Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים את היישום של ננו ספקטרוסקופית אינפרא אדום ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופ כוח אטומי כדי להמחיש את תהליך של חלבון הרכבה עצמית לתוך אגרגטים oligomeric ו-עמילואיד fibrils, אשר קשורה היטב התחלתה ופיתוח של מגוון רחב של מחלות ניווניות אנושיות.

Abstract

התופעה של חלבון מתקפל ומצבור תוצאות היווצרות של אגרגטים חלבון הטרוגנית מאוד, אשר קשורים למצבים נוירוניווניות כגון מחלות אלצהיימר ופרקינסון. במיוחד אגרגטים מולקולרית במשקל נמוך, עמילואיד oligomers, הוכחו בעלי תכונות ציטוטוקסיים גנריות מעורבים כמו רעלים נוירוטוקסינים רבות של דמנציה. אנו ממחישים את השימוש בשיטות המבוססות על מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) כדי לטפל במשימה המאתגר של אפיון התכונות המורפולוגיות, הקונסטרוקטיביות והכימיות של אגרגטים אלה, שקשה ללמוד באמצעות מבנה קונבנציונאלי שיטות או שיטות ביופיזיקלי בצובר בשל טרוגניות והאופי הארעי שלהם. סריקה גישות מיקרוסקופ בדיקה כעת מסוגלים לחקור את המבנה של אגרגטים עמילואיד עם רזולוציה sub-ננומטר. אנו מראים כאן כי האינפרא אדום (IR) ננוספקטרוסקופית (AFM-IR), אשר בו מנצל את הרזולוציה הגבוהה של AFM ואת כוח הזיהוי הכימי של ספקטרוסקופיית IR, יכול ללכת רחוק יותר ולאפשר את האפיון של המאפיינים המבבניים של הפרט אגרגטים חלבוניים, ובכך מציעים תובנות על מנגנוני הצבירה. מאז הגישה שאנו מתארים ניתן ליישם גם לחקירות של אינטראקציות של הרכבות חלבון עם מולקולות ונוגדנים קטנים, זה יכול לספק מידע בסיסי כדי לפתח תרכובות טיפוליות חדשות כדי לאבחן או לטפל הפרעות ניווניות.

Introduction

מעל 40,000,000 אנשים ברחבי העולם מושפעים כיום על ידי הפרעות ניווניות, כגון אלצהיימר (AD)1 ו פרקינסון (PD)2 מחלות. באופן כללי יותר, יותר מ-50 הפתווגיות משויכים ברמה המולקולרית עם misfolding חלבון ומצבור, תהליך המוביל התפשטות של אגרגטים מסיסים חלבון fibrillar, המכונה פיקדונות עמילואיד3, 4. המקורות המולקולריים של ניוון שולי והקשרים שלה עם חלבון התאמות שינויים של חלבונים המובילים היווצרות עמילואיד, עם זאת, נשאר ברור, בחלק גדול בגלל הרמה הגבוהה של טרוגניות, הטבע ארעי ו ננו-סקאלה מידות האגרגטים הפתולוגיים4,5.

חקירות מוצלחות ביותר של מבני חלבונים בעשורים האחרונים התבססו באופן נרחב על שימוש בשיטות בצובר, כולל קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן, מיקרוסקופ הקפאה אלקטרוני וספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית5, מיכל בן 6 , מיכל סבן , בן שמונה , 9. בתוך מחלקה זו של טכניקות, אינפרא אדום (IR) ספקטרוסקופיית התפתחה ככלי אנליטי רגיש כדי לפענח את המאפיינים הכימיים של מערכות ביולוגיות כגון חלבונים8. שיטות IR מאפשרות את כימות החלבון של שינויים מבניים משני החלבונים במהלך הקיפול והצבירה שלהם. בנוסף, על מנת לפענח ברמה המיקרוסקופית את הפרטים המכניים המעורבים בנופי האנרגיה המסובכים של החלבון במהלך הצבירה שלהם, מקדמה גדולה הייתה פיתוח כלים קינטיקה כימית להרחבת מורכבות הרכבה עצמית מסלולים כולל עמילואיד סיבים היווצרות5,6,7,10,11,12. עם זאת, שיטות ספקטרוסקופיות בצובר מספקות מידע ממוצע בלבד על ההרכב הטרוגנית של מינים המצויים בפתרון או מעורב בצעדים מיקרוסקופיים מסוימים, ובכך מציג את החקירה של המאפיינים הביופיסיים של הפרט מינים צבורים מאתגרים ברמת ננו13,14.

בעשורים האחרונים הופיעו מספר טכניקות מיקרוסקופ עם יכולת הפעלה על קשקשים קטנים יותר מאשר מגבלת האור העקיפה. מחלקה זו של שיטות כוללת מיקרוסקופ אלקטרוני (EM) ומיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). בעוד סריקת אלקטרון מיקרוסקופ (SEM) ומיקרוסקופ אלקטרון הילוכים (TEM) לספק דו מימדי (2D) תמונות של הדגימה, AFM התפתחה בעשורים האחרונים כטכניקה רבת עוצמה ורב תכליתי ללמוד תלת מימדי (3D) מורפולוגיות, כמו וכמו כן המאפיינים הננו של מדגם עם רזולוציה של תת-נאנמטר13,14,15,16,17,18,19, מיכל בן 20 , מיכל בן 21 , מיכל בן 22 , מיכל בן 23 , בת 24 , מיכל בן 25 , מיכל בן 26 , 27. הרציונל מאחורי לימוד צבירת חלבונים באמצעות afm הוא שגישה זו מאפשרת את חקירת המבנה של מינים בודדים המצויים בתמיסה13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. במיוחד, על ידי ניטור המדגם כפונקציה של זמן, AFM מאפשר את חקירת האבולוציה של המבנה של המינים בתוך המדגם, מה שמאפשר לעקוב ולדמיין את המסלולים של היווצרות עמילואיד23, 25,38,39,40,41,42. יתרה מזאת, afm מאפשר כימות של פרמטרים מבניים כגון הגבהים הצולבים ואורכים של המינים הבודדים נוכח פתרון13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48. עם זאת, המחקר של נכס ביופיזיקלי יחיד, כגון מורפולוגיה, הוא לעתים קרובות לא מספיק בעת לימוד הטרוגנית מערכות ביולוגיות מורכבות. AFM, SEM או שיטות הדמיה בלבד לא לחשוף בקלות את התכונות הכימיות של מינים הטרוגנית של אגרגטים עמילואיד בסולם הננו.

מראש מרכזי לניתוח של דגימות ביולוגיות הטרוגנית בקנה מידה זה נעשה לאחרונה עם פיתוח ויישום לתחום של צבירת חלבון של ננוספקטרוסקופיה אינפרא אדום (afm-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. שיטה חדשנית זו מנצלת את השילוב של הרזולוציה המרחבית של AFM (~ 1-10 ננומטר) עם כוח הניתוח הכימי של IR. טכניקת AFM-IR מתבססת על מדידת אפקט התהודה של פוטותרמי שמונעת על ידי לייזר IR, ועל מדידת ההתרחבות התרמית של המדגם בחקירה באמצעות העצה AFM. המדגם יכול להיות מואר על ידי לייזר IR ישירות מהחלק העליון או מהחלק התחתון של השתקפות פנימית מוחלטת, בדומה כמו באמצעות ספקטרוסקופיית אינפרא אדום קונבנציונאלי24,42,52,53 . לייזר IR יכול להיות פעמו עם תדרים טיפוסיים בסדר של מאות קילוהרץ (1-1000 kHz) ומכוונים על טווח ספקטרלי רחב, בדרך כלל בין 1000-3300 ס מ-1. למרות שמקור הלייזר משתרע על שטח של בקוטר של ~ 30 יקרומטר, הרזולוציה המרחבית של טכניקת afm-IR נקבעת בהתאם לקוטר קצה afm, המזהה את התרחבות התרמית המקומית של המערכת. Afm-IR מתאים היטב לחקר דגימות ביולוגיות מכיוון שהאות האינפרא-אדום פרופורציונלי לעובי שלהם עד 1-1.5 μm, והספקטרום של האינפרא-אדום המתקבל בדרך כלל בהסכמה עם ספקטרום התמסורת התואם של ftir13,54 ,55. מסיבה זו, שיטות מבוססות ניתוח בספקטרוסקופיה ניתן להחיל בקלות, כגון המחקר של שינויים כימיים, צורת הלהקה שינוי ו-de-קונבולוציה על ידי הנגזרות השני ניתוח52. בסך הכל, שילוב הרזולוציה המרחבית של AFM עם כוח הזיהוי הכימי של ספקטרוסקופיית IR, AFM-IR מאפשר רכישה בו של מגוון רחב של תכונות מורפולוגיות, מכניות וכימיות של מדגם בסולם הננו.

כאן, אנו ממחישים פרוטוקול לאפיון התהליך של צבירת חלבונים המנצלת את השילוב של הקרינה הפלואורסצנטית מתורבת, ברזולוציה גבוהה AFM הדמיה וננו AFM-IR. גישה משולבת זו כבר הצטיין במתן תוצאות מפורטות לימוד תכונות כימיות ומבניות של מיקרו-טיפות בודדות שנוצרו על ידי אגרגטים חלבונים, במחקר של הפרדה נוזל נוזלי בשלב החלבון, וב חקירת המאפיינים טרוגניות וביופיזיים של מינים צבורים בודדים ב-ננוסקאלה23,26,38,45,50,53, 56,57.

Protocol

1. הצבירה מציינת על קוראי לוחית הזריחה

הערה: הפרוטוקול המתואר כאן הוא דוגמה לאופן הלימוד של צבירת חלבונים או פפטיד באמצעות קינטיקה כימית. בפרט, הוא מתאר פרוטוקול ממוטב לחקור את הצבירה של aβ 42 פפטיד, אשר מעורב בתחילתה והתקדמות של מחלת האלצהיימר58,59. פרוטוקול דומה יכול להיות מותאם ואימץ כלפי לימוד הצבירה של כל חלבון או פפטיד.

  1. השג פתרון monomeric טהור מאוד של Aβ 42 באמצעות יון-החליפין ואת גודל הדרה טכניקות כרומטוגרפיה כדי להבחין שברים החלבון המכיל Aβ 42, ו כדי לבודד את השבר monomeric מצורות צבורים אחרים של Aβ 42 שהתקבלו58 , 59.
  2. לדלל את Aβ 42 פפטיד ב 20 mM נתרן פוספט מאגר, 200 μM EDTA ב-pH 8.058 לריכוז הסופי הרצוי הנע בין 1-5 μm, בתוך 1.5 mL נמוך לאגד צינורות. דגימות שנאספו עבור מדידות AFM לא צריך להכיל את צבע הפלורסנט המשמשים את הצבירה מצבור (thioflavin T, ThT), כפי שהוא עשוי להציג פריטים במהלך ההצהרה לדוגמה עבור ניתוח AFM. כך, להכין מטריליטים של שני פתרונות זהים: i) הראשון המכיל monomeric Aβ 42 לבצע את תהליך הצבירה על ידי AFM; ii) השני המכיל את Aβ 42 monomeric עם תוספת של 20 μM ThT כנותב כדי לפקח על קינטיקה של צבירה.
    הערה: חשוב לבצע שלבים 1.1 ו 1.2 על קרח. הליך זה הוא להבטיח כי הפתרון monomeric Aβ 42 לא מצטבר עד שיזם את הקורא לוחית. בעת טיפול בדגימות, ליטוף זהיר הוא חיוני כדי למנוע את המבוא של בועות אוויר שעלולות להשפיע על דגימת חלבון.
  3. פיפטה 80 μL של כל מדגם בכל אחד מהתוספות של משטח הכולל 96-ובכן, חצי שטח צלחת של פוליסטירן שחור עם משטחים ברורים בתחתית ובלתי מחייב.
  4. אטום את הצלחת בנייר כסף כדי למזער את האידוי של המדגם במהלך הצבירה.
  5. הטמפרטורה של קורא הצלחות היא 37 ° c.
  6. הגדר את פרוטוקול הצבירה כדי לקרוא מדידות קרינה במרווחי זמן קבועים, באורך גל עירור של 440 ננומטר ואורך הגל של 480 ננומטר. יש לאתחל את הצבירה בתנאים השקטים.
  7. הכנס את הצלחת לתוך קורא הלוחית.
    הערה: חשוב להזהר בעת טיפול בצלחת, כדי לוודא שצבירת לא מופעלת לפני הפעלת קורא הלוחית. השתמש בהגדרות התאמת הרווח כדי להבטיח את הבדיקה המיטבית של הקרינה הפלואורסצנטית של כל דוגמה.
  8. . הפעל את המדידה
    הערה: ניסוי הצבירה מסתיים כאשר העקומה הפלואורסצנטית של ThT מגיעה לרמה58.

2. הכנה לדוגמא למדידות AFM וננו-IR

  1. הדבק באיכות הגבוהה ביותר כיתה V1 נציץ דיסק לדיסק מגנטי באיכות גבוהה פלדת אל-חלד באמצעות כרטיסיות דבק או נייר דו צדדי.
  2. מנציץ לחרוט על ידי הצבת פיסת סרט דביק על פני השטח נציץ ומשיכת את השכבה העליונה של נציץ. הליך זה יפיק משטח נקי ושטוח, מתאים לתצהיר לדוגמה.
    הערה: משטח חרוט חייב להיות אחיד וחלק.
    התראה: אין לגעת או לנשום ישירות מעל הנציץ הטרייה, שכן הדבר מציג פריטים.
  3. השהה/הפסק את מדידת קורא הצלחות כדי לאסוף את נקודת העניין של הזמן בתהליך הצבירה של החלבון.
  4. הסר את רדיד האיטום ולאסוף 10 μl סדרת מחלקים של הדגימות ללא tht מן הבאר לתוך 1.5 mL נמוך לאגד צינורות.
  5. הפקדה את 10 μL של המדגם על הנציץ החרוט טרי. עבור דגימות מדידות AFM-IR יש להפקיד על מצע זהב טרי.
  6. מודאת הפתרון על נציץ עבור 1 דקות כדי לאפשר פיזיוסורב.
    הערה: זמן דגירה ארוך יותר יאפשר ספיגה טובה יותר על פני השטח אך עשוי לגרום לארגון עצמי מלאכותי והרכבה עצמית25. כדי להימנע מהשפעות אלו, ניתן לנצל את ההצהרה בריסוס25.
  7. לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ ל של מים באולטרסאונד.
  8. יבש תחת זרם עדין של חנקן כדי למדוד את המדגם בסביבה האוויר.

3. AFM הדמיה של המבנה של אגרגטים חלבון

הערה: מדידות מורפולוגיה ניתן לבצע הן במגע והן במצב דינמי, בשלבים הבאים האחרון מתואר מאז הוא מפחית את כוחות לרוחב כדי למדוד את המבנה התלת-ממדי של המדגם עם רזולוציה גבוהה. מדידות AFM-IR יבוצעו במצב יצירת קשר כדי לשפר את היחס האות לרעש AFM-IR.

  1. הפעל את מערכת AFM לפחות 30 דקות לפני המידות כדי לאפשר למערכת להגיע ליציבות תרמית. לחץ על ההתקנה, ולאחר מכן על בדיקה. בדיקה לשנות חלון לחץ על הבא כדי להכין Z, למקד את הבמה.
  2. כבה את מתג קרן AFM (אם הוא מופעל). לבטל את נעילת מנעולים השתלב, לנתק את הראש מהמערכת ובדיקה החלון לשנות ללחוץ על הבא.
  3. הבהר את ה-AFM על מחזיק הגשוש. חבר את הראש למערכת. ותנעל את המנעולים האלה
    הערה: מנופים אופטימליים לחקר דגימות ביולוגיות במצב דינמי AFM יש קבוע האביב נע בין 2 אל 40 N-1 ו הקודקוד הפיסגה בין 2-8 ננומטר nm14.
  4. הפעל את בורר קרן לייזר afm ו בלייזר חלון ללחוץ על הבא.
  5. בחלון המוקפץ, לחץ על לא אם סוג הזיז לא השתנה. כוונן ידיות יישור אופטי כדי למצוא את הזיז. כוונן את המוקד על זיז ולחץ על הבא.
  6. בחלון המוקפץ לחץ על כן אם המוקד הוא על הזיז.
  7. הצב את קרן הלייזר בקצה הזיז בעזרת הידיות השולטות על מיקום לייזר הזיהוי. הגדל את האות הכולל שנמדד על-ידי מצלמת הצילום של ארבע הרבעים לפחות > 1 V באמצעות הידיות השולטות על מיקום קרן הלייזר המועטה על-גבי פוטודיודה תלויית המיקום (PSPD). בדיקה לשינוי חלון לחץ על הבא ולאחר מכן בקרוב.
  8. המתן 15 דקות עבור הזיז כדי להגיע ליציבות תרמית. לקרוא את המיקום של קרן לייזר הסיט על PSPD במידת הצורך.
  9. לחץ על לטאטא Ncm, לבחור משרעת הרצוי של תנודות, לחץ על שלב השימוש, לחץ על אוטומטי ולכוונן את הזיז קרוב למקסימום של תהודה חינם הראשון שלה תנודות, אשר הוא כ 300 kHz עבור זיז עם קבוע קפיץ של 40 N m-1.
    הערה: כוונון הזיז מתוך מרבית התהודה החופשית מבטיחה יציבות גבוהה יותר של המידות14.
  10. הנח את המדגם על מחזיק הדגימה. בחרו פרמטרים מתאימים להדמיה. שיעור הסריקה האופייני הוא 0.5-1.0 Hz עבור שטח סריקה של 1 x 1 יקרומטר2 עד 5 x 5 יקרומטר2. הרזולוציה האופיינית הנחוצה היא בין 256 x 256 ו 1024 x 1024 פיקסלים. לחץ על אזור סריקה כדי לבחור את גודל הסריקה ואת מספר הפיקסל.
  11. מקד את התצוגה האופטית על המדגם. לחץ על הגישה כדי לגשת למשטח הדגימה. לאחר הגישה הושלמה לחץ על המעלית 100 יקרומטר לעלות את הטיפ afm 100 יקרומטר מעל פני השטח של המדגם. לחץ על הרחב בתמונה האופטית של המדגם. לחץ על סרגל הבמה של המיקוד כדי למקד את התצוגה על פני המדגם.
  12. השתמש בחיצים כדי לנוע באזור של דגימת הריבית. לעסוק במשטח על ידי לחיצה על כפתור גישה . לחץ על לחצן סריקת קו , ובדוק אם העצה היא לאחר המשטח היטב, במידת הצורך, להתאים את נקודת Set.
  13. התחל לדמיין את משטח המדגם על-ידי לחיצה על לחצן סריקה . במהלך הדמיה, כדי למנוע כוח הדמיה גדול לשמור על עקביות בתוך דגימות עצמאיות, לשמור על משטר קבוע של שינוי שלב לא יעלה Δ20 °42.
  14. הזן שם קובץ ובחר ספריית בסיס שבה התמונה הנרכשת תישמר.

4. מדידות ננו-ספקטרוסקופית אינפרא-אדום של אגרגטים חלבוניים

  1. הפעל את מערכת AFM-IR ואת אינפרא-אדום (IR) לייזר60 30 לערך 60 דקות לפני המדידות עבור ייצוב תרמי. לייזרים טיפוסיים עבור מכשירי AFM-IR הם מרחיבים פרמטרים אופטיים (פופו) ו לייזרים הקוונטים הקוונטי (QCL).
  2. פתח את התוכנה המוכללת כדי לשלוט בכלי. לחץ על הקובץ ולאחר מכן על חדש כדי לפתוח קובץ nanoir חדש. לחץ על הלחצן המאתחל כדי להפעיל את מערכת afm-IR.
  3. פתח את כיסוי המכשיר ולטעון על מערכת AFM-IR בדיקה מצופה זהב סיליקון עם רדיוס נומינלי של 30 ננומטר וקבוע באביב של 0.2 N/m כדי למדוד את המדגם במצב קשר.
  4. לחץ על טען באגף afm מקטע ולאחר מכן הבא. בפוקוס על מקטע בדיקה לחץ על החצים כדי למקד את המצלמה על הזיז. בסעיף לדוגמה תנועה XY, השתמש בחיצים כדי למקם את הרוחב בקצה הזיז.
  5. לסובב את הידיות לשלוט על המיקום של לייזר זיהוי למקם לייזר בסוף הזיז. סובב את ידיות הלייזר כדי לזהות ולמקסם את הסכום הנמדד על-ידי מארבע הרבעים פוטודיודה לערך ≫ 3 v. סובב את כפתור הסטה כדי לכוונן את הטיה של הזיז ל-1 v ולאחר מכן לחץ על הבא. . סגור את המכסה של המכשיר
  6. במקטע מוקד במדגם השתמש בחיצים כדי למקד את המצלמה על המדגם. לאחר מכן, בסעיף לדוגמה תנועה XY להשתמש בחיצים כדי לעבור באזור העניין של המדגם ולחץ על הגישה ולעסוק.
  7. בחלון המיקרוסקופ , בחר כקלט את ערוצי הריבית כדי למפות את המאפיינים הביופיסיים של המדגם. במיוחד, לבחור גובה עבור מורפולוגיה, משרעת 2 עבור תדר IR לקליטת ו- pll למפות מדגם התהודה של יצירת קשר.
  8. במקטע הסריקה Afm של חלון הפקדים , השתמש בפרמטרים דומים כמו בסעיף 3 (כלומר, שיעור הסריקה 0.1-ל-1.0 Hz, בין 256 x 256 ו 1024 x 1024 פיקסלים). בחר כערך של הרווחים לפי החספוס לדוגמה: אינטגרל I = 1-10 ו-P פרופורציונלי = 10-30. לאחר מכן, לחץ על סריקה כדי לרכוש מפת מורפולוגיה.
    הערה: ניתן למדוד באופן דומה את המבנה במצב של הקשה דינמית, אך מדידות AFM-IR מבוצעות כאן במצב יצירת קשר כדי לקבל אות גבוה יותר ליחס הרעש.
  9. לאחר המיפוי של מורפולוגיה הוא סיים, בחלון המיקרוסקופ , לחץ על מפת הגובה כדי למקם את הגשוש על גבי צבירה אחת. לאחר מכן, במקטע Nanoir של חלון הפקדים , לחץ על התחל IR כדי להאיר את המדגם באמצעות לייזר ir.
  10. כדי למקד את לייזר אינפרא אדום על הזיז, לחץ על מיטוב. בחלון זה, כתוב מספר גל שבו המדגם הולך להיות בספיגת גבוהה ולחץ על הוסף. עבור חלבון, ערך אופייני הוא 1655 ס"מ-1. לחץ על סריקה כדי למצוא את מיקום לייזר IR ולחץ על עדכון כדי ליישר את מיקומו עם הזיז. . סגור את החלון
  11. בקטע הכללי של הננואר , כתוב במספר גל שצפוי לספיגה גבוהה בשדה היחסי. לאחר מכן, בטל את האפשרות ' העבר מסנן הלהקה ' והסתכל על הקריאה במונה ועל התמרת פורייה מהירה (FFT) של תגובת הזיז. בחלון FFT להזיז את הסמן הירוק כדי לקרוא את תדירות התהודה של הזיז. ערך אופייני של FFT של התהודה של מנופים התלויה הוא סביב 300 kHz. כתוב את ערך תדר התהודה הזה בחלק הכללי של מרכז השדה והשתמש בחלון Freq. של 50 kHz.
    הערה: בחר כוח לייזר נמוך מספיק כדי לא להרוות את הקריאה מד ולהיות עיוות בתגובת הזיז ולא לחמם את המדגם.
  12. לחץ על הדופק לייזר לכוון חלון להשתמש במצב תהודה משופרת. בחר מרכז תדר של 300 kHz, טווח כוונון של 50 kHz ו מחזור עבודה של לייזר של 5%. לחץ על לרכוש כדי לטאטא את קצב הדופק של הלייזר. באמצעות הסמן בגרף, כוונן את דופק הלייזר לתדירות התגובה המכנית של התרחבות התרמית של המדגם הסופג את אור IR. לאחר מכן, בחר באפשרות PLL כדי לנטר את התהודה של איש הקשר בין הדגימה לבין הקצה. לחצו על הלחצן ' אפס ' בחלון pll ושנתות את האפשרות לעקוב אחר התהודה של יצירת קשר עם תיאור הדגימה. לבחור רווח אינטגרלי אני = 0.5 ו לצבור פרופורציונלי P = 10. . סגור את החלון
  13. פתח שוב את חלון מיטוב ולמצוא את המיקום של לייזר IR עבור לפחות 3 מספרים המתאימים לרצועות הספיגה הגדולות של המדגם (amide להקה I-II-III) ועבור מספר גל אחד לפחות עבור כל שבב של הלייזר.
  14. לחץ על כלים | כיול רקע של IR | חדש. בחלון בחר את אזור ספקטרוסקופית הריבית (1800-1200 ס"מ-1 כדי ללמוד דגימות חלבון); לבחור את קצב הדופק אותו כפי שנקבע בשלב 4.12 ומחזור חובה של 5%; לחץ על רכישה מהירה ובחר את מהירות הלייזר, טווח אופייני עבור לייזר קוונטי בדירוג הוא בין 20 ל-500 ס"מ-1. לחץ על לרכוש כדי למדוד את רקע לייזר IR. ספקטרום הרקע הזה ישמש לנרמול ספקטרום של ננו-סקאלה מקומי. . סגור את החלון
    הערה: אם מצב משופר של לייזר ותהודה מהירה אינו זמין, דלג על שלב 4.12 ובחר באפשרות ' ספקטרום מתקדם ' במקום מהיר הן בחלונות הרקע והן בחלון הרכישה של IR . עם זאת, לא ניתן יהיה להגיע לרגישות מצטברת אחת.
  15. בהגדרות הגדרות האינפרא-אדום , בחרו רזולוציית ספקטרום ir בין 1 ל- 4 ס מ ומספר ממוצעים משותפים של לפחות 64x. לחץ על לרכוש כדי למדוד את ספקטרום הננו של IR מקומי בטווח החלבון (1800-1200 ס מ-1).
  16. כדי לרכוש מיפוי כימי של ננו-סקאלה שנפתרה, בחר באפשרות הדמיה של IR , בחר מספר גל של עניין (למשל, 1655 ס"מ-1 עבור הלהקה amide I) ולחץ על סריקה בחלון סריקת afm .
  17. לאחר השלמת המיפוי, עבור אל הקובץ ושמור את המידות. כדי לנתח את המפות הנרכשים של מורפולוגיה, יצירת קשר-תהודה וכימיה, כמו גם ספקטרום ננו המותאם לשפות אחרות, השתמש בתוכנת עיבוד תמונה AFM מובנה. ספקטרום ותמונות ניתן לשמור כקבצי csv או. axz לניתוח מפורט יותר עם תוכנה מסחרית.

5. עיבוד תמונה וניתוח ממדים חוצי חתך

  1. שטח תמונות raw14,17,19,41,42,59 באמצעות תוכנת עיבוד תמונה afm מובנית או תוכנה מסחרית.
    הערה: על האגרגטים להיות מוסתרים מהחישוב כדי להימנע מחפצי הניתוח וההערכה של הגובה הנמדד.
  2. שטחו את התמונה על-ידי 0 מישור הזמנה מתאים לחיסור.
  3. משטח את התמונה במישור ולאחר מכן שורה אחר שורה בסדררגרסיה 1 , השלב השני חוזר על עצמו עד שהקו הבסיסי בפרופיל השורה של התמונה מגיע.
  4. אם המדגם הוא צפוף מאוד, מכיל אגרגטים גבוהים במיוחד או הסורק החפץ בחרטום הוא נוכח, לשטח תמונה באמצעות 2 הסדר רגרסיה התאמה.
  5. מדידה גובה צבירה ורוחב מפרופיל קו שנלקח בניצב לציר fibril ריל14,17,19,41,42,59.
  6. מדידה באורך fibril במקביל לציר fibril ריל14,17,19,41,42,59.

תוצאות

מסלול זמן נציג של Aβ 42, כפי שנמדד על ידי שיטת הזריחה של ThT, מוצג באיור 1. תהליך הצבירה מתאפיין בדרך כלל בעקומת סיגמואידית, שבה מתבוננים בתחילה שלב השהיה, ומלווה בשלב הגדילה התלול, לפני שעקומת העקומה מגיעה לרמה כאשר המצב הקבוע של שיווי משקל מגיע ל-6,7<...

Discussion

הצעד הקריטי הראשון בפרוטוקול זה הוא הכנת חלבונים monomeric, כגון במקרה של Aβ 42 פתרון המתואר בשלבים 1.1 ו 1.2. זה חיוני כדי ליזום את תהליך הצבירה מתוך טהור מאוד, הפתרון monomeric, כמו נוכחות של oligomeric או מינים צבורים עלול לגרום היהייה ירודה של מצבור הקינטיקה58, ולגרום לחפצי אמנות afm מדידות (למש?...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

המחברים תודה הקרן הלאומית השוויצרית למדע (snf) עבור התמיכה הפיננסית (גרנט מספר P2ELP2_162116 ו P300P2_171219), מכללת דרווין, ארסמוס + תוכנית לתמיכה הפיננסית (גרנט מספר 2018-1-LT01-KA103-046719 -15400-P3) וה מחקר המוביל לתוצאות אלה קיבל מימון ממועצת המחקר האירופית תחת תוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP7/2007-2013) באמצעות מענק erc החוזה (הסכם מספר 337969), קרן ניומן (T.P.J.K.) וה מרכז קיימברידג ' למחלות מתקפלות (M.V., ו-T.P.J.K.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AFM-IR systemAnasys InstrumentsnanoIR 2 or 3Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS MicroplateCorning3881
Corning Microplate Aluminium Sealing TapeCorning6570
Double Sided Adhesive DiscsAGAR ScientificAGG3347N
FLUOstar OmegaBMG Labtech415-101Platereader
Mica Disc 10mm V1AGAR ScientificAGF7013
Park NX10 AFM systemPark SystemsN/AAtomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold ChipsPlatypus TechnologiesAU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantileversPark SystemsPPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mLEppendorf30108132
Silicon gold coated cantileversAnasys InstrumentsPR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mmAGAR ScientificAGF7001

References

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  2. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 1-21 (2017).
  3. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: A summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86, 27-68 (2017).
  5. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 384-396 (2014).
  6. Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11, 252-272 (2016).
  7. Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326, 1533-1537 (2009).
  8. Barth, A. Infrared spectroscopy of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767, 1073-1101 (2007).
  9. Fitzpatrick, A. W. P., et al. Atomic structure and hierarchical assembly of a cross- amyloid fibril. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5468-5473 (2013).
  10. Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9758-9763 (2013).
  11. Michaels, T. C. T., Lazell, H. W., Arosio, P., Knowles, T. P. J. Dynamics of protein aggregation and oligomer formation governed by secondary nucleation. Journal of Chemical Physics. 143, (2015).
  12. Šarić, A., Michaels, T. C. T., Zaccone, A., Knowles, T. P. J., Frenkel, D. Kinetics of spontaneous filament nucleation via oligomers: Insights from theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 145, 211926 (2016).
  13. Ruggeri, F. S., Habchi, J., Cerreta, A., Dietler, G. AFM-based single molecule techniques: Unraveling the amyloid pathogenic species. Current Pharmaceutical Design. 22, 3950-3970 (2016).
  14. Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Atomic force microscopy for single molecule characterisation of protein aggregation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 664, 134-138 (2019).
  15. Iljina, M., et al. Nanobodies raised against monomeric α-synuclein inhibit fibril formation and destabilize toxic oligomeric species. BMC Biology. 15, 1-14 (2017).
  16. Schilling, C., et al. Sequence-Optimized Peptide Nanofibers as Growth Stimulators for Regeneration of Peripheral Neurons. Advanced Functional Materials. 1809112, 1-15 (2019).
  17. Chiki, A., et al. Mutant exon1 huntingtin aggregation is regulated by T3 phosphorylation-induced structural changes and crosstalk between T3 phosphorylation and acetylation at K6. Angewandte Chemie - International Edition. 56, 5202-5207 (2017).
  18. Sieste, S., et al. Water-dispersible polydopamine-coated nanofibers for stimulation of neuronal growth and adhesion. Advanced Healthcare Materials. 7, 1-11 (2018).
  19. De, S., et al. Different soluble aggregates of Aβ42 can give rise to cellular toxicity through different mechanisms. Nature Communications. 10, 1541 (2019).
  20. Chang, K. C., Chiang, Y. W., Yang, C. H., Liou, J. W. Atomic force microscopy in biology and biomedicine. Tzu Chi Medical Journal. 24, 162-169 (2012).
  21. Variola, F. Atomic force microscopy in biomaterials surface science. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 2950-2959 (2015).
  22. Drolle, E., Hane, F., Lee, B., Leonenko, Z. Atomic force microscopy to study molecular mechanisms of amyloid fibril formation and toxicity in Alzheimer’s disease. Drug Metabolism Reviews. 46, 207-223 (2014).
  23. Ruggeri, F. S., et al. Identification and nanomechanical characterization of the fundamental single-strand protofilaments of amyloid α-synuclein fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7230-7235 (2018).
  24. Ruggeri, F. S., et al. Infrared nanospectroscopy characterization of oligomeric and fibrillar aggregates during amyloid formation. Nature Communications. 6, 1-9 (2015).
  25. Ruggeri, F. S., et al. Microfluidic deposition for resolving single-molecule protein architecture and heterogeneity. Nature Communications. 9, (2018).
  26. Qamar, S., et al. FUS phase peparation is modulated by a molecular chaperone and methylation of arginine cation-π interactions. Cell. 173, 720-734 (2018).
  27. Habchi, J., et al. Cholesterol catalyses Aβ42 aggregation through a heterogeneous nucleation pathway in the presence of lipid membranes. Nature Chemistry. 10, 673-683 (2018).
  28. Sweers, K. K. M., Stöckl, M., Bennink, M. L., Subramaniam, V., Uversky, V. N., Lyubchenko, Y. L. Characterizing nanoscale morphologic and mechanical properties of α-Synuclein amyloid fibrils with atomic force microscopy. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding & Aggregation. , 309-322 (2014).
  29. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly Insights from scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 173, 1-13 (2011).
  30. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Devlin, G. L., Dobson, C. M., Welland, M. E. Analysis of structural order in amyloid fibrils. Nanotechnology. 18, (2007).
  31. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. , 6546-6561 (2016).
  32. Knowles, T. P. J., Oppenheim, T. W., Buell, A. K., Chirgadze, D. Y., Welland, M. E. Nanostructured films from hierarchical self-assembly of amyloidogenic proteins. Nature Nanotechnology. 5, 204-207 (2010).
  33. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Craig, A., Dobson, C. M., Welland, M. E. Spatial persistence of angular correlations in amyloid fibrils. Physical Review Letters. 96, 1-4 (2006).
  34. Knowles, T. P. J., et al. Twisting transition between crystalline and fibrillar phases of aggregated peptides. Physical Review Letters. 109, 158101 (2012).
  35. Knowles, T. P., et al. Role of intermolecular forces in defining material properties of protein nanofibrils. Science. 318, 1900-1903 (2007).
  36. Smith, J. F., Knowles, T. P. J., Dobson, C. M., MacPhee, C. E., Welland, M. E. Characterization of the nanoscale properties of individual amyloid fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 15806-15811 (2006).
  37. Sokolov, D. V. Atomic force microscopy for protein nanotechnology. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 300, 323-367 (2013).
  38. Ruggeri, F. S., et al. Influence of the β-sheet content on the mechanical properties of aggregates during amyloid fibrillization. Angewandte Chemie - International Edition. 54, 2462-2466 (2015).
  39. Jeong, J. S., Ansaloni, A., Mezzenga, R., Lashuel, H. A., Dietler, G. Novel mechanistic insight into the molecular basis of amyloid polymorphism and secondary nucleation during amyloid formation. Journal of Molecular Biology. 425, 1765-1781 (2013).
  40. Adamcik, J., Mezzenga, R. Study of amyloid fibrils via atomic force microscopy. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 17, 369-376 (2012).
  41. Deguire, S. M., et al. N-terminal huntingtin (Htt) phosphorylation is a molecular switch regulating Htt aggregation, helical conformation, internalization, and nuclear targeting. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
  42. Ruggeri, F. S., et al. Nanoscale studies link amyloid maturity with polyglutamine diseases onset. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  43. Adamcik, J., et al. Understanding amyloid aggregation by statistical analysis of atomic force microscopy images. Nature Nanotechnology. 5, 423-428 (2010).
  44. Lin, Y. C., Komatsu, H., Ma, J., Axelsen, P. H., Fakhraai, Z. Quantitative analysis of amyloid polymorphism using height histograms to correct for tip convolution effects in atomic force microscopy imaging. RSC Advances. 6, 114286-114295 (2016).
  45. Mannini, B., et al. Stabilization and characterization of cytotoxic Aβ40 oligomers isolated from an aggregation reaction in the presence of zinc ions. ACS Chemical Neuroscience. , (2018).
  46. Medalsy, I., Hensen, U., Muller, D. J. Imaging and quantifying chemical and physical properties of native proteins at molecular resolution by force-volume AFM. Angewandte Chemie - International Edition. 50, 12103-12108 (2011).
  47. Dufrêne, Y. F., Martínez-Martín, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Müller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve–based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
  48. Takai, E., et al. Scanning electron microscope imaging of amyloid fibrils. American Journal of Biochemistry and Biotechnology. 10, 31-39 (2014).
  49. Dazzi, A., et al. AFM-IR: Combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Applied Spectroscopy. 66, 1365-1384 (2012).
  50. Volpatti, L. R., et al. Micro- and nanoscale hierarchical structure of core-shell protein microgels. Journal of Materials Chemistry B. 4, 7989-7999 (2016).
  51. Galante, D., et al. A critical concentration of N-terminal pyroglutamylated amyloid beta drives the misfolding of Ab1-42 into more toxic aggregates. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 79, 261-270 (2016).
  52. Ruggeri, F. S., et al. Identification of oxidative stress in red blood cells with nanoscale chemical resolution by infrared nanospectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 19, 1-14 (2018).
  53. Ramer, G., Ruggeri, F. S., Levin, A., Knowles, T. P. J., Centrone, A. Determination of polypeptide conformation with nanoscale resolution in water. ACS Nano. 12 (7), 6612-6619 (2018).
  54. Dazzi, A., Prater, C. B. AFM-IR: Technology and applications in nanoscale infrared spectroscopy and chemical imaging. Chemical Reviews. 117, 5146-5173 (2017).
  55. Lahiri, B., Holland, G., Centrone, A. Chemical imaging beyond the diffraction limit: experimental validation of the PTIR technique. Small. 9 (3), 439-445 (2013).
  56. Ansaloni, A., et al. One-pot semisynthesis of exon 1 of the huntingtin protein: New tools for elucidating the role of posttranslational modifications in the pathogenesis of Huntington’s disease. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (7), 1928-1933 (2014).
  57. Khalaf, O., et al. The H50Q mutation enhances α-synuclein aggregation, secretion, and toxicity. Journal of Biological Chemistry. 289, 21856-21876 (2014).
  58. Hellstrand, E., Boland, B., Walsh, D. M., Linse, S. Amyloid β-protein aggregation produces highly reproducible kinetic data and occurs by a two-phase process. ACS Chemical Neuroscience. 1, 13-18 (2010).
  59. Limbocker, R., et al. Trodusquemine enhances Aβ42 aggregation but suppresses its toxicity by displacing oligomers from cell membranes. Nature Communications. 10 (1), 225 (2019).
  60. Lu, F., Belkin, M. A. Infrared absorption nano-spectroscopy using sample photoexpansion induced by tunable quantum cascade lasers. Optics Express. 19, 1902-1904 (2011).
  61. Jiao, Y., Schäffer, T. E. Accurate height and volume measurements on soft samples with the atomic force microscope. Langmuir. 20, 10038-10045 (2004).
  62. Müller, D. J., Engel, A. The height of biomolecules measured with the atomic force microscope depends on electrostatic interactions. Biophysical Journal. 73, 1633-1644 (1997).
  63. Heymann, J. B., Moller, C., Muller, D. J. Sampling effects influence heights measured with atomic force microscopy. Journal Of Microscopy-Oxford. 207, 43-51 (2002).
  64. Marinello, F., Balcon, M., Schiavuta, P., Carmignato, S., Savio, E. Thermal drift study on different commercial scanning probe microscopes during the initial warming-up phase. Measurement Science and Technology. 22, 9 (2011).
  65. Marinello, F., Bariani, P., De Chiffre, L., Savio, E. Fast technique for AFM vertical drift compensation. Measurement Science and Technology. 18, 689-696 (2007).
  66. Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in AFM imaging (Clifton, N.J.). Methods in Molecular Biology. 242, 25-27 (2004).
  67. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C., Braga, P. C., Ricci, D. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research. 736, 31-43 (2011).
  68. Marinello, F., Carmignato, S., Voltan, A., Savio, E., De Chiffre, L. Error Sources in Atomic Force Microscopy for Dimensional Measurements: Taxonomy and Modeling. Journal of Manufacturing Science and Engineering. 132, 030903 (2010).
  69. Ukraintsev, E., Kromka, A., Kozak, H., Reme, Z., Rezek, B., Frewin, C. L. Artifacts in Atomic Force Microscopy of Biological Samples. Atomic Force Microscopy Investigations into Biology - From Cell to Protein. , (2012).
  70. Tsukruk, V. V., Singamaneni, S. . Scanning Probe Microscopy of Soft Matter: Fundamentals and Practices. , (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

151

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved