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Résumé

Nous décrivons l'application de la nanospectroscopie infrarouge et de la microscopie à haute résolution pour visualiser le processus d'auto-assemblage des protéines dans les agrégats oligomériques et les fibrilles amyloïdes, qui est étroitement associée à l'entrée et au développement d'un large éventail de troubles neurodégénératifs humains.

Résumé

Le phénomène de l'épandage et de l'agrégation de protéines induits en protéines entraîne la formation d'agrégats protéiques très hétérogènes, qui sont associés à des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson. En particulier les agrégats de faible poids moléculaire, oligomères amyloïdes, ont été montrés pour posséder des propriétés cytotoxiques génériques et sont impliqués comme neurotoxines dans de nombreuses formes de démence. Nous illustrons l'utilisation de méthodes basées sur la microscopie de la force atomique (AFM) pour répondre à la tâche difficile de caractériser les propriétés morphologiques, structurelles et chimiques de ces agrégats, qui sont difficiles à étudier à l'aide de structures conventionnelles méthodes biophysiques en vrac en raison de leur hétérogénéité et de leur nature transitoire. Les approches de microscopie des sondes de balayage sont maintenant capables d'étudier la morphologie des agrégats amyloïdes avec une résolution sous-nanométrique. Nous montrons ici que la nanospectroscopie infrarouge (IR), qui exploite simultanément la haute résolution de l'AFM et la puissance de reconnaissance chimique de la spectroscopie IR, peut aller plus loin et permettre la caractérisation des propriétés structurelles des individus protéines, et offrent ainsi un aperçu des mécanismes d'agrégation. Puisque l'approche que nous décrivons peut également être appliquée aux investigations des interactions des assemblages de protéine avec de petites molécules et anticorps, elle peut fournir l'information fondamentale pour développer de nouveaux composés thérapeutiques pour diagnostiquer ou traiter neurodegenerative.

Introduction

Plus de 40 millions de personnes dans le monde sont actuellement touchées par des troubles neurodégénératifs, tels que la maladie d'Alzheimer (MA)1 et la maladie de Parkinson (PD)2 maladies. Plus généralement, plus de cinquante pathologies sont associées au niveau moléculaire à la méplication et à l'agrégation des protéines, un processus qui conduit à la prolifération d'agrégats insolubles de protéines fibrillaires, connus sous le nom de dépôts amyloïdes3, 4. Les origines moléculaires de la neurodégénérescence et ses liens avec les changements conformationnels protéiques des protéines conduisant à la formation d'amyloïdes, cependant, restent incertaines, en grande partie en raison du niveau élevé d'hétérogénéité, de nature transitoire et de nanoéchelle dimensions des agrégats pathologiques4,5.

Les études très réussies des structures protéiques au cours des dernières décennies ont été largement basées sur l'utilisation de méthodes en vrac, y compris la cristallographie aux rayons X, la microscopie cryo-électronique et la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire5, 6 Annonces , 7 Annonces , 8 Annonces , 9. Dans cette catégorie de techniques, la spectroscopie infrarouge (IR) est apparue comme un outil d'analyse sensible pour démêler les propriétés chimiques des systèmes biologiques tels que les protéines8. Les méthodes d'IR permettent la quantification des changements structurels secondaires et quaternaires de protéine pendant leur malplier et agrégation. En outre, afin de déchiffrer davantage au niveau microscopique les détails mécanistes impliqués dans les paysages complexes d'énergie libre de protéines au cours de leur agrégation, une avancée majeure a été le développement d'outils de cinétique chimique pour s'étendre à la complexité voies d'auto-assemblage, y compris la formation de fibrilles amyloïdes5,6,7,10,11,12. Cependant, les méthodes spectroscopiques en vrac ne fournissent que des informations moyennes sur l'ensemble hétérogène d'espèces présentes en solution ou impliquées dans des étapes microscopiques spécifiques, rendant ainsi l'étude des propriétés biophysiques des individus espèces agrégées défiant au niveau nanométrique13,14.

Plusieurs techniques de microscopie avec la capacité de fonctionner sur des échelles plus petites que la limite de diffraction de la lumière ont émergé au cours des dernières décennies. Cette classe de méthodes comprend la microscopie électronique (EM) et la microscopie par force atomique (AFM). Alors que la microscopie électronique à balayage (SEM) et la microscopie électronique de transmission (TEM) fournissent des images bidimensionnelles (2D) d'un spécimen, l'AFM est apparue au cours des dernières décennies comme une technique puissante et polyvalente pour étudier les morphologies tridimensionnelles (3D), ainsi que les propriétés nanomécaniques d'un échantillon avec la résolution de sous-nanomètre13,14,15,16,17,18,19, 20 Ans, états-unis , 21 Ans, états-unis , 22 Ans , 23 Ans, états-unis , 24 Ans, états-unis , 25 Annonces , 26 Annonces , 27. La raison d'être de l'étude de l'agrégation des protéines par l'intermédiaire de l'AFM est que cette approche permet d'étudier la morphologie des espèces individuelles présentes dans la solution13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. En particulier, en surveillant l'échantillon en fonction du temps, l'AFM permet d'enquêter sur l'évolution de la morphologie de l'espèce au sein de l'échantillon, ce qui permet de suivre et de visualiser les voies de la formation amyloïde23, 25,38,39,40,41,42. En outre, l'AFM permet de quantifier les paramètres structurels tels que les hauteurs transversales et les longueurs des espèces individuelles présentes dans la solution13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 Ans, en est à qui , 45 Annonces , 46 Annonces , 47 Annonces , 48. Cependant, l'étude d'une seule propriété biophysique, comme la morphologie, n'est souvent pas suffisante pour étudier des systèmes biologiques hétérogènes et complexes. Les méthodes d'imagerie AFM, SEM ou TEM à elles seules ne révèlent pas facilement les propriétés chimiques des espèces hétérogènes d'agrégats amyloïdes à l'échelle nanométrique.

Une avancée majeure pour l'analyse d'échantillons biologiques hétérogènes à cette échelle a été faite récemment avec le développement et l'application dans le domaine de l'agrégation de protéines de la nanospectroscopie infrarouge (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. Cette méthode innovante exploite la combinaison de la résolution spatiale de l'AFM (1 à 10 nm) avec la puissance d'analyse chimique de l'IR. La technique AFM-IR est basée sur la mesure de l'effet de résonance induit par photothermale entraîné par un laser IR, et sur la mesure de l'expansion thermique de l'échantillon à l'étude par la pointe de l'AFM. L'échantillon peut être éclairé par le laser IR directement à partir du haut ou du bas en toute réflexion interne, de la même manière que dans la spectroscopie infrarouge conventionnelle24,42,52,53 . Le laser IR peut être pulsé avec des fréquences typiques de l'ordre de centaines de kilohertz (1-1000 kHz) et réglé sur une large portée spectrale, généralement entre 1000-3300 cm-1. Bien que la source laser couvre une superficie de 30 m de diamètre, la résolution spatiale de la technique AFM-IR est déterminée nominalement par le diamètre de la pointe AFM, qui détecte l'expansion thermique locale du système. L'AFM-IR est bien adapté pour étudier les échantillons biologiques parce que le signal IR est proportionnel à leur épaisseur jusqu'à 1,5 m, et les spectres IR qui en résultent sont généralement en accord avec les spectres de transmission FTIR correspondants13,54 ,55. Pour cette raison, les méthodes d'analyse établies en spectroscopie peuvent être facilement appliquées, telles que l'étude des changements chimiques, le changement de forme de bande et la déconvolution par deuxième analyse des dérivés52. Dans l'ensemble, en combinant la résolution spatiale de l'AFM avec la puissance de reconnaissance chimique de la spectroscopie IR, l'AFM-IR permet l'acquisition simultanée d'un large éventail de propriétés morphologiques, mécaniques et chimiques d'un échantillon à l'échelle nanométrique.

Ici, nous illustrons un protocole pour la caractérisation du processus d'agrégation de protéines qui exploite la combinaison des essais de fluorescence in vitro, de l'imagerie AFM haute résolution et de l'AFM-IR à l'échelle nanométrique. Cette approche combinée a déjà excellé dans l'étude des résultats détaillés dans l'étude des propriétés chimiques et structurelles des microgouttes individuelles formées par les agrégats protéiques, dans l'étude de la séparation de la phase des protéines liquides-liquides, et dans étudier l'hétérogénéité et les propriétés biophysiques des espèces agrégées individuelles à l'échelle nanométrique23,26,38,45,50,53, 56,57.

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Protocole

1. Tests d'agrégation sur les lecteurs de plaques de fluorescence

REMARQUE : Le protocole décrit ici est un exemple de la façon d'étudier l'agrégation de toute protéine ou peptide par la cinétique chimique. En particulier, il décrit un protocole optimisé pour étudier l'agrégation du peptide A-42, qui est impliqué dans l'début et la progression de la maladie d'Alzheimer58,59. Un protocole similaire peut être ajusté et adopté pour étudier l'agrégation de toute protéine ou peptide.

  1. Obtenir une solution monomeric très pure d'A-42 grâce à des techniques de chromatographie d'échange d'ions et d'exclusion de taille pour distinguer les fractions de protéines contenant a42, et pour isoler la fraction monomérique d'autres formes agrégées d'A-42 obtenues58 , 59.
  2. Diluer le peptide A-42 dans un tampon de phosphate de sodium de 20 mM, 200 m EDTA au pH 8,058 à une concentration finale désirée allant de 1 à 5 M, dans des tubes à faible liaison de 1,5 mL. Les échantillons prélevés pour les mesures de l'AFM ne doivent pas contenir le colorant fluorescent utilisé dans l'analyse de l'agrégation (thioflavine T, ThT), car il pourrait introduire des artefacts lors du dépôt d'échantillons pour l'analyse de l'AFM. Ainsi, préparer des triplicates de deux solutions identiques: i) le premier contenant monomeric A-42 pour suivre le processus d'agrégation par l'AFM; ii) le second contenant le monomeric A-42 avec l'ajout de 20 M ThT comme traceur pour surveiller la cinétique de l'agrégation.
    REMARQUE : Il est important d'effectuer les étapes 1.1 et 1.2 sur la glace. Cette procédure est de s'assurer que la solution monomeric A-42 ne s'agrége pas avant d'être initiée dans le lecteur de plaque. Lors de la manipulation d'échantillons, un tuyauterie soigneux est essentiel pour éviter l'introduction de bulles d'air qui pourraient affecter l'échantillon de protéines.
  3. Pipette 80 l de chaque échantillon dans chaque puits d'une plaque de 96 puits en demi-zone de polystyrène noir avec des surfaces claires et non contraignantes.
  4. Scellez la plaque avec une feuille pour minimiser l'évaporation de l'échantillon au cours de l'agrégation.
  5. Équilibrez la température du lecteur de plaque à 37 oC.
  6. Configurez le protocole d'agrégation pour lire les mesures de fluorescence à intervalles fixes, à une longueur d'onde d'excitation de 440 nm et une longueur d'onde d'émission de 480 nm. L'agrégation doit être initiée dans des conditions calmes.
  7. Insérez la plaque dans le lecteur de plaque.
    REMARQUE : Il est important d'être prudent lors de la manipulation de la plaque, pour s'assurer que l'agrégation n'est pas déclenchée avant de commencer le lecteur de plaque. Utilisez les paramètres d'ajustement de gain pour assurer la lecture optimale de la fluorescence de chaque échantillon.
  8. Démarrez la mesure.
    REMARQUE: L'expérience d'agrégation est terminée lorsque la courbe sigmoïdale de fluorescence ThT atteint un plateau58.

2. Préparation d'échantillons pour les mesures AFM et nano-IR

  1. Collez le disque De microa de qualité la plus élevée sur un disque magnétique en acier inoxydable de haute qualité à l'aide d'onglets adhésifs ou de ruban adhésif recto-verso.
  2. Etch mica en plaçant un morceau de ruban adhésif sur la surface du mica et en en retirant la couche supérieure du mica. Cette procédure produira une surface propre et atomiquement plate, adaptée aux dépôts d'échantillons.
    REMARQUE : La surface gravée doit être uniforme et lisse.
    CAUTION: Ne pas toucher ou respirer directement au-dessus de mica fraîchement gravé, car cela va introduire des artefacts.
  3. Pause / arrêt de la mesure du lecteur de plaque pour recueillir le point de temps d'intérêt pendant le processus d'agrégation de la protéine.
  4. Retirer le papier d'étanchéité et recueillir 10 aliquot ll des échantillons sans ThT du puits dans un tube de 1,5 ml à faible liaison.
  5. Déposer les 10 ll de l'échantillon sur le mica fraîchement gravé. Pour les mesures AFM-IR, les échantillons doivent être déposés sur un substrat d'or fraîchement rayé.
  6. Incuber la solution sur le mica pendant 1 min pour permettre la physisorbtion.
    REMARQUE : Un temps d'incubation plus long permettrait une meilleure absorption à la surface, mais pourrait induire l'auto-organisation artificielle et l'auto-assemblage25. Pour éviter ces effets, le dépôt de pulvérisation peut être exploité25.
  7. Rincer trois fois avec 1 ml d'eau ultrapure.
  8. Sécher sous un flux doux d'azote pour mesurer l'échantillon dans l'environnement de l'air.

3. Imagerie AFM de la morphologie des agrégats protéiques

REMARQUE : Les mesures de morphologie peuvent être effectuées en mode de contact et dynamique, dans les étapes suivantes, cette dernière est décrite car elle réduit les forces latérales pour mesurer la morphologie 3D de l'échantillon avec une haute résolution. Les mesures AFM-IR seront effectuées en mode contact afin d'améliorer le rapport signal-bruit AFM-IR.

  1. Allumez le système AFM au moins 30 minutes avant les mesures afin de permettre au système d'atteindre la stabilité thermique. Cliquez sur Setup, puis sur Probe. Dans la fenêtre de changement de sonde cliquez sur Suivant pour préparer Z, Focus Stage.
  2. Éteignez l'interrupteur de faisceau AFM (s'il est allumé). Déverrouillez les serrures de queue d'aronde, déconnectez la tête du système et dans la fenêtre de changement de sonde cliquez sur Suivant.
  3. Montez le porte-à-faux AFM sur le porte-sonde. Connectez la tête au système et verrouillez les serrures en queue d'aronde.
    REMARQUE : Les cantilevers optimaux pour étudier les échantillons biologiques en mode dynamique AFM ont constante de ressort s'étendant entre 2-40 N m-1 et un radii d'apex s'étendant entre 2-8 nm14.
  4. Allumez l'interrupteur de faisceau laser AFM et dans la fenêtre de changement de sonde cliquez sur Suivant.
  5. Dans la fenêtre pop-up cliquez sur Non si le type de porte-à-faux n'a pas changé. Ajuster les boutons d'alignement optique pour trouver le porte-à-faux. Ajustez-vous sur le porte-à-faux et cliquez sur Suivant.
  6. Dans la fenêtre pop-up cliquez sur Oui si l'accent est mis sur le porte-à-faux.
  7. Placez le faisceau laser à l'extrémité du porte-à-faux à l'aide des boutons contrôlant la position du laser de détection. Maximisez le signal total mesuré par le photodiode à quatre quadrants à au moins 1 V à l'aide des boutons contrôlant la position du faisceau laser dévié sur la photodiode sensible à la position (PSPD). Dans la fenêtre Dechange Deson cliquez sur Suivant, puis sur Fermer.
  8. Attendez 15 min pour que le porte-à-faux atteigne la stabilité thermique. Réajuster la position du faisceau laser dévié sur le PSPD si nécessaire.
  9. Cliquez sur NCM SWEEP, choisissez l'amplitude désirée de l'oscillation, cliquez sur La phased'utilisation, cliquez sur l'auto et accordez le porte-à-faux près du maximum de sa première résonance libre d'oscillation, qui est d'environ 300 kHz pour un en porte-à-faux avec une constante printanière de 40 Nm -1.
    REMARQUE: Tuning le porte-à-faux hors du maximum de sa résonance libre assure une plus grande stabilité des mesures14.
  10. Placez l'échantillon sur le porte-échantillon. Choisissez des paramètres d'imagerie appropriés. Le taux de numérisation typique est de 0,3 à 1,0 Hz pour une zone d'analyse de 1 x 1 m2 à 5 x 5 m2. La résolution typique nécessaire se situe entre 256 x 256 et 1024 x 1024 pixels. Cliquez sur Scan Area pour choisir la taille de l'analyse et le nombre de pixels.
  11. Concentrez la vue optique sur l'échantillon. Cliquez sur Approche pour approcher la surface de l'échantillon. Une fois l'approche terminée, cliquez sur Lesque10 pour lever la pointe de l'AFM à 100 m au-dessus de la surface de l'échantillon. Cliquez Sur Développer l'image optique de l'échantillon. Cliquez sur la barre Focus Stage pour concentrer la vue sur la surface de l'échantillon.
  12. Utilisez les flèches pour vous déplacer dans la région de l'échantillon d'intérêt. Engagez la surface en appuyant sur le bouton Approche. Cliquez sur le bouton Scan line et vérifiez si la pointe suit bien la surface, si nécessaire, ajustez le point d'ensemble .
  13. Commencez à imageriede la surface de l'échantillon en appuyant sur le bouton Scan. Pendant l'imagerie, afin d'éviter une grande force d'imagerie et de conserver la cohérence dans les échantillons indépendants, maintenir un régime constant de changement de phase ne dépassant pas 20'42.
  14. Entrez le nom du fichier et choisissez l'annuaire de base où l'image acquise sera enregistrée.

4. Mesures de nanospectroscopie infrarouge des agrégats protéiques

  1. Allumez le système AFM-IR et le laser infrarouge (IR)60 30 à 60 min avant les mesures de stabilisation thermique. Les lasers typiques pour les instruments AFM-IR sont les oscillateurs de paramètres optiques (OPO) et les lasers en cascade quantique (QCL).
  2. Ouvrez le logiciel intégré pour contrôler l'instrument. Cliquez sur le fichier, puis sur le nouveau pour ouvrir un nouveau fichier nanoIR. Appuyez sur le bouton initialise pour démarrer le système AFM-IR.
  3. Ouvrez le couvercle de l'instrument et montez sur le système AFM-IR une sonde enduite d'or de silicium avec un rayon nominal de 30 nm et une constante printanière de 0,2 N/m pour mesurer l'échantillon en mode contact.
  4. Cliquez sur Charge dans la section AFM sonde, puis la prochaine. En se concentrant sur la section de sonde cliquez sur les flèches pour concentrer la caméra sur le porte-à-faux. Dans l'échantillon de section XY mouvement, utiliser les flèches pour placer l'air transversal à l'extrémité du porte-à-faux.
  5. Faites pivoter les boutons contrôlant la position du laser de détection pour positionner le laser à l'extrémité du porte-à-faux. Faites pivoter les boutons laser pour détecter et maximiser la somme mesurée par le photodiode à quatre quadrants à une valeur de 3 V. Faites pivoter le bouton de déviation pour ajuster la déviation en porte-à-faux à -1 V, puis cliquez ensuite. Fermez la couverture de l'instrument.
  6. Dans la section, concentrez-vous sur l'utilisation de l'échantillon pour concentrer la caméra sur l'échantillon. Ensuite, dans la section l'échantillon XY mouvement utiliser les flèches pour se déplacer dans la région d'intérêt de l'échantillon et cliquez sur l'approche et de s'engager.
  7. Dans la fenêtre du microscope sélectionnez comme entrées les canaux d'intérêt pour cartographier les propriétés biophysiques de l'échantillon. En particulier, choisissez la hauteur pour la morphologie, l'amplitude 2 pour l'absorption de l'IR et la fréquence PLL pour cartographier la résonance de contact tip-sample.
  8. Dans la section d'analyse AFM de la fenêtre de contrôle, utilisez des paramètres similaires à ceux de la section 3 (c.-à-d. le taux d'analyse 0,1 à 1,0 Hz, entre 256 x 256 et 1024 x 1024 pixels). Choisissez comme valeur des gains en fonction de la rugosité de l'échantillon : intégrale I 1 à 10 et P proportionnel à 10-30. Ensuite, cliquez sur l'analyse pour acquérir une carte de morphologie.
    REMARQUE : La morphologie peut être mesurée de la même façon en mode d'adtension dynamique, mais les mesures AFM-IR sont effectuées ici en mode contact pour avoir des rapports signal/bruit plus élevés.
  9. Une fois la cartographie de la morphologie terminée, dans la fenêtre du microscope, cliquez sur la carte de hauteur pour positionner la sonde sur le dessus d'un agrégat. Ensuite, dans la section nanoIR de la fenêtre de contrôle, cliquez sur démarrer IR pour éclairer l'échantillon avec le laser IR.
  10. Pour concentrer le laser infrarouge sur le porte-à-faux, cliquez sur l'optimisation. Dans cette fenêtre, écrivez un numéro d'onde où l'échantillon va avoir une absorption élevée et cliquez sur ajouter. Pour les protéines, une valeur typique est de 1655 cm-1. Cliquez sur l'analyse pour trouver la position laser IR et cliquez sur mise à jour pour aligner sa position avec le porte-à-faux. Fermez la fenêtre.
  11. Dans la section générale du réglage nanoIR, écrivez un nombre d'ondes où l'absorption élevée dans le champ relatif est prévue. Ensuite, désactivez l'option Filtre De Band Pass et regardez la lecture du compteur et la transformation rapide de Fourier (FFT) de la réponse en porte-à-faux. Dans la fenêtre FFT déplacer le curseur vert pour lire la fréquence de résonance du porte-à-faux. Une valeur typique de la FFT de la résonance des cantilevers est d'environ 300 kHz. Écrivez cette valeur de fréquence de résonance dans la section générale dans le champ central de freq. et utilisez une fenêtre freq. de 50 kHz.
    REMARQUE : Sélectionnez une puissance laser suffisamment basse pour ne pas saturer la lecture du compteur et distoper la réponse en porte-à-faux et ne pas surchauffer l'échantillon.
  12. Cliquez sur la fenêtre de l'impulsion laser pour utiliser le mode de résonance améliorée. Choisissez un centre de fréquence de 300 kHz, une plage de tune de 50 kHz et un cycle de service du laser de 5%. Cliquez sur acquérir pour balayer le pouls du laser. En utilisant le curseur dans le graphique, accordez l'impulsion laser à la fréquence de la réponse mécanique de l'expansion thermique de l'échantillon absorbant la lumière infrarouge. Ensuite, sélectionnez l'option PLL pour surveiller la résonance de contact entre l'échantillon et la pointe. Appuyez sur le bouton zéro dans la fenêtre Et la tique PLL permettent de suivre la résonance de contact de l'échantillon-pointe. Choisissez un gain intégral I 0,5 et un gain proportionnel P 10. Fermez la fenêtre.
  13. Ouvrez à nouveau la fenêtre d'optimisation et trouvez la position du laser IR pour au moins 3 nombres d'ondes correspondant aux bandes d'absorption majeures de l'échantillon (bande d'amide I-II-III) et pour au moins un numéro d'onde pour chaque puce du laser.
  14. Cliquez sur Outils (fr) Calibration de fond de l'IR (fr) Nouveau. Dans la fenêtre, sélectionnez la région spectroscopique d'intérêt (1800 à 1200 cm-1 pour étudier des échantillons de protéines); choisir le même pouls que celui déterminé à l'étape 4,12 et un cycle de service de 5 %; cliquez sur l'acquisition rapide et sélectionnez la vitesse laser, gamme typique pour un laser cascade quantique est entre 20-500 cm-1. Cliquez sur acquérir pour mesurer le fond laser IR. Ce spectre de fond sera utilisé pour la normalisation des spectres localisés à l'échelle nanométrique mesurée. Fermez la fenêtre.
    REMARQUE : Si un laser rapide et un mode de résonance amélioré ne sont pas disponibles, sautez l'étape 4.12 et sélectionnez les spectres à pas au lieu de jeûner à la fois dans les fenêtres d'acquisition de spectres d'arrière-plan et d'IR. Toutefois, la sensibilité agrégée unique ne sera pas atteinte.
  15. Dans les paramètres des spectres INFRAROUGEs, choisissez une résolution du spectre INFRAROUGE entre 1/4 cm-1 et un nombre de co-moyennes d'au moins 64x. Cliquez sur l'acquisition pour mesurer un spectre D'IR localisé à l'échelle nanométrique dans la gamme de protéines (1800-1200 cm-1).
  16. Pour acquérir une carte chimique résolue à l'échelle nanométrique, sélectionnez l'option d'imagerie INFRAROUGE, choisissez un nombre d'ondes d'intérêt (p. ex., 1655 cm-1 pour la bande amide I) et cliquez sur le balayage dans la fenêtre d'analyse de l'AFM.
  17. Une fois la cartographie terminée, allez déposer et enregistrer les mesures. Pour analyser les cartes acquises de la morphologie, de la résonance de contact et de la chimie, ainsi que les spectres localisés à l'échelle nanométrique, utilisez le logiciel intégré de traitement d'images AFM. Spectra et Images peuvent être enregistrés sous forme de fichiers .csv ou .axz pour une analyse plus détaillée avec un logiciel commercial.

5. Traitement et analyse d'images de dimensions transversales

  1. Aplatir les images brutes14,17,19,41,42,59 à l'aide de logiciels intégrés de traitementd'images AFM ou de logiciels commerciaux.
    REMARQUE : Les agrégats doivent être masqués à partir du calcul afin d'éviter les artefacts d'analyse et la sous-estimation de leur hauteur mesurée.
  2. Aplatir l'image par 0 plan d'ordre ajustement soustraction.
  3. Aplatir l'image par plan, puis ligne par ligne à un ordre de régression 1st, la deuxième étape est répétée jusqu'à ce que la ligne de base plat dans le profil de ligne de l'image est atteint.
  4. Si l'échantillon est très encombré, contient des agrégats exceptionnellement élevés ou l'artefact d'arc de scanner est présent, aplatir l'image en utilisant 2nd régression ordre ajustement.
  5. Mesurer la hauteur et la largeur globales à partir d'un profil de ligne pris perpendiculairement à l'axe fibril14,17,19,41,42,59.
  6. Mesure longueur fibrile parallèle à l'axe fibril14,17,19,41,42,59.

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Résultats

Un cours de temps représentatif de l'agrégation de l'A-42, tel que mesuré par l'assiduescence de ThT, est indiqué à la figure 1. Le processus d'agrégation est généralement caractérisé par une courbe sigmoïdale, où une phase de décalage est initialement observée, et est suivie d'une phase de croissance abrupte, avant que la courbe n'atteigne un plateau lorsqu'un état d'équilibre stable est atteint6,7 ,

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Discussion

La première étape critique de ce protocole est la préparation de protéines monomériques, comme dans le cas de la solution A-42 décrite dans les étapes 1.1 et 1.2. Il est essentiel d'initier le processus d'agrégation à partir d'une solution monomeric très pure, car la présence d'espèces oligomériques ou agrégées peut entraîner une mauvaise reproductibilité de la cinétique d'agrégation58, et induire des artefacts dans l'AFM (p. ex., les espèces fibrillaires seront évidentes aux ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs remercient la Fondation nationale suisse pour la science (SNF) pour le soutien financier (numéro de subvention P2ELP2-162116 et P300P2-171219), le Darwin College, le programme ErasmusMD pour le soutien financier (numéro de subvention 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) et le recherche menant à ces résultats a reçu un financement du Conseil européen de la recherche dans le cadre du septième programme-cadre de l'Union européenne (7e FP/2007-2013) par l'intermédiaire de la subvention PhysProt (accord numéro 337969), de la Fondation Newman (T.P.J.K.) et de Cambridge Centre for Misfolding Diseases (C.G., M.V., et T.P.J.K.).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
AFM-IR systemAnasys InstrumentsnanoIR 2 or 3Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS MicroplateCorning3881
Corning Microplate Aluminium Sealing TapeCorning6570
Double Sided Adhesive DiscsAGAR ScientificAGG3347N
FLUOstar OmegaBMG Labtech415-101Platereader
Mica Disc 10mm V1AGAR ScientificAGF7013
Park NX10 AFM systemPark SystemsN/AAtomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold ChipsPlatypus TechnologiesAU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantileversPark SystemsPPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mLEppendorf30108132
Silicon gold coated cantileversAnasys InstrumentsPR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mmAGAR ScientificAGF7001

Références

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  2. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 1-21 (2017).
  3. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: A summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86, 27-68 (2017).
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