology and applications in nanoscale infrared spectroscopy and chemical imaging. Chemical Reviews. 117, 5146-5173 (2017).
  55. Lahiri, B., Holland, G., Centrone, A. Chemical imaging beyond the diffraction limit: experimental validation of the PTIR technique. Small. 9 (3), 439-445 (2013).
  56. Ansaloni, A., et al. One-pot semisynthesis of exon 1 of the huntingtin protein: New tools for elucidating the role of posttranslational modifications in the pathogenesis of Huntington’s disease. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (7), 1928-1933 (2014).
  57. Khalaf, O., et al. The H50Q mutation enhances α-synuclein aggregation, secretion, and toxicity. Journal of Biological Chemistry. 289, 21856-21876 (2014).
  58. Hellstrand, E., Boland, B., Walsh, D. M., Linse, S. Amyloid β-protein aggregation produces highly reproducible kinetic data and occurs by a two-phase process. ACS Chemical Neuroscience. 1, 13-18 (2010).
  59. Limbocker, R., et al. Trodusquemine enhances Aβ42 aggregation but suppresses its toxicity by displacing oligomers from cell membranes. Nature Communications. 10 (1), 225(2019).
  60. Lu, F., Belkin, M. A. Infrared absorption nano-spectroscopy using sample photoexpansion induced by tunable quantum cascade lasers. Optics Express. 19, 1902-1904 (2011).
  61. Jiao, Y., Schäffer, T. E. Accurate height and volume measurements on soft samples with the atomic force microscope. Langmuir. 20, 10038-10045 (2004).
  62. Müller, D. J., Engel, A. The height of biomolecules measured with the atomic force microscope depends on electrostatic interactions. Biophysical Journal. 73, 1633-1644 (1997).
  63. Heymann, J. B., Moller, C., Muller, D. J. Sampling effects influence heights measured with atomic force microscopy. Journal Of Microscopy-Oxford. 207, 43-51 (2002).
  64. Marinello, F., Balcon, M., Schiavuta, P., Carmignato, S., Savio, E. Thermal drift study on different commercial scanning probe microscopes during the initial warming-up phase. Measurement Science and Technology. 22, 9(2011).
  65. Marinello, F., Bariani, P., De Chiffre, L., Savio, E. Fast technique for AFM vertical drift compensation. Measurement Science and Technology. 18, 689-696 (2007).
  66. Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in AFM imaging (Clifton, N.J.). Methods in Molecular Biology. 242, 25-27 (2004).
  67. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. New York, NY. 31-43 (2011).
  68. Marinello, F., Carmignato, S., Voltan, A., Savio, E., De Chiffre, L. Error Sources in Atomic Force Microscopy for Dimensional Measurements: Taxonomy and Modeling. Journal of Manufacturing Science and Engineering. 132, 030903(2010).
  69. Ukraintsev, E., Kromka, A., Kozak, H., Reme, Z., Rezek, B. Artifacts in Atomic Force Microscopy of Biological Samples. Atomic Force Microscopy Investigations into Biology - From Cell to Protein. Frewin, C. L. , (2012).
  70. Tsukruk, V. V., Singamaneni, S. Scanning Probe Microscopy of Soft Matter: Fundamentals and Practices. , Wiley-VCH Verlag GmbH. Weinheim, Germany. (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

151

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved