JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Describimos la aplicación de nanoespectroscopia infrarroja y microscopía de fuerza atómica de alta resolución para visualizar el proceso de autoensamblaje de proteínas en agregados oligoméricos y fibrillas amiloideas, que está estrechamente asociada con el inicio y desarrollo de una amplia gama de trastornos neurodegenerativos humanos.

Resumen

El fenómeno del desdoblamiento de proteínas y la agregación da como resultado la formación de agregados proteicos altamente heterogéneos, que se asocian con condiciones neurodegenerativas como el Alzheimer y las enfermedades de Parkinson. En particular, los agregados de bajo peso molecular, oligómeros amiloide, han demostrado poseer propiedades citotóxicas genéricas y están implicados como neurotoxinas en muchas formas de demencia. Ilustramos el uso de métodos basados en la microscopía de fuerza atómica (AFM) para abordar la difícil tarea de caracterizar las propiedades morfológicas, estructurales y químicas de estos agregados, que son difíciles de estudiar utilizando la estructura convencional métodos biofísicos a granel debido a su heterogeneidad y naturaleza transitoria. Los enfoques de microscopía de sonda de escaneo ahora son capaces de investigar la morfología de los agregados amiloide con resolución subnanómetro. Aquí mostramos que la nanoespectroscopia infrarroja (IR) (AFM-IR), que explota simultáneamente la alta resolución de AFM y el poder de reconocimiento químico de la espectroscopia IR, puede ir más allá y permitir la caracterización de las propiedades estructurales de proteínas y, por lo tanto, ofrecen información sobre los mecanismos de agregación. Dado que el enfoque que describimos se puede aplicar también a las investigaciones de las interacciones de los conjuntos de proteínas con moléculas pequeñas y anticuerpos, puede proporcionar información fundamental para desarrollar nuevos compuestos terapéuticos para diagnosticar o tratar trastornos neurodegenerativos.

Introducción

Más de 40 millones de personas en todo el mundo se ven afectadas actualmente por trastornos neurodegenerativos, como el Alzheimer (AD)1 y las enfermedades de Parkinson (PD)2. En términos más generales, más de cincuenta patologías se asocian a nivel molecular con el desdoblamiento y la agregación de proteínas, un proceso que conduce a la proliferación de agregados de proteínas fibrilares insolubles, conocidos como depósitos amiloide3, 4. Los orígenes moleculares de la neurodegeneración y sus vínculos con los cambios conformacionales proteicos de las proteínas que conducen a la formación de amiloide, sin embargo, siguen sin estar claros, en gran parte debido al alto nivel de heterogeneidad, naturaleza transitoria y nanoescala dimensiones de los agregados patológicos4,5.

Investigaciones de gran éxito de las estructuras proteicas en las últimas décadas se han basado ampliamente en el uso de métodos a granel, incluyendo cristalografía de rayos X, microscopía crioelectrónica y espectroscopia de resonancia magnética nuclear5, 6 , 7 , 8 , 9. Dentro de esta clase de técnicas, la espectroscopia infrarroja (IR) ha surgido como una herramienta analítica sensible para desentrañar las propiedades químicas de sistemas biológicos como las proteínas8. Los métodos IR permiten cuantificar los cambios estructurales secundarios y cuaternarios de proteínas durante su desdoblamiento y agregación. Además, con el fin de descifrar aún más a nivel microscópico los detalles mecanicistas involucrados en los complejos paisajes de energía libre de proteínas durante su agregación, un avance importante ha sido el desarrollo de herramientas químicas cinéticas para extender a caminos de autoensamblaje incluyendo la formación de fibrillas amiloideas5,6,7,10,11,12. Sin embargo, los métodos espectroscópicos a granel proporcionan sólo información media sobre el conjunto heterogéneo de especies presentes en la solución o involucradas en pasos microscópicos específicos, lo que hace que la investigación de las propiedades biofísicas de especies agregadas desafiantes en el nivel de nanoescala13,14.

Varias técnicas de microscopía con la capacidad de operar en escalas más pequeñas que el límite de difracción de luz han surgido en las últimas décadas. Esta clase de métodos incluye microscopía electrónica (EM) y microscopía de fuerza atómica (AFM). Mientras que la microscopía electrónica de barrido (SEM) y la microscopía electrónica de transmisión (TEM) proporcionan imágenes bidimensionales (2D) de una muestra, AFM ha surgido en las últimas décadas como una técnica poderosa y versátil para estudiar morfologías tridimensionales (3D), como morfologías tridimensionales (3D), como así como las propiedades nanomecánicas de una muestra con resolución subnanómetro13,14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. La razón de ser del estudio de la agregación de proteínas a través de AFM es que este enfoque permite la investigación de la morfología de las especies individuales presentes en la solución13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. En particular, mediante el seguimiento de la muestra en función del tiempo, AFM permite la investigación de la evolución de la morfología de la especie dentro de la muestra, lo que permite seguir y visualizar las vías de formación de amiloide23, 25,38,39,40,41,42. Además, AFM permite la cuantificación de parámetros estructurales como las alturas transversales y longitudes de las especies individuales presentes en la solución13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48. Sin embargo, el estudio de una sola propiedad biofísica, como la morfología, a menudo no es suficiente cuando se estudian sistemas biológicos heterogéneos y complejos. Los métodos de imágenes AFM, SEM o TEM por sí solos no revelan fácilmente las propiedades químicas de las especies heterogéneas de agregados amiloide a nanoescala.

Recientemente se ha realizado un importante avance para el análisis de muestras biológicas heterogéneas a esta escala con el desarrollo y la aplicación en el campo de la agregación proteica de la nanoespectroscopia infrarroja (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. Este innovador método aprovecha la combinación de la resolución espacial de AFM (1 x 10 nm) con el poder de análisis químico de IR. La técnica AFM-IR se basa en la medición del efecto de resonancia inducida fototérmica impulsada por un láser IR, y en la medición de la expansión térmica de la muestra bajo investigación por la punta del AFM. La muestra puede ser iluminada por el láser IR directamente desde la parte superior o desde la parte inferior en la reflexión interna total, de forma similar a la de la espectroscopia infrarroja convencional24,42,52,53 . El láser IR se puede pulsada con frecuencias típicas en el orden de cientos de kilohercios (1-1000 kHz) y sintonizado en un amplio rango espectral, típicamente entre 1000-3300 cm-1. Aunque la fuente láser cubre un área de 30 m de diámetro, la resolución espacial de la técnica AFM-IR está determinada nominalmente por el diámetro de la punta AFM, que detecta la expansión térmica local del sistema. AFM-IR es muy adecuado para estudiar muestras biológicas porque la señal IR es proporcional a su espesor de hasta 1 x 1,5 m, y los espectros IR resultantes son generalmente de acuerdo con los espectros de transmisión FTIR correspondientes13,54 ,55. Por esta razón, los métodos establecidos de análisis en espectroscopia se pueden aplicar fácilmente, como el estudio de los cambios químicos, el cambio de forma de la banda y la desconvolución mediante el análisis de derivados segundo52. En general, combinando la resolución espacial de AFM con el poder de reconocimiento químico de la espectroscopia IR, AFM-IR permite la adquisición simultánea de una amplia gama de propiedades morfológicas, mecánicas y químicas de una muestra a nanoescala.

Aquí, ilustramos un protocolo para la caracterización del proceso de agregación de proteínas que explota la combinación de ensayos de fluorescencia in vitro, imágenes AFM de alta resolución y AFM-IR a nanoescala. Este enfoque combinado ya ha sobresalido en proporcionar resultados detallados en el estudio de las propiedades químicas y estructurales de las microgotas individuales formadas por agregados proteicos, en el estudio de la separación de fase sin proteínas líquidas y líquidas, y en investigando la heterogeneidad y las propiedades biofísicas de las especies agregadas individuales a la nanoescala23,26,38,45,50,53, 56,57.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Ensayos de agregación en lectores de placas de fluorescencia

NOTA: El protocolo descrito aquí es un ejemplo de cómo estudiar la agregación de cualquier proteína o péptido por cinética química. En particular, describe un protocolo optimizado para estudiar la agregación del péptido A-42, que participa en la aparición y progresión de la enfermedad de Alzheimer58,59. Un protocolo similar puede ser ajustado y adoptado para estudiar la agregación de cualquier proteína o péptido.

  1. Obtener una solución monomérica altamente pura de A-42 a través de técnicas de cromatografía de intercambio iónico y de exclusión de tamaño para distinguir las fracciones proteicas que contienen A-42, y para aislar la fracción monomérica de otras formas agregadas de A-42 obtenidas58 , 59.
  2. Diluir el péptido A-42 en tampón de fosfato sódico de 20 mM, 200 m de EDTA a pH 8,058 a una concentración final deseada que oscila entre 1 x 5 m, en tubos de baja unión de 1,5 ml. Las muestras recogidas para las mediciones de AFM no deben contener el tinte fluorescente utilizado en el ensayo de agregación (thioflavin T, ThT), ya que podría introducir artefactos durante la deposición de la muestra para el análisis de AFM. Por lo tanto, preparar los triplicados de dos soluciones idénticas: i) la primera que contiene A-42 monomérico para seguir el proceso de agregación por AFM; ii) el segundo que contiene el A-42 monomérico con adición de 20 M ThT como trazador para monitorear la cinética de la agregación.
    NOTA: Es importante realizar los pasos 1.1 y 1.2 sobre hielo. Este procedimiento es para asegurarse de que la solución monomérica A-42 no se agrega hasta que se inicie en el lector de placas. Al manipular muestras, el pipeteo cuidadoso es esencial para evitar la introducción de burbujas de aire que puedan afectar a la muestra de proteínas.
  3. Pipetear 80 l de cada muestra en cada pocal de una placa de 96 pocillos y media superficie de poliestireno negro con superficies de fondo transparente y no vinculantes.
  4. Sellar la placa con una lámina para minimizar la evaporación de la muestra en el transcurso de la agregación.
  5. Equilibrar la temperatura del lector de placas a 37oC.
  6. Configurar el protocolo de agregación para leer mediciones de fluorescencia a intervalos de tiempo fijos, a una longitud de onda de excitación de 440 nm y una longitud de onda de emisión de 480 nm. La agregación debe iniciarse en condiciones de reposo.
  7. Inserte la placa en el lector de placas.
    NOTA: Es importante tener cuidado al manipular la placa, para asegurarse de que la agregación no se activa antes de iniciar el lector de placas. Utilice los ajustes de ajuste de ganancia para garantizar la lectura óptima de la fluorescencia de cada muestra.
  8. Inicie la medición.
    NOTA: El experimento de agregación concluye cuando la curva sigmoidal de fluorescencia ThT alcanza una meseta58.

2. Preparación de muestras para mediciones de AFM y nano-IR

  1. Pegue el disco de mica V1 de grado de alta calidad al disco magnético de acero inoxidable de alta calidad utilizando pestañas adhesivas o cinta adhesiva de doble cara.
  2. Etch mica colocando un trozo de cinta adhesiva en la superficie de la mica y tirando de la capa superior de la mica. Este procedimiento producirá una superficie limpia, atómicamente plana, adecuada para la deposición de la muestra.
    NOTA: La superficie grabada debe ser uniforme y lisa.
    ADVERTENCIA: No toque ni respire directamente sobre la mica recién grabada, ya que esto introducirá artefactos.
  3. Pausar/detener la medición del lector de placas para recoger el punto de tiempo de interés durante el proceso de agregación de la proteína.
  4. Retire la lámina de sellado y recoja la alícuota de 10 ml de las muestras sin ThT del pozo en tubos de baja unión de 1,5 ml.
  5. Deposite los 10 s de la muestra en la mica recién grabada. Para las mediciones AFM-IR, las muestras deben depositarse en sustratos de oro recién despojados.
  6. Incubar la solución en la mica durante 1 min para permitir la fisisorbción.
    NOTA: Un tiempo de incubación más largo permitiría una mejor absorción en la superficie, pero puede inducir la autoorganización artificial y el autoensamblaje25. Para evitar estos efectos, la deposición por pulverización puede ser explotada25.
  7. Enjuagar tres veces con 1 ml de agua ultrapura.
  8. Secar bajo un suave flujo de nitrógeno para medir la muestra en el ambiente del aire.

3. Imágenes AFM de la morfología de los agregados proteicos

NOTA: Las mediciones de morfología se pueden realizar tanto en modo de contacto como dinámico, en los pasos siguientes se describe este último ya que reduce las fuerzas laterales para medir la morfología 3D de la muestra con alta resolución. Las mediciones AFM-IR se realizarán en modo de contacto para mejorar la relación señal-ruido AFM-IR.

  1. Encienda el sistema AFM al menos 30 minutos antes de las mediciones para permitir que el sistema alcance la estabilidad térmica. Haga clic en Configuracióny, a continuación, en Sondeo. En la ventana Cambio de sonda haga clic en Siguiente para preparar Z, Etapa de enfoque.
  2. Apague el interruptor de haz AFM (si está encendido). Desbloquee los bloqueos de cola de milano, desconecte la cabeza del sistema y en la ventana Cambio de sonda haga clic en Siguiente.
  3. Monte el voladizo AFM en el soporte de la sonda. Conecte la cabeza al sistema y bloquee los bloqueos de cola de milano.
    NOTA: Los voladizos óptimos para estudiar muestras biológicas en modo dinámico AFM tienen constante de resorte que oscila entre 2 x 40 N m-1 y radios de ápice que oscilan entre 2 x 8 nm14.
  4. Encienda el interruptor de haz láser AFM y en la ventana Cambio de sonda haga clic en Siguiente.
  5. En la ventana emergente haga clic en No si el tipo de voladizo no ha cambiado. Ajuste las perillas de alineación óptica para encontrar el voladizo. Ajuste el enfoque en el voladizo y haga clic en Siguiente.
  6. En la ventana emergente haga clic en Sí si el foco está en el voladizo.
  7. Coloque el rayo láser al final del voladizo utilizando las perillas que controlan la posición del láser de detección. Maximice la señal total medida por el fotodiodo de cuatro cuadrantes a por lo menos >1 V utilizando las perillas que controlan la posición del rayo láser desviado en el fotodiodo sensible a la posición (PSPD). En la ventana Cambio de sonda haga clic en Siguiente y luego en Cerrar.
  8. Espere 15 minutos hasta que el voladizo alcance la estabilidad térmica. Reajuste la posición del rayo láser desviado en el PSPD si es necesario.
  9. Haga clic en NCM SWEEP,elija la amplitud deseada de la oscilación, haga clic en Usar fase,haga clic en auto y ajuste el voladizo cerca del máximo de su primera resonancia libre de oscilación, que es de aproximadamente 300 kHz para un voladizo con una constante de resorte de 40 N m-1.
    NOTA: Ajustar el voladizo fuera del máximo de su resonancia libre asegura una mayor estabilidad de las mediciones14.
  10. Coloque la muestra en el soporte de la muestra. Elija los parámetros de imagen adecuados. La velocidad de escaneo típica es de 0,3 a 1,0 Hz para un área de escaneado de 1 x 1 m2 a 5 x 5 m2. La resolución típica necesaria es entre 256 x 256 y 1024 x 1024 píxeles. Haga clic en Scan Area (Zona de escaneado) para elegir el tamaño del escaneado y el número de píxel.
  11. Enfoque la vista óptica en la muestra. Haga clic en Acercarse para acercarse a la superficie de muestra. Una vez que se haya completado el enfoque, haga clic en Levantar 100 m para elevar la punta de AFM 100 m por encima de la superficie de la muestra. Haga clic en Expandir en la imagen óptica de la muestra. Haga clic en la barra Desenfoque del escenario para centrar la vista en la superficie de la muestra.
  12. Utilice las flechas para desplazarse por la región de la muestra de interés. Encienda la superficie pulsando el botón Enfoque. Haga clic en el botón Escaneo de línea y compruebe si la punta está siguiendo bien la superficie, si es necesario, ajuste el Punto de Ajuste.
  13. Comience a tomar imágenes de la superficie de la muestra pulsando el botón Escanear. Durante la toma de imágenes, para evitar una gran fuerza de imagen y mantener la consistencia de las muestras independientes, mantenga un régimen constante de cambio de fase que no supere los 20o42.
  14. Escriba el nombre del archivo y elija el directorio base donde se guardará la imagen adquirida.

4. Mediciones de nanoespectroscopia infrarroja de agregados proteicos

  1. Encienda el sistema AFM-IR y el láser infrarrojo (IR)60 30-60 min antes de las mediciones para la estabilización térmica. Los láseres típicos para los instrumentos AFM-IR son osciladores de parámetros ópticos (OPO) y láseres de cascada cuántica (QCL).
  2. Abra el software incorporado para controlar el instrumento. Haga clic en el archivo y luego en nuevo para abrir un nuevo archivo nanoIR. Pulse el botón inicializar para iniciar el sistema AFM-IR.
  3. Abra la cubierta del instrumento y monte en el sistema AFM-IR una sonda recubierta de oro de silicio con un radio nominal de 30 nm y una constante de resorte de 0,2 N/m para medir la muestra en modo de contacto.
  4. Haga clic en Cargar en la sección Sonda AFM y luego en siguiente. En foco en la sección de la sonda haga clic en las flechas para enfocar la cámara en el voladizo. En la sección Movimiento XYde la muestra , utilice las flechas para colocar el aire cruzado al final del voladizo.
  5. Gire las perillas que controlan la posición del láser de detección para colocar el láser al final del voladizo. Gire las perillas láser para detectar y maximizar la suma medida por el fotodiodo de cuatro cuadrantes a un valor > 3 V. Gire la perilla de desviación para ajustar la desviación del voladizo a -1 V y luego haga clic en siguiente. Cierre la cubierta del instrumento.
  6. En la sección, el foco en la muestra, utilice las flechas para enfocar la cámara en la muestra. A continuación, en la sección de muestra Movimiento XY utilice las flechas para moverse en la región de interés de la muestra y haga clic en acercarse y participar.
  7. En la ventana del microscopio seleccione como entradas los canales de interés para asignar las propiedades biofísicas de la muestra. En particular, elija la altura para la morfología, la amplitud 2 para la absorción iral y la frecuencia PLL para mapear la resonancia de contacto de la muestra de punta.
  8. En la sección de escaneo AFM de la ventana de controles, utilice parámetros similares a los de la sección 3 (es decir, velocidad de escaneo 0,1 a 1,0 Hz, entre 256 x 256 y 1024 x 1024 píxeles). Elija como valor de las ganancias de acuerdo con la rugosidad de la muestra: Integral I - 1-10 y P proporcional a 10-30. A continuación, haga clic en escanear para adquirir un mapa de morfología.
    NOTA: La morfología se puede medir de forma similar en el modo de roscado dinámico, pero las mediciones AFM-IR se realizan aquí en el modo de contacto para tener relaciones señal/ruido más altas.
  9. Una vez finalizada la cartografía de la morfología, en la ventana del microscopio, haga clic en el mapa de altura para colocar la sonda en la parte superior de un agregado. A continuación, en la sección nanoIR de la ventana de controles, haga clic en iniciar IR para iluminar la muestra con el láser IR.
  10. Para enfocar el láser infrarrojo en el voladizo, haga clic en la optimización. En esta ventana, escriba un número de onda donde la muestra va a tener alta absorbancia y haga clic en agregar. Para la proteína, un valor típico es 1655 cm-1. Haga clic en escanear para encontrar la posición del láser IR y haga clic en actualizar para alinear su posición con el voladizo. Cierre la ventana.
  11. En la sección general de la configuración de nanoIR, escriba un número de onda donde se espera una alta absorbancia en el campo relativo. A continuación, desactive la opción Filtro de paso de banda y mire la lectura del medidor y la transformación rápida de Fourier (FFT) de la respuesta en voladizo. En la ventana FFT mueva el cursor verde para leer la frecuencia de resonancia del voladizo. Un valor típico de la FFT de la resonancia de los voladizos es de alrededor de 300 kHz. Escriba este valor de frecuencia de resonancia en la sección general del campo central freq. y utilice una ventana de frecuencia de 50 kHz.
    NOTA: Seleccione una potencia láser lo suficientemente baja como para no saturar la lectura del medidor y para tener distorsión en la respuesta en voladizo y no sobrecalentar la muestra.
  12. Haga clic en la ventana de sintonización de pulsos láser para utilizar el modo de resonancia mejorada. Elija un centro de frecuencia de 300 kHz, un rango de sintonía de 50 kHz y un ciclo de trabajo del láser del 5%. Haga clic en adquirir para barrer la frecuencia de pulso del láser. Mediante el uso del cursor en el gráfico, ajuste el pulso láser a la frecuencia de la respuesta mecánica de la expansión térmica de la muestra absorbiendo la luz IR. A continuación, seleccione la opción PLL para supervisar la resonancia de contacto entre la muestra y la punta. Pulse el botón cero en la ventana PLL y marque enable para realizar un seguimiento de la resonancia de contacto de la punta de muestra. Elija una ganancia integral I a 0,5 y una ganancia proporcional P a 10. Cierre la ventana.
  13. Abra de nuevo la ventana de optimización y encuentre la posición del láser IR para al menos 3 números de onda correspondientes a las principales bandas de absorción de la muestra (banda de amida I-II-III) y para al menos un número de onda para cada chip del láser.
  14. Haga clic en Herramientas ( Tools) Calibración de fondo IR (IR Background Calibration) Nuevo. En la ventana seleccione la región espectroscópica de interés (1800-1200 cm-1 para estudiar muestras de proteínas); elegir la misma frecuencia de pulso según lo determinado en el paso 4.12 y un ciclo de trabajo del 5%; haga clic en la adquisición rápida y seleccione la velocidad del láser, rango típico para un láser de cascada cuántica está entre 20 x 500 cm-1. Haga clic en adquirir para medir el fondo del láser IR. Este espectro de fondo se utilizará para la normalización de espectros localizados medidos a nanoescala. Cierre la ventana.
    NOTA: Si un modo de láser rápido y resonancia mejorada no está disponible, omita el paso 4.12 y seleccione espectros escalonados en lugar de rápido en las ventanas de adquisición de espectros de fondo e IR. Sin embargo, no se alcanzará la sensibilidad agregada única.
  15. En los ajustes de espectros IR, elija una resolución de espectro IR entre 1 x 4 cm-1 y un número de copromedioes de al menos 64x. Haga clic en adquirir para medir un espectro IR localizado a nanoescala en el rango de proteínas (1800-1200 cm-1).
  16. Para adquirir un mapa químico resuelto a nanoescala, seleccione la opción de imágenes IR, elija un número de onda de interés (por ejemplo, 1655 cm-1 para la banda de amida I) y haga clic en escanear en la ventana de exploración AFM.
  17. Una vez completada la asignación, vaya al archivo y guarde las medidas. Para analizar los mapas adquiridos de morfología, resonancia de contacto y química, así como los espectros localizados a nanoescala, utilice el software de procesamiento de imágenes AFM incorporado. Spectra e Images se pueden guardar como archivos .csv o .axz para un análisis más detallado con software comercial.

5. Procesamiento y análisis de imágenes de dimensiones transversales

  1. Aplanar imágenes en bruto14,17,19,41,42,59 utilizando software de procesamiento de imágenes AFM incorporado o software comercial.
    NOTA: Los agregados deben enmascararse del cálculo para evitar artefactos de análisis y subestimación de su altura medida.
  2. Aplanar la imagen por 0 orden plano ajuste de resta.
  3. Aplanar la imagen por plano y, a continuación, línea por línea en un orden de regresión de1o, el segundo paso se repite hasta que se alcanza la línea base plana en el perfil de línea de la imagen.
  4. Si la muestra está muy concurrida, contiene agregados excepcionalmente altos o el artefacto de arco del escáner está presente, aplanar la imagen usando2nd regression order fit.
  5. Mida la altura y la anchura agregadas a partir de un perfil de línea perpendicular al eje fibril14,17,19,41,42,59.
  6. Mida la longitud de fibrilación paralela al eje fibril14,17,19,41,42,59.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

En la Figura 1se muestra un curso de tiempo representativo de la agregación A-42, medido por el ensayo de fluorescencia ThT. El proceso de agregación se caracteriza comúnmente por una curva sigmoidal, donde se observa inicialmente una fase de retraso, y es seguida por una fase de crecimiento pronunciada, antes de que la curva alcance una meseta cuando se alcanza un estado estacionario de equilibrio6,7 ,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

El primer paso crítico en este protocolo es la preparación de proteínas monoméricas, como en el caso de la solución A-42 descrita en los pasos 1.1 y 1.2. Es esencial iniciar el proceso de agregación a partir de una solución monomérica altamente pura, ya que la presencia de especies oligoméricas o agregadas puede dar lugar a una mala reproducibilidad de la cinética de agregación58,e inducir artefactos en el AFM medidas (por ejemplo, especies fibrilares serán evidentes en las etapas inic...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Swiss National Foundation for Science (SNF) el apoyo financiero (número de subvención P2ELP2_162116 y P300P2_171219), el Darwin College, el programa Erasmus+ para el apoyo financiero (número de subvención 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) y el programa de apoyo financiero (número de subvención 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) y el programa de subvención la investigación que ha dado lugar a estos resultados ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación en el marco del Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (7PM/2007-2013) a través de la beca PhysProt (acuerdo número 337969), la Fundación Newman (T.P.J.K.) y La Beca PhysProt (acuerdo número 337969), la Fundación Newman (T.P.J.K.) y La Centro de Cambridge para Enfermedades deSdoblamiento (C.G., M.V. y T.P.J.K.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AFM-IR systemAnasys InstrumentsnanoIR 2 or 3Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS MicroplateCorning3881
Corning Microplate Aluminium Sealing TapeCorning6570
Double Sided Adhesive DiscsAGAR ScientificAGG3347N
FLUOstar OmegaBMG Labtech415-101Platereader
Mica Disc 10mm V1AGAR ScientificAGF7013
Park NX10 AFM systemPark SystemsN/AAtomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold ChipsPlatypus TechnologiesAU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantileversPark SystemsPPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mLEppendorf30108132
Silicon gold coated cantileversAnasys InstrumentsPR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mmAGAR ScientificAGF7001

Referencias

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  2. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 1-21 (2017).
  3. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: A summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86, 27-68 (2017).
  5. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 384-396 (2014).
  6. Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11, 252-272 (2016).
  7. Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326, 1533-1537 (2009).
  8. Barth, A. Infrared spectroscopy of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767, 1073-1101 (2007).
  9. Fitzpatrick, A. W. P., et al. Atomic structure and hierarchical assembly of a cross- amyloid fibril. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5468-5473 (2013).
  10. Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9758-9763 (2013).
  11. Michaels, T. C. T., Lazell, H. W., Arosio, P., Knowles, T. P. J. Dynamics of protein aggregation and oligomer formation governed by secondary nucleation. Journal of Chemical Physics. 143, (2015).
  12. Šarić, A., Michaels, T. C. T., Zaccone, A., Knowles, T. P. J., Frenkel, D. Kinetics of spontaneous filament nucleation via oligomers: Insights from theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 145, 211926(2016).
  13. Ruggeri, F. S., Habchi, J., Cerreta, A., Dietler, G. AFM-based single molecule techniques: Unraveling the amyloid pathogenic species. Current Pharmaceutical Design. 22, 3950-3970 (2016).
  14. Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Atomic force microscopy for single molecule characterisation of protein aggregation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 664, 134-138 (2019).
  15. Iljina, M., et al. Nanobodies raised against monomeric α-synuclein inhibit fibril formation and destabilize toxic oligomeric species. BMC Biology. 15, 1-14 (2017).
  16. Schilling, C., et al. Sequence-Optimized Peptide Nanofibers as Growth Stimulators for Regeneration of Peripheral Neurons. Advanced Functional Materials. 1809112, 1-15 (2019).
  17. Chiki, A., et al. Mutant exon1 huntingtin aggregation is regulated by T3 phosphorylation-induced structural changes and crosstalk between T3 phosphorylation and acetylation at K6. Angewandte Chemie - International Edition. 56, 5202-5207 (2017).
  18. Sieste, S., et al. Water-dispersible polydopamine-coated nanofibers for stimulation of neuronal growth and adhesion. Advanced Healthcare Materials. 7, 1-11 (2018).
  19. De, S., et al. Different soluble aggregates of Aβ42 can give rise to cellular toxicity through different mechanisms. Nature Communications. 10, 1541(2019).
  20. Chang, K. C., Chiang, Y. W., Yang, C. H., Liou, J. W. Atomic force microscopy in biology and biomedicine. Tzu Chi Medical Journal. 24, 162-169 (2012).
  21. Variola, F. Atomic force microscopy in biomaterials surface science. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 2950-2959 (2015).
  22. Drolle, E., Hane, F., Lee, B., Leonenko, Z. Atomic force microscopy to study molecular mechanisms of amyloid fibril formation and toxicity in Alzheimer’s disease. Drug Metabolism Reviews. 46, 207-223 (2014).
  23. Ruggeri, F. S., et al. Identification and nanomechanical characterization of the fundamental single-strand protofilaments of amyloid α-synuclein fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7230-7235 (2018).
  24. Ruggeri, F. S., et al. Infrared nanospectroscopy characterization of oligomeric and fibrillar aggregates during amyloid formation. Nature Communications. 6, 1-9 (2015).
  25. Ruggeri, F. S., et al. Microfluidic deposition for resolving single-molecule protein architecture and heterogeneity. Nature Communications. 9, (2018).
  26. Qamar, S., et al. FUS phase peparation is modulated by a molecular chaperone and methylation of arginine cation-π interactions. Cell. 173, 720-734 (2018).
  27. Habchi, J., et al. Cholesterol catalyses Aβ42 aggregation through a heterogeneous nucleation pathway in the presence of lipid membranes. Nature Chemistry. 10, 673-683 (2018).
  28. Sweers, K. K. M., Stöckl, M., Bennink, M. L., Subramaniam, V. Characterizing nanoscale morphologic and mechanical properties of α-Synuclein amyloid fibrils with atomic force microscopy. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding & Aggregation. Uversky, V. N., Lyubchenko, Y. L. , London, UK. 309-322 (2014).
  29. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly Insights from scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 173, 1-13 (2011).
  30. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Devlin, G. L., Dobson, C. M., Welland, M. E. Analysis of structural order in amyloid fibrils. Nanotechnology. 18, (2007).
  31. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. , 6546-6561 (2016).
  32. Knowles, T. P. J., Oppenheim, T. W., Buell, A. K., Chirgadze, D. Y., Welland, M. E. Nanostructured films from hierarchical self-assembly of amyloidogenic proteins. Nature Nanotechnology. 5, 204-207 (2010).
  33. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Craig, A., Dobson, C. M., Welland, M. E. Spatial persistence of angular correlations in amyloid fibrils. Physical Review Letters. 96, 1-4 (2006).
  34. Knowles, T. P. J., et al. Twisting transition between crystalline and fibrillar phases of aggregated peptides. Physical Review Letters. 109, 158101(2012).
  35. Knowles, T. P., et al. Role of intermolecular forces in defining material properties of protein nanofibrils. Science. 318, 1900-1903 (2007).
  36. Smith, J. F., Knowles, T. P. J., Dobson, C. M., MacPhee, C. E., Welland, M. E. Characterization of the nanoscale properties of individual amyloid fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 15806-15811 (2006).
  37. Sokolov, D. V. Atomic force microscopy for protein nanotechnology. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 300, 323-367 (2013).
  38. Ruggeri, F. S., et al. Influence of the β-sheet content on the mechanical properties of aggregates during amyloid fibrillization. Angewandte Chemie - International Edition. 54, 2462-2466 (2015).
  39. Jeong, J. S., Ansaloni, A., Mezzenga, R., Lashuel, H. A., Dietler, G. Novel mechanistic insight into the molecular basis of amyloid polymorphism and secondary nucleation during amyloid formation. Journal of Molecular Biology. 425, 1765-1781 (2013).
  40. Adamcik, J., Mezzenga, R. Study of amyloid fibrils via atomic force microscopy. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 17, 369-376 (2012).
  41. Deguire, S. M., et al. N-terminal huntingtin (Htt) phosphorylation is a molecular switch regulating Htt aggregation, helical conformation, internalization, and nuclear targeting. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
  42. Ruggeri, F. S., et al. Nanoscale studies link amyloid maturity with polyglutamine diseases onset. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  43. Adamcik, J., et al. Understanding amyloid aggregation by statistical analysis of atomic force microscopy images. Nature Nanotechnology. 5, 423-428 (2010).
  44. Lin, Y. C., Komatsu, H., Ma, J., Axelsen, P. H., Fakhraai, Z. Quantitative analysis of amyloid polymorphism using height histograms to correct for tip convolution effects in atomic force microscopy imaging. RSC Advances. 6, 114286-114295 (2016).
  45. Mannini, B., et al. Stabilization and characterization of cytotoxic Aβ40 oligomers isolated from an aggregation reaction in the presence of zinc ions. ACS Chemical Neuroscience. , (2018).
  46. Medalsy, I., Hensen, U., Muller, D. J. Imaging and quantifying chemical and physical properties of native proteins at molecular resolution by force-volume AFM. Angewandte Chemie - International Edition. 50, 12103-12108 (2011).
  47. Dufrêne, Y. F., Martínez-Martín, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Müller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve–based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
  48. Takai, E., et al. Scanning electron microscope imaging of amyloid fibrils. American Journal of Biochemistry and Biotechnology. 10, 31-39 (2014).
  49. Dazzi, A., et al. AFM-IR: Combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Applied Spectroscopy. 66, 1365-1384 (2012).
  50. Volpatti, L. R., et al. Micro- and nanoscale hierarchical structure of core-shell protein microgels. Journal of Materials Chemistry B. 4, 7989-7999 (2016).
  51. Galante, D., et al. A critical concentration of N-terminal pyroglutamylated amyloid beta drives the misfolding of Ab1-42 into more toxic aggregates. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 79, 261-270 (2016).
  52. Ruggeri, F. S., et al. Identification of oxidative stress in red blood cells with nanoscale chemical resolution by infrared nanospectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 19, 1-14 (2018).
  53. Ramer, G., Ruggeri, F. S., Levin, A., Knowles, T. P. J., Centrone, A. Determination of polypeptide conformation with nanoscale resolution in water. ACS Nano. 12 (7), 6612-6619 (2018).
  54. Dazzi, A., Prater, C. B. AFM-IR: Technology and applications in nanoscale infrared spectroscopy and chemical imaging. Chemical Reviews. 117, 5146-5173 (2017).
  55. Lahiri, B., Holland, G., Centrone, A. Chemical imaging beyond the diffraction limit: experimental validation of the PTIR technique. Small. 9 (3), 439-445 (2013).
  56. Ansaloni, A., et al. One-pot semisynthesis of exon 1 of the huntingtin protein: New tools for elucidating the role of posttranslational modifications in the pathogenesis of Huntington’s disease. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (7), 1928-1933 (2014).
  57. Khalaf, O., et al. The H50Q mutation enhances α-synuclein aggregation, secretion, and toxicity. Journal of Biological Chemistry. 289, 21856-21876 (2014).
  58. Hellstrand, E., Boland, B., Walsh, D. M., Linse, S. Amyloid β-protein aggregation produces highly reproducible kinetic data and occurs by a two-phase process. ACS Chemical Neuroscience. 1, 13-18 (2010).
  59. Limbocker, R., et al. Trodusquemine enhances Aβ42 aggregation but suppresses its toxicity by displacing oligomers from cell membranes. Nature Communications. 10 (1), 225(2019).
  60. Lu, F., Belkin, M. A. Infrared absorption nano-spectroscopy using sample photoexpansion induced by tunable quantum cascade lasers. Optics Express. 19, 1902-1904 (2011).
  61. Jiao, Y., Schäffer, T. E. Accurate height and volume measurements on soft samples with the atomic force microscope. Langmuir. 20, 10038-10045 (2004).
  62. Müller, D. J., Engel, A. The height of biomolecules measured with the atomic force microscope depends on electrostatic interactions. Biophysical Journal. 73, 1633-1644 (1997).
  63. Heymann, J. B., Moller, C., Muller, D. J. Sampling effects influence heights measured with atomic force microscopy. Journal Of Microscopy-Oxford. 207, 43-51 (2002).
  64. Marinello, F., Balcon, M., Schiavuta, P., Carmignato, S., Savio, E. Thermal drift study on different commercial scanning probe microscopes during the initial warming-up phase. Measurement Science and Technology. 22, 9(2011).
  65. Marinello, F., Bariani, P., De Chiffre, L., Savio, E. Fast technique for AFM vertical drift compensation. Measurement Science and Technology. 18, 689-696 (2007).
  66. Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in AFM imaging (Clifton, N.J.). Methods in Molecular Biology. 242, 25-27 (2004).
  67. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. New York, NY. 31-43 (2011).
  68. Marinello, F., Carmignato, S., Voltan, A., Savio, E., De Chiffre, L. Error Sources in Atomic Force Microscopy for Dimensional Measurements: Taxonomy and Modeling. Journal of Manufacturing Science and Engineering. 132, 030903(2010).
  69. Ukraintsev, E., Kromka, A., Kozak, H., Reme, Z., Rezek, B. Artifacts in Atomic Force Microscopy of Biological Samples. Atomic Force Microscopy Investigations into Biology - From Cell to Protein. Frewin, C. L. , (2012).
  70. Tsukruk, V. V., Singamaneni, S. Scanning Probe Microscopy of Soft Matter: Fundamentals and Practices. , Wiley-VCH Verlag GmbH. Weinheim, Germany. (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Bioqu micaN mero 151amiloideneurodegeneraci nagregaci n de prote nasmicroscop a de fuerza at micananospectroscopia infrarrojaan lisis de mol cula nicaespectroscopia

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados