Caracterização de agregados proteicos individuais por Nanoespectroscopia infravermelha e microscopia de força atômica

Resumo

Nós descrevemos a aplicação da nanoespectroscopia infravermelha e da microscopia de alta resolução da força atômica para visualizar o processo do self-assembly da proteína em agregados oligoméricas e em fibrilas do amilóide, que é associada pròxima com o início e o desenvolvimento de uma ampla gama de distúrbios neurodegenerativos humanos.

Resumo

O fenômeno de desdobramento de proteínas e agregação resulta na formação de agregados proteicos altamente heterogêneos, que estão associados a condições neurodegenerativas, como as doenças de Alzheimer e Parkinson. Em particular os agregados de baixo peso molecular, oligomers do amilóide, foram mostrados para possuir Propriedades citotóxica genéricas e são implicados como neurotoxinas em muitas formas de demência. Nós ilustramos o uso de métodos baseados na microscopia de força atômica (AFM) para abordar a tarefa desafiadora de caracterizar as propriedades morfológicas, estruturais e químicas desses agregados, que são difíceis de estudar usando estruturas estruturais convencionais métodos ou métodos biofísicos em massa devido à sua heterogeneidade e natureza transitória. Abordagens de microscopia de sonda de varredura agora são capazes de investigar a morfologia de agregados amilóides com resolução de subnanômetro. Mostramos aqui que a nanoespectroscopia de infravermelho (IR) (AFM-IR), que explora simultaneamente a alta resolução do AFM e o poder de reconhecimento químico da espectroscopia IR, pode ir mais longe e possibilitar a caracterização das propriedades estruturais de indivíduos agregados proteicos e, assim, oferecem insights sobre os mecanismos de agregação. Desde que a aproximação que nós descrevemos pode ser aplicada também às investigações das interações de conjuntos da proteína com moléculas e anticorpos pequenos, pode entregar a informação fundamental para desenvolver compostos terapêuticos novos para diagnosticar ou tratar distúrbios neurodegenerativos.

Introdução

Mais de 40 milhões pessoas em todo o mundo são atualmente afetadas por distúrbios neurodegenerativos, como a doença de Alzheimer (AD)¹ e Parkinson (PD)² doenças. Mais geralmente, mais de 50 patologias estão associadas a nível molecular com desdobramento de proteínas e agregação, um processo que leva à proliferação de agregados protéicos insolúveis fibrilantes, conhecidos como depósitos amilóides^{3, 4}. as origens moleculares da neurodegeneração e suas ligações com as mudanças conformacional da proteína das proteínas que conduzem à formação do amilóide, entretanto, permanecem obscuras, na grande parte por causa do nível elevado de heterogeneidade, de natureza transiente e de nanoescala dimensões dos agregados patológicos^4,5.

Investigações altamente bem-sucedidas de estruturas proteicas nas últimas décadas têm sido amplamente baseadas no uso de métodos a granel, incluindo cristalografia de raios-X, microscopia crioeletrônica e espectroscopia de ressonância magnética nuclear^{5, 6} anos de ^{, 7} anos de ^{, 8} . º ^{, 9}. dentro desta classe de técnicas, a espectroscopia infravermelha (ir) surgiu como uma ferramenta analítica sensível para desvendar as propriedades químicas dos sistemas biológicos, como as proteínas⁸. Os métodos do ir permitem a quantificação de mudanças estruturais secundárias e Quaternário da proteína durante seu proteínas e agregação. Além disso, a fim de decifrar mais a nível microscópico os detalhes mecanísticos envolvidos nas complexas paisagens energéticas livres de proteínas durante a sua agregação, um avanço importante tem sido o desenvolvimento de ferramentas de cinética química para estender a complexa caminhos de automontagem, incluindo formação de fibrilas amilóides^{5,6,7,10,11,12.} No entanto, os métodos espectroscópicos em massa fornecem apenas informações médias sobre o conjunto heterogêneo de espécies presentes em solução ou envolvidas em etapas microscópicas específicas, tornando assim a investigação das propriedades biofísicas de indivíduos espécies agregadas desafiadoras no nível de nanoescala^13,14.

Várias técnicas de microscopia com a capacidade de operar em escalas menores do que o limite de difração de luz emergiram nas últimas décadas. Esta classe de métodos inclui microscopia eletrônica (EM) e microscopia de força atômica (AFM). Enquanto a microscopia eletrônica de varredura (MEV) e a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) fornecem imagens bidimensionais (2D) de um espécime, AFM emergiu nas últimas décadas como uma técnica poderosa e versátil para estudar morfologias tridimensionais (3D), como bem como as propriedades Nanomecânica de uma amostra com resolução sub-nanômetro^{13,14,15,16,17,18,19, 20} anos de ^{, 21} anos de ^{, 22} anos de ^{, 23} anos de ^{, 24} de cada ^{, 25} anos de ^{, 26} anos de ^{, 27}. a fundamentação subjacente ao estudo da agregação proteica via AFM é que essa abordagem possibilita a investigação da morfologia de espécies individuais presentes na solução^{13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37}. Em particular, ao monitorar a amostra em função do tempo, o AFM possibilita a investigação da evolução da morfologia das espécies dentro da amostra, o que possibilita acompanhar e visualizar as vias de formação de amiloides^{23, 25,38,39,40,41,42}. Além disso, a AFM possibilita a quantificação de parâmetros estruturais como alturas transversais e comprimentos das espécies individuais presentes na solução^{13,19,30,31 ,32,33,34,35,36, 37,40},^{43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48}. no entanto, o estudo de uma única propriedade biofísica, como a morfologia, muitas vezes não é suficiente quando se estuda sistemas biológicos heterogêneos e complexos. Os métodos de imagem AFM, SEM ou TEM sozinhos não revelam prontamente as propriedades químicas de espécies heterogêneas de agregados amilóides na nanoescala.

Um avanço importante para a análise de amostras biológicas heterogêneas nesta escala foi feito recentemente com o desenvolvimento e a aplicação ao campo da agregação da proteína da nanoespectroscopia infravermelha (AFM-ir)^{24,26, 38,42,49,50,51,52}. Este método inovativo explora a combinação da definição espacial de AFM (~ 1 − 10 nanômetro) com o poder da análise química do IR. A técnica AFM-IR é baseada na mensuração do efeito de ressonância induzida fototermal conduzido por um laser de infravermelho, e na mensuração da expansão térmica da amostra investigação pela ponta AFM. A amostra pode ser iluminada pelo laser do ir diretamente da parte superior ou da parte inferior na reflexão interna total, similarmente como na espectroscopia infravermelha convencional^24,42,52,53 . O laser do IR pode ser pulsado com freqüências típicas na ordem de centenas de kilohertz (1 − 1000 quilohertz) e ajustado sobre uma escala espectral larga, tipicamente entre 1000 − 3300 cm^-1. Embora a fonte de laser cubra uma área de ~ 30 μm de diâmetro, a resolução espacial da técnica AFM-IR é determinada nominalmente pelo diâmetro da ponta AFM, que detecta a expansão térmica local do sistema. AFM-ir é poço-serido para estudar amostras biológicas porque o sinal do ir é proporcional a sua espessura até 1 − 1.5 μm, e os espectros resultantes do ir são geralmente de acordo com os espectros correspondentes da transmissão de FTIR^{13,54 ,55}. Por esta razão, métodos de análise estabelecidos na espectroscopia podem ser prontamente aplicados, como o estudo de turnos químicos, mudança de forma de banda e de-convolução pela segunda análise de derivativos⁵². Globalmente, combinando a resolução espacial do AFM com o poder de reconhecimento químico da espectroscopia IR, AFM-IR permite a aquisição simultânea de uma ampla gama de propriedades morfológicas, mecânicas e químicas de uma amostra na nanoescala.

Aqui, ilustramos um protocolo para a caracterização do processo de agregação proteica que explora a combinação de ensaios de fluorescência in vitro, imagem AFM de alta resolução e AFM-IR de nanoescala. Esta abordagem combinada já se destacou no fornecimento de resultados detalhados no estudo das propriedades químicas e estruturais de microgotas individuais formadas por agregados proteicos, em estudos de separação de fase proteica líquido-líquido, e em investigando a heterogeneidade e as propriedades biofísicas de espécies agregadas individuais na nanoescala^{23,26,38,45,50,53, 56,57}.

Protocolo

1. ensaios de agregação em leitores de placas de fluorescência

Nota: o protocolo aqui descrito é um exemplo de como estudar a agregação de qualquer proteína ou peptídeo por cinética química. Em particular, descreve um protocolo otimizado para estudar a agregação do peptídeo aβ 42, que está envolvido no início e progressão da doença de Alzheimer^58,59. Um protocolo semelhante pode ser ajustado e adotado para estudar a agregação de qualquer proteína ou peptídeo.

1. Obter uma solução monomérica altamente pura de aβ 42 por meio de técnicas de cromatografia de troca iónica e de exclusão de tamanho para distinguir as frações proteicas contendo aβ 42, e isolar a fração monomérica de outras formas agregadas de aβ 42 obtidas^{58 , 59}.
2. Diluir o peptídeo aβ 42 em tampão fosfato de sódio a 20 mM, 200 μM EDTA a pH 8,0⁵⁸ a uma concentração final desejada variando entre 1 − 5 μm, em tubos de ligação baixa de 1,5 ml. As amostras coletadas para medições de AFM não devem conter o corante fluorescente utilizado no ensaio de agregação (tioflavina T, ThT), pois pode introduzir artefactos durante a deposição da amostra para análise de AFM. Assim, prepare triplica de duas soluções idênticas: i) o primeiro que contem o aβ monoméricas 42 para seguir o processo de agregação por AFM; II) o segundo contendo o aβ 42 monomérico com adição de 20 μM ThT como traçador para monitorar a cinética de agregação.
   Nota: é importante executar as etapas 1,1 e 1,2 no gelo. Este procedimento é assegurar-se de que a solução monoméricas aβ 42 não agregue até que iniciada no leitor da placa. Ao manusear amostras, a pipetagem cuidadosa é essencial para evitar a introdução de quaisquer bolhas de ar que possam afectar a amostra de proteínas.
3. Pipete 80 μL de cada amostra em cada poço de um 96-bem, placa de meia área de poliestireno preto com fundo claro e superfícies não vinculantes.
4. Sele a placa com uma folha para minimizar a evaporação da amostra no decorrer da agregação.
5. Equilibrar a temperatura do leitor de chapa a 37 ° c.
6. Configure o protocolo de agregação para ler medições de fluorescência em intervalos fixos de ponto de tempo, em um comprimento de onda de excitação de 440 nm e um comprimento de onda de emissão de 480 nm. A agregação deve ser iniciada em condições quiescentes.
7. Insira a chapa no leitor de chapa.
   Nota: é importante ter cuidado ao manusear a placa, para garantir que a agregação não é acionada antes de iniciar o leitor de chapa. Use as configurações de ajuste de ganho para garantir a leitura ideal da fluorescência de cada amostra.
8. Iniciar a medição.
   Nota: o experimento de agregação é concluído quando a curva sigmoidal de fluorescência ThT atinge um patamar⁵⁸.

2. preparação da amostra para medições AFM e nano-IR

1. Cola mais alta qualidade grau v1 mica disco de alta qualidade magnética de aço inoxidável-disco usando abas adesivas ou fita dupla face.
2. Etch mica colocando um pedaço de fita adesiva sobre a superfície mica e puxando a camada superior da mica. Este procedimento produzirá a superfície limpa, atomicamente Lisa, apropriada para o depósito da amostra.
   Nota: a superfície gravada deve ser uniforme e suave.
   Cuidado: não toque nem respire diretamente acima da mica recém-gravada, pois isso introduzirá artefatos.
3. PAUSE/STOP a medição do leitor de chapa para recolher o ponto de tempo de interesse durante o processo de agregação da proteína.
4. Retire a folha de vedação e colete 10 μL de alíquota das amostras sem ThT do poço em um 1,5 mL tubos de ligação baixa.
5. Deposite os 10 μL da amostra na mica recém-gravada. Para as medições de AFM-IR, as amostras devem ser depositadas na carcaça de ouro recém-despojada.
6. Incubar a solução na mica por 1 min para permitir a fisisorbtion.
   Nota: o tempo de incubação mais longo permitiria uma melhor absorção na superfície, mas pode induzir a autoorganização e a automontagem artificiais²⁵. Para evitar esses efeitos, a deposição de spray pode ser explorada²⁵.
7. Enxague três vezes com 1 mL de água ultrapura.
8. Seque um fluxo delicado do nitrogênio para medir a amostra no ambiente do ar.

3. imagem latente de AFM da morfologia de agregados da proteína

Nota: as medições morfológicas podem ser realizadas tanto em contato quanto em modo dinâmico, nas etapas a seguir, a última é descrita, uma vez que reduz as forças laterais para medir a morfologia 3D da amostra com alta resolução. AFM-IR medições serão executadas em modo de contato para melhorar AFM-IR sinal-ruído relação.

1. Gire sobre o sistema de AFM pelo menos 30 minutos antes das medidas a fim permitir que o sistema alcance a estabilidade térmica. Clique em Setupe, em seguida, em Probe. Na janela de alteração da sonda , clique em Avançar para preparar Z, estágio de foco.
2. Desligue o comutador de feixe AFM (se estiver ligado). Destrave os fechamentos da ensamblagem, desconecte a cabeça do sistema e na janela da mudança da ponta de prova estale sobre em seguida.
3. Monte o cantilever AFM no suporte da sonda. Conecte a cabeça ao sistema e trave os fechamentos da ensamblagem.
   Nota: as cantimanhas óptimas para estudar amostras biológicas no modo dinâmico AFM têm a mola constante que varia entre 2 − 40 N m^-1 e um raios do vértice que varia entre 2 − 8 nanômetro¹⁴.
4. Gire sobre o interruptor do feixe de laser de AFM e na janela da mudança da ponta de prova estale sobre em seguida.
5. Na janela pop-up, clique em não se o tipo cantilever não mudou. Ajuste os botões de alinhamento óptico para encontrar o cantilever. Ajuste o foco para o cantilever e clique em Next.
6. Na janela pop-up, clique em Sim se o foco estiver no cantilever.
7. Posicione o feixe de laser na extremidade do cantilever usando os botões que controlam a posição do laser da deteção. Maximize o sinal total medido pelo fotodiodo de quatro quadrantes a pelo menos > 1 V usando os botões controlando a posição do feixe de laser desviado no fotodiodo sensível à posição (PSPD). Na janela de alteração da sonda , clique em Avançar e depois em Fechar.
8. Aguarde 15 minutos para que o cantilever atinja a estabilidade térmica. Reajustar a posição do feixe de laser desviado no PSPD, se necessário.
9. Clique em NCM Sweep, escolha a amplitude desejada de oscilação, clique em fase de uso, clique em auto e sintonize o cantilever perto do máximo de sua primeira ressonância livre de oscilação, que é de aproximadamente 300 kHz para um cantilever com uma constante de mola de 40 N m^-1.
   Nota: ajustando o cantilever fora do máximo de sua ressonância livre assegura uma estabilidade mais elevada das medidas¹⁴.
10. Coloque a amostra no suporte da amostra. Escolha parâmetros de imagem adequados. A taxa de digitalização típica é de 0,3 − 1,0 Hz para uma área de digitalização de 1 x 1 μm² a 5 x 5 μm². A resolução típica necessária é entre 256 x 256 e 1024 x 1024 pixels. Clique na área de digitalização para escolher o tamanho da digitalização e o número do pixel.
11. Concentre a visão óptica na amostra. Clique na abordagem para abordar a superfície da amostra. Uma vez que a aproximação é terminada estale sobre o μm do elevador 100 para levantar a ponta de afm 100 μm acima da superfície da amostra. Clique em expandir na imagem óptica da amostra. Clique na barra de estágio de foco para focar a vista na superfície da amostra.
12. Use as setas para mover-se na região da amostra de interesse. Envolva a superfície pressionando o botão Approach . Clique no botão Scan de linha e verifique se a ponta está seguindo a superfície bem, se necessário, ajuste o Set Point.
13. Inicie a imagem da superfície da amostra pressionando o botão Scan . Durante a imagem, para evitar a grande força de imagem e manter a consistência de dentro de amostras independentes, manter um regime constante de mudança de fase não superior a Δ20 °⁴².
14. Digite o nome do arquivo e escolha o diretório base onde a imagem adquirida será salva.

4. medições de nanoespectroscopia de infravermelho de agregados proteicos

1. Gire sobre o sistema AFM-IR e o laser infravermelho (IR)⁶⁰ 30 − 60 minutos antes das medidas para a estabilização térmica. Lasers típicos para instrumentos AFM-IR são osciladores de parâmetros ópticos (OPO) e lasers de cascata quântica (QCL).
2. Abra o software incorporado para controlar o instrumento. Clique em arquivo e, em seguida, em novo para abrir um novo arquivo nanoir . Prima o botão inicializar para iniciar o sistema AFM-ir.
3. Abra a tampa do instrumento e monte no sistema AFM-IR uma sonda revestida de ouro de silício com um raio nominal de 30 nm e uma constante de mola de 0,2 N/m para medir a amostra em modo de contato.
4. Estale sobre a carga na ponta de prova de AFM da seção e então em seguida. Em foco na seção de sonda, clique nas setas para focar a câmera no cantilever. Na seção exemplo de movimento XY, use as setas para colocar o Cross-Air no final do cantilever.
5. Gire os botões controlando a posição do laser de detecção para posicionar o laser no final do cantilever. Gire os botões laser para detectar e maximizar a soma medida pelo fotodiodo de quatro quadrantes a um valor ≫ 3 V. Gire o botão de deflexão para ajustar a deflexão do cantilever para-1 v e clique em Avançar. Feche a tampa do instrumento.
6. Na seção foco na amostra use as setas para focar a câmera na amostra. Em seguida, na seção exemplo de movimento XY use as setas para mover na região de interesse da amostra e clique em abordagem e engajar.
7. Na janela do microscópio , selecione como entradas os canais de interesse para mapear as propriedades biofísicas da amostra. Em particular, escolha a altura para a morfologia, a amplitude 2 para a absorção do ir e a freqüência de PLL para mapear a ressonância do contato da ponta-amostra.
8. Na seção da varredura AFM da janela dos controles , use parâmetros similares como na seção 3 (isto é, taxa de varredura 0.1 − 1.0 hertz, entre 256 x 256 e 1024 x 1024 pixéis). Escolha como valor dos ganhos de acordo com a aspereza da amostra: integral I = 1 − 10 e proporcional P = 10 − 30. Em seguida, clique em Scan para adquirir um mapa de morfologia.
   Nota: a morfologia pode ser medida similarmente no modo de batida dinâmico, mas as medidas AFM-IR são executadas aqui no modo de contato para ter umas relações mais elevadas do sinal às ruído.
9. Depois que o mapeamento da morfologia é terminado, na janela do microscópio , estale sobre o mapa da altura para posicionar a ponta de prova na parte superior de um agregado. Em seguida, na seção Nanoir da janela controles , clique em Iniciar ir para iluminar a amostra com o laser ir.
10. Para focar o laser infravermelho no cantilever, clique em otimização. Nesta janela, escreva um wavenumber onde a amostra vai ter alta absorvância e clique em Adicionar. Para a proteína, um valor típico é 1655 cm^-1. Clique em Scan para encontrar a posição do laser ir e clique em Atualizar para alinhar a sua posição com o cantilever. Feche a janela.
11. Na seção geral da configuração de nanoir , escreva um wavenumber onde a absorvência elevada no campo relativo é esperada. Em seguida, desative a opção filtro de passe de banda e veja a leitura do medidor e a transformada rápida de Fourier (FFT) da resposta do cantilever. Na janela FFT mova o cursor verde para ler a frequência de ressonância do cantilever. Um valor típico do FFT da ressonância dos cantialavancas é em torno de 300 kHz. Escreva esse valor de frequência de ressonância na seção geral no campo freq. Centre e use uma janela freq. de 50 kHz.
    Nota: selecione um poder do laser que seja baixo bastante para não saturar a leitura do medidor e para ter a distorção na resposta do cantilever e para não superaquecer a amostra.
12. Clique na janela de ajuste de pulso laser para usar o modo de ressonância reforçada. Escolha um centro de frequência de 300 kHz, uma faixa de sintonia de 50 kHz e um ciclo de trabalho do laser de 5%. Clique em adquirir para varrer a taxa de pulso do laser. Usando o cursor no gráfico, sintonize o pulso do laser à freqüência da resposta mecânica da expansão térmica da amostra que absorve a luz do IR. Em seguida, selecione a opção PLL para monitorar a ressonância de contato entre a amostra e a ponta. Pressione o botão zero na janela PLL e marque Enable para rastrear a ressonância de contato de ponta de amostra. Escolha um ganho integral I = 0,5 e ganho proporcional P = 10. Feche a janela.
13. Abrir novamente a janela de optimização e encontrar a posição do laser ir para pelo menos 3 onda correspondente a grandes bandas de absorvância da amostra (Amida banda I-II-III) e para pelo menos um wavenumber para cada chip do laser.
14. Clique em ferramentas | Calibração do fundo do ir | Novo. Na janela Selecione a região espectroscópica de interesse (1800 − 1200 cm^-1 para estudar as amostras de proteínas); escolha a mesma taxa de pulso determinada na etapa 4,12 e um ciclo de dever de 5%; Estale sobre a aquisição rápida e selecione a velocidade do laser, escala típica para um laser da cascata do Quantum está entre 20 − 500 cm^-1. Clique em adquirir para medir o fundo do laser ir. Este espectro do fundo será usado para a normalização de espectros localizados nanoescala medidos. Feche a janela.
    Nota: se um modo avançado de laser e ressonância avançada não estiver disponível, pule a etapa 4,12 e selecione espectros escalonados em vez de rápido em janelas de aquisição de espectros de fundo e ir. No entanto, a sensibilidade agregada única não será alcançada.
15. Nos ajustes dos espectros do ir , escolha uma definição do espectro do ir entre 1 − 4 cm^-1 e um número de co-médias pelo menos de 64x. Estale sobre adquire para medir um espectro localizado nanoescala do ir na escala da proteína (1800 − 1200 cm^-1).
16. Para adquirir um mapa químico resolvido nanoescala, selecione a opção de imagem latente do ir , escolha um wavenumber do interesse (por exemplo, 1655 cm^-1 para a faixa I do Amide) e estale sobre a varredura na janela da varredura AFM .
17. Uma vez que o mapeamento é terminado, vá ao arquivo e excepto as medidas. Para analisar os mapas adquiridos de morfologia, contato-ressonância e química, bem como os espectros localizados em escala nanométrica, use o software de processamento de imagens AFM incorporado. Espectros e imagens podem ser salvos como arquivos. csv ou. axz para uma análise mais detalhada com software comercial.

5. processamento de imagens e análise de dimensões transversais

1. Flatten RAW images^{14,17,19,41,42,59} usando built-in software de processamento de imagem AFM ou software comercial.
   Nota: os agregados devem ser mascarados do cálculo para evitar artefactos de análise e subestimação da sua altura medida.
2. Aplainar a imagem por 0 subtracção de ajuste de plano de ordem.
3. Aplainar a imagem por plano e, em seguida, linha por linha em uma ordem de regressão de 1^St , a segunda etapa é repetida até que a linha de base plana no perfil da imagem seja atingida.
4. Se a amostra é muito lotado, contém agregados excepcionalmente altos ou artefacto arco scanner está presente, aplainar imagem usando 2^ND ajuste de ordem de regressão.
5. Meça a altura e a largura agregadas de um perfil de linha tomado perpendicularmente ao eixo fibrila^{14,17,19,41,42,59}.
6. Medida fibrila comprimento paralelo ao eixo fibrila^{14,17,19,41,42,59}.

Resultados

Um curso de tempo representativo da agregação aβ 42, medido pelo ensaio de fluorescência ThT, é mostrado na Figura 1. O processo de agregação é comumente caracterizado por uma curva sigmoidal, onde uma fase de retardo é inicialmente observada, e é seguida por uma fase de crescimento íngreme, antes que a curva atinja um planalto quando um estado estacionário de equilíbrio é atingido^{6,7 , 58}

Discussão

O primeiro passo crítico neste protocolo é a preparação de proteínas monoméricas, como no caso da solução aβ 42 descrita nas etapas 1,1 e 1,2. É essencial iniciar o processo de agregação a partir de uma solução monomérica altamente pura, pois a presença de espécies oligoméricas ou agregadas pode resultar em baixa reprodutibilidade da cinética de agregação⁵⁸e induzir artefatos no AFM medidas (por exemplo, as espécies fibrilares serão evidentes nas fases iniciais da agregaçã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM-IR system	Anasys Instruments	nanoIR 2 or 3	Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate	Corning	3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape	Corning	6570
Double Sided Adhesive Discs	AGAR Scientific	AGG3347N
FLUOstar Omega	BMG Labtech	415-101	Platereader
Mica Disc 10mm V1	AGAR Scientific	AGF7013
Park NX10 AFM system	Park Systems	N/A	Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips	Platypus Technologies	AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers	Park Systems	PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL	Eppendorf	30108132
Silicon gold coated cantilevers	Anasys Instruments	PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm	AGAR Scientific	AGF7001