خليه واحده الطموح الصغير كاستراتيجية بديله لفرز الخلايا المنشطة الفلورية لفصل خليط الفيروسات العملاقة

Summary

هنا ، ونحن وصف خليه واحده الطموح الصغير طريقه للفصل بين الأميبا المصابة. [أين وردر تو] فصلت [سوببوبولايشن] فيروسية في [ فرماميبا] [فرميفورليس ] يعدي ب [فوستوفيروس] وحميات عملاقه مجهوله, طور نحن البروتوكول مفصل أدناه ويبرهن قدرته ان يفصل اثنان [لوو-فري] رواية فيروسات عملاقه.

Abstract

خلال عمليه الثقافة المشتركة الأميبا ، قد يتم عزل أكثر من فيروس واحد في بئر واحده. نحن في السابق حل هذه المسالة عن طريق تخفيف نقطه النهاية و/أو الفرز الخلية المنشطة (FACS) تطبيقها علي السكان الفيروسية. ومع ذلك ، عندما يكون للفيروسات في الخليط خصائص مورفولوجيك مماثله واحده من الفيروسات تتكاثر ببطء ، يتم اكتشاف وجود اثنين من الفيروسات في مرحله التجمع الجينوم والفيروسات لا يمكن فصلها لمزيد من التوصيف. ولحل هذه المشكلة ، قمنا بوضع اجراء أحادي الطموح للخلية يسمح بفصل واستنساخ فيروسات متشابهة للغاية. في هذا العمل ، نقدم كيف سمحت لنا هذه الاستراتيجية البديلة لفصل السكان الفرعيين الفيروسية الصغيرة من كلانديستينوفيروس ST1 والفيروسات المغتصبة LCD7 ، والفيروسات العملاقة التي تنمو ببطء ولا تؤدي إلى تحلل الأميبا بالمقارنة مع التحللي وسريع النمو فوستوفيروس. وتم تقييم الرقابة علي النقاء بواسطة تضخيم جيني محدد ، وأنتجت فيروسات لمزيد من التوصيف.

Introduction

الفيروسات الحمضية النووية الكبيرة النواة (NCLDV) متنوعة للغاية ، والتي تحددها أربع عائلات تصيب نواه النوى¹. ووصفت الفيروسات الاولي مع الجينوم أعلاه 300 وكانت Phydcodnaviridae, بما في ذلك الفيروس بيرساريا شلوريلا باراسينيوم 1 PBCV1². العزلة والوصف الأول من Mimivirus ، وأظهرت ان حجم الفيروسات تضاعف من حيث حجم الجسيمات (450 نانومتر) وطول الجينوم (1.2 Mb)³. ومنذ ذلك الحين ، تم وصف العديد من الفيروسات العملاقة ، وعاده ما تكون معزولة باستخدام اجراء الأميبا الثقافة المشتركة. يمكن عزل العديد من الفيروسات العملاقة مع المتحولات المختلفة والمحتويات الوراثية من Acanthamoeba sp. الخلايا ، بما في ذلك مرسيليا ، الفيروسات Pandoraviruses ، الفيروسات ، الفيروسات ، الحمى الطفيلية ، الفيروسات ، ومؤخرا فيروس الورم النخاعي^{4،5،6،7،8،9،10،11،12، 13،14،15،16،17}. في الوقت نفسه ، فان عزله vermamoeba vermamoeba يسمح العزلة ووصف الفيروسات العملاقة faustovirus ، kaumoebavirus ، و اورففيروس^18،19،20. تم عزل الفيروسات العملاقة الأخرى مع الأطباء المضيفين ، مثل كافتيريا roenbergensis²¹، aureococcus أنوفاجيفيرينس²²، تشريسوتشرومولينا اريك²³، والقفطان بودو ²⁴-الآن وكانت جميع هذه العزلات نتيجة لعدد متزايد من الفرق العاملة في العزل وإدخال تحديثات استراتيجية الانتاجيه العالية^{25،26،27،28}، مثل تحسين نظام الثقافة المشتركة مع استخدام التدفق الخلوي.

في 2016 ، استخدمنا استراتيجية ربط الثقافة المشتركة وتدفق الخلوية لعزل الفيروسات العملاقة²⁷. وقد وضعت هذه الاستراتيجية لزيادة عدد العينات الملقحة ، ولتنويع الأطباء الداعمين المستخدمين كدعامات للخلايا ، وللكشف بسرعة عن تحلل دعم الخلايا. تم تحديث النظام عن طريق أضافه خطوه اضافيه لتجنب تحديد البيولوجيا الجزيئية الاوليه والكشف السريع عن السكان الفيروسية غير معروف كما هو الحال في Pacmanvirus²⁹. اقتران تدفق الخلوي لفرز الخلايا يسمح للفصل بين خليط من Mimivirus و Cedratvirus A11³⁰. ومع ذلك ، واجهنا في وقت لاحق قيود الانفصال والكشف عن هذه السكان الفرعية الفيروسية عن طريق تدفق الخلوي. بعد التسلسل ، عندما جمعنا الجينوم من Faustovirus ST1²⁵ و FAUSTOVIRUS LCD7 (البيانات غير المنشورة) ، وجدنا بشكل مدهش في كل تجميع اثنين من الجينوم التكميلي لفيروسين جديدين لم يتم تحديدهما في قواعد بيانات الجينوم العام. ومع ذلك ، فان لا تدفق الخلوي ولا انتقال المجهر الكتروني (TEM) أظهرت ان الأميبا كانت مصابه بفيروسين مختلفين ، كلانديستينوفيروس ST1 و مغتصب الفيروسات LCD7. قمنا بتصميم أنظمه PCR محدده لتضخيم فوستوفيروس ، والفيروسات المغتصبة ، وعلامات كلانديستينوفيروس علي التوالي علي أساس الجينوم الخاصة بهم. كان هدفنا ان يكون النظام القائم علي PCR التي تمكن التحقق من نقاء الفيروسات التي يتم فصلها. ومع ذلك ، فشل التخفيف نقطه النهاية والتدفق الخلوي للفصل بينهما. وكانت عزله هذه المجموعة الفيروسية الوحيدة صعبه لأنه لم يتم وصف العناصر المورفولوجية والمستنسخة لكلانديستينوفيروس والسكان المغتصبين. اكتشفنا واحد فقط من السكان الفيروسية من خلال تدفق الخلوية بسبب تداخل السكان اثنين (اختبار بعد الانفصال الفعلي). حاولنا فصلهم باستخدام واحد الجسيمات الفرز علي لوحات 96-حسنا ، ولكن لم نلاحظ اي اثار خلوي ، واكتشفنا لا كلانديستينوفيروس ولا مغتصب الفيروسات بواسطة PCR التضخيم. وأخيرا ، لم يكن سوي مزيج من تخفيف نقطه النهاية تليها الأميبا الصغيرة الطموح الذي مكن الفصل بين هذين الفيروسات العملاقة منخفضه الوفرة من فوستوفيروس. هذا الأسلوب للفصل هو الكائن من هذه المقالة.

Protocol

1. الأميبا الثقافة

1. استخدام فيرماميبا vermamoeba (سلاله CDC19) كدعم الخلية.
2. أضافه 30 مل من البروتياز-peptone-استخراج الخميرة-الجلوكوز المتوسطة (PYG) (الجدول 1) و 3 مل من الأميبا في تركيز 1 × 10⁶ خلايا/مل في 75 سم² خليه ثقافة قارورة.
3. الحفاظ علي الثقافة عند 28 درجه مئوية.
4. بعد 48 h ، كميه الأميبا باستخدام الشرائح العد.
5. لشطف ، حصاد الخلايا في تركيز 1 × 10⁶ خلايا/مل وبيليه الأميبا بواسطة طرد في 720 x g ل 10 دقيقه أزاله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في الحجم المناسب من الجوع المتوسطة للحصول علي 1 × 10⁶ الخلايا/مل (الجدول 1).

2. انتشار فيروس الأسهم في اموباي

ملاحظه: قبل التخفيف ، من المهم ان ثقافة عينه الأسهم للحصول علي ما يكفي من الثقافة الطازجة ، ثم المضي قدما في الترشيح.

1. استخدام 1 × 10⁶ من الثقافة الأميبا في المجاعة المتوسطة.
2. تطعيم خليط من الفيروسات الصادرة من الحل الأسهم (فوستوفيروس/مغتصب الفيروس LCD7 أو Faustovirus/كلانديستينوفيروس ST1) بعد عمليه الثقافة المشتركة علي دعم الخلية في تعدد العدوى (موي) من 0.01.
   ملاحظه: ومن المهم لوزارة الداخلية الحد من وفره السكان الفيروسيين الرئيسيين وعدد الخلايا المصابة.
3. احتضان في 30 درجه مئوية حتى اثار خلوي (CPE) والمستحثة ، مثل التقريب الأميبا أو تحلل ، ما يقرب من 10 إلى 14 ساعة بعد الاصابه.
4. جمع وسائل الاعلام والترشيح من خلال فلتر 5 μm لأزاله الحطام الخلوي.

3. نهاية نقطه التخفيف

1. تنفيذ التخفيف التسلسلي (10^-1 إلى 10^-11) من العينة الفيروسية في المجاعة المتوسطة (الجدول 1).
2. تطعيم 2 مل من 1 × 10⁶ vermamoeba vermamoeba الواردة في كل طبق بتري مع 100 μl من الخليط الداخل.
3. وضع اطباق بيتري في كيس من البلاستيك القابلة للإغلاق في 30 درجه مئوية.
4. بدء مراقبه اطباق بيتري مع المجهر البصري المقلوب في 6 ح بعد الاصابه والتحقق من الشكل الخلية كل 4 إلى 8 ح.
5. في ظهور تاثير خلوي تتميز الخلايا التقريب ، تبدا عمليه الصغيرة الخلية الطموح.

4. خليه واحده الطموح الصغير

1. اعداد المضيف.
   ملاحظه: يتم اجراء هذا الاعداد للإفراج عن خلايا واحده مصابه إلى دعم خليه جديده.
   1. علاج الأميبا في الثقافة مع عامل مضادات الميكروبات التي تحتوي علي 10 ميكروغرام/مل من فانكوميسين ، 10 ميكروغرام/مل من imipenem ، 20 ميكروغرام/مل من ciprofloxacin ، 20 ميكروغرام/مل من الدوكسيسيكلين ، و 20 ميكروغرام/مل من voriconazole. يستخدم هذا الخليط لتجنب التلوث البكتيري والفطري.
      ملاحظه: يتم الاجراء علي مقعد خارج محطه السلامة الميكروبيولوجية. أضافه 2 مل من اموباي تتركز في 1 × 10⁶ خلايا/مل كل في 15 اطباق بيتري. للانضمام الأميبا ، احتضان الثقافة في 30 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
2. حدد طبق بيتري المستخدم لتحقيق الطموح المتناهي الصغر من تخفيف الحد وفقا للمعايير التالية: 1) عدم وجود اي تلوث مرئي من قبل العوامل الفطرية والبكتيرية ، 2) دليل علي تاثير الأميبا من اموباي بسبب الفيروسات ، و 3) بريليسيس والتقريب المرحلة من اموباي (لتجنب الطموح من الجزيئات الفيروسية).
3. اعداد محطه عمل بالمواد التالية (انظر الشكل 1ا ، ب):
   الجزئي ، والذي يسمح لتحديد المواقع ميكروشعري ؛
   دليل جهاز ضغط التحكم ، وتستخدم ليستنشق والإفراج عن الخلايا في ميكروشعري.
   المجهر المقلوب;
   التوصيل والتشغيل وحدات المحرك;
   كاميرا
   وحده الكمبيوتر لتصور التلاعب والتقاط الصور.
4. اختيار ميكروشعري (انظر الشكل 1ج).
   ملاحظه: حجم الخلايا ، وتشوه والتصاق اغشيها علي الأسطح ، والحركية الخلوية يمكن ان تؤثر علي التقدم السلس للتطلع الصغرى. يمكن اختيار قطر الشعيرات المجهرية بدقه وتكييفها مع أنواع خلايا محدده اعتمادا علي احجامها وطرق الطموح. وقد استخدم ميكروشعري من القطر الداخلي 20 ميكرومتر ليستنشق الأميبا التقريب (قطر ~ 10 μm). وهذا يسمح بالحفاظ علي موقف داخلي وسهوله الإفراج عن الخلية.
5. جبل النظام.
   1. إصلاح زاوية التشغيل للنظام تجتاح علي وحده بمحرك في 45 درجه.
   2. اجراء تثبيت مزدوج ، أولا علي نظام تجتاح ، ومن ثم علي ميكروشعري.
   3. التركيز علي الخلايا بعد تشغيل بضع قطرات من النفط من خلال ميكروشعري.
      ملاحظه: يتم توفير النفط المعدنية مع التوافق البيولوجي من قبل الجهاز.
   4. إكمال المتزايدة التالية توصيات الشركة المصنعة.
6. استنساخ الخلايا (انظر الشكل 2ا ، ب).
   ملاحظه: هذا الاجراء مشابه لواحده التي وصفها Fröhlich و كونيغ³¹.
   1. ضع طبق بيتري الذي يحتوي علي 2 مل من اموباي المصابة تحت المجهر.
   2. التركيز أولا علي الخلايا ، ومن ثم علي ميكروشعري مغمورة في الثقافة.
   3. اختيار خليه واحده مدوره وجلب ميكروشعري أقرب إلى الجزئي.
   4. ممارسه الطموح الناعم مع التحكم في الضغط اليدوي علي الخلية ، مع الأخذ بها داخل ميكروشعري. أزاله خليه واحده من العينة الاولي والإفراج في دعم الخلوية ، ثم احتضان عليه في 30 درجه مئوية.
   5. اجراء الملاحظات اليومية مع المجهر البصري المقلوب لمراقبه ظهور الخلايا ورصد ظهور تاثير السيتواثيك.

5. فحص PCR

ملاحظه: وبعد الخطوة 4 ، يعد الفحص المنهجي من قبل PCR أمرا حاسما لتاكيد الانفصال. في كل من الفيروسات المغتصبة/Faustovirus و كلانديستينوفيروس/Faustovirus ، تم تصميم وتطبيق التمهيدي محدده ونظم التحقيق باستخدام التمهيدي الانفجار علي الإنترنت³² (الجدول 2).

1. استخراج الحمض النووي من جزء من عينات الثقافة الايجابيه (اي ، حيث لوحظ تاثير خلوي) ، وذلك باستخدام نظام استخراج الألى وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
2. استخدام الإشعال مصممه بشكل مناسب.
   ملاحظه: هنا قمنا بتصميم الإشعال لتضخيم الجينات الاساسيه المشروحة كما RpB2 (فوستوفيروس) ، LCD7 البروتين كابسيد الرئيسية (المغتصبة) والبروتين كابسيد طفيفه (كلانديستينوفيروس)
3. اجراء PCR القياسية باستخدام ثيرموسيكلير.
   1. تنفيذ 20 μL PCR ردود الفعل مع 50 μM من كل التمهيدي (الجدول 2) ، 1X ماستر ميكس ، و RNase المياه الحرة.
   2. قم بتنشيط الحمض النووي الريبي لمده 5 دقائق عند 95 درجه مئوية ، ثم اتبع مع 45 دوره من 10 ليالي التشبع في 95 درجه مئوية ، والصلب من الإشعال لمده 30 ثانيه في 58 درجه مئوية ، والتمديد ل 30 ثانيه في 72 درجه مئوية.
4. تشغيل المنتجات PCR علي هلام 1.5 ٪ اجنشا ، وصمه عار مع هلام الحمض النووي وصمه عار (جدول المواد) ، وتصور مع الاشعه فوق البنفسجية.

6. إنتاج وتنقيه الفيروسات

1. وضع بقية الثقافة طبق بيتري مره أخرى في قارورة صغيره.
2. لإنتاج الفيروس ، واعداد 15 قوارير من 145 سم²، التي تحتوي علي 40 مل من vermamoeba فيرميفورليس في المجاعة المتوسطة و 5 مل من الفيروس معزولة نقلت بالفعل من طبق بيتري إلى قوارير صغيره.
3. علاج بنفس المضادات الحيوية والخليط المضاد للفطريات المستخدم في الخطوة 4.1.
4. احتضان في 30 درجه مئوية. راقب كل يوم مع المجهر البصري المقلوب.
5. بعد العدوى الكاملة ، تجمع جميع قوارير. استخدام فلتر 0.45 μm للقضاء علي الحطام.
6. Ultracentrifuge جميع supernatants في 50,000 x g ل 45 دقيقه.
7. بعد طرد ، وأزاله ماده طافي من كل أنبوب عن طريق الطموح وأعاده تعليق بيليه في 1 مل من الفوسفات المالحة المخزنة مؤقتا (تلفزيوني).
8. تنقيه الفيروس المنتجة باستخدام السكروز 25 ٪ (27.5 ز السكروز في 100 mL من تلفزيوني ، تعقيمها عن طريق الترشيح).
9. الطرد المركزي 8 مل من السكروز و 2 مل من تعليق الفيروسية في 80,000 x g لمده 30 دقيقه. أعاده تعليق بيليه الفيروسية في 1 مل من تلفزيوني. خزنه في-80 درجه مئوية.

7. السلبية تلطيخ وانتقال المجهر الكترون

ملاحظه: وقد نشر بو خليل وآخرون هذا^{البروتوكول في}السابق.

1. إيداع 5 μl من ماده طافي تحلل علي الشبكة التي خرجت توهج. يترك لمده 20 دقيقه تقريبا في درجه حرارة الغرفة.
   ملاحظه: وتوهج التفريغ يسمح لنا للحصول علي شبكه هيدروفيله عن طريق تطبيق البلازما.
2. تجفيف الشبكة بعناية وإيداع قطره صغيره من 1 ٪ موليبدات الأمونيوم علي ذلك ل 10 ليالي. اترك الشبكة لتجف لمده 5 دقائق.
3. المضي قدما إلى ملاحظات المجهر الكتروني في 200 كيلو.

8-توصيف الكلانديستينوفيروس ST1 والفيروس المغتصب LCD7

1. توصيف السكان النقيين من كلانديستينوفيروس ST1 والفيروسات المغتصبة LCD7 باستخدام التسلسل الجينوم ، والتجمع الجينوم ، وتحليلات المعلوماتية الحيوية ، ودراسة دورتها المستنسخة كما فعلنا للفيروسات أخرى^{10،20، 29}-الآن

النتائج

الشفط الدقيق للخلايا الواحدة هو عمليه المعالجة الجزئية الأمثل في هذه المخطوطة (الشكل 1). تمكن هذه التقنية من التقاط الأميبا المدورة المصابة (الشكل 2ا) وإطلاقها في لوحه جديده تحتوي علي اميباي غير مصاب (الشكل 2). وهو نموذج وظيفي التي تن?...

Discussion

وتتوقف مده معالجه الاستنشاق الدقيق للخلية الواحدة وأداءها الجيد علي المشغل. تتطلب الخطوات المختلفة للتجربة الدقة. يجب ان يكون استخدام مكونات المعالجة التفصيلية لمحطه العمل تحت السيطرة المستمرة من خلال مراقبه عمليه الطموح المتناهي الصغر وإطلاق الخلية. والمتابعة بالرصد المجهري ضرورية لل...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose Standard	Euromedex	Unkown	Standard PCR
AmpliTaq Gold 360 Master Mix	Applied Biosystems	4398876	Standard PCR
CellTram 4r Oil	Eppendorf	5196000030	Control the cells during the microaspiration process
Corning cell culture flasks 150 cm2	Sigma-aldrich	CLS430825	Culture
Corning cell culture flasks 25 cm2	Sigma-aldrich	CLS430639	Culture
Corning cell culture flasks 75 cm2	Sigma-aldrich	CLS430641	Culture
DFC 425C camera	LEICA	Unkown	Observation/Monitoring
Eclipse TE2000-S Inverted Microscope	Nikon	Unkown	Observation/Monitoring
EZ1 advanced XL	Quiagen	9001874	DNA extraction
Glasstic Slide 10 with Counting Grids	Kova International	87144E	Cell count
Mastercycler nexus	Eppendorf	6331000017	Standard PCR
Microcapillary 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	Microaspiration and release of cells
Micromanipulator InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Microcapillary positioning
Nuclease-Free Water	ThermoFischer	AM9920	Standard PCR
Optima XPN Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	A94469	Virus purification
Petri dish 35 mm	Ibidi	81158	Culture/observation
Sterile syringe filters 5 µm	Sigma-aldrich	SLSV025LS	Filtration
SYBR green Type I	Invitrogen	unknown	Fluorescent molecular probes/flow cytometry
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	Standard PCR; DNA gel stain
Tecnai G20	FEI	Unkown	Electron microscopy
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor	BECKMAN COULTER	337922	Virus purification
Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2	BECKMAN COULTER	344058	Virus purification