Single Cell Micro-Aspiration als Alternative zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung für die Trennung von Riesenviren

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine einzellige Mikro-Aspirationsmethode zur Trennung infizierter Amöben. Um virale Subpopulationen in Vermamoeba vermiformis zu trennen, die mit Faustoviren und unbekannten Riesenviren infiziert sind, haben wir das unten beschriebene Protokoll entwickelt und seine Fähigkeit demonstriert, zwei neuartige Riesenviren mit geringem Überfluss zu trennen.

Zusammenfassung

Während des Amöben-Cokulturprozesses kann mehr als ein Virus in einem einzigen Brunnen isoliert werden. Wir haben dieses Problem zuvor durch Endpunktverdünnung und/oder Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) gelöst, die auf die Viruspopulation angewendet wurde. Wenn die Viren in der Mischung jedoch ähnliche morphologische Eigenschaften haben und sich eines der Viren langsam vermehrt, wird das Vorhandensein von zwei Viren im Stadium der Genom-Montage entdeckt und die Viren können nicht für eine weitere Charakterisierung getrennt werden. Um dieses Problem zu lösen, haben wir ein einzelliges Mikro-Aspirationsverfahren entwickelt, das die Trennung und das Klonen von sehr ähnlichen Viren ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit stellen wir vor, wie diese alternative Strategie es uns ermöglichte, die kleinen viralen Subpopulationen des Clandestinovirus ST1 und des Usurpativirus LCD7 zu trennen, Riesenviren, die langsam wachsen und nicht zu Amöbenlyse im Vergleich zu der lytischen und schnell wachsenden Faustovirus. Die Reinheitskontrolle wurde durch spezifische Genverstärkung bewertet und Viren für die weitere Charakterisierung produziert.

Einleitung

Nukleozytoplasmatische große DNA-Viren (NCLDV) sind extrem vielfältig und werden von vier Familien definiert, die Eukaryote infizieren¹. Die ersten beschriebenen Viren mit Genomen über 300 kbp waren Phydcodnaviridae, einschließlich Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 PBCV1². Die Isolierung und die erste Beschreibung des Mimivirus zeigten, dass sich die Größe der Viren sowohl in Bezug auf die Größe des Teilchens (450 nm) als auch auf die Länge des Genoms (1,2 Mb)³verdoppelte. Seitdem wurden viele Riesenviren beschrieben, die in der Regel mit einem Amöben-Co-Kulturverfahren isoliert werden. Mehrere Riesenviren mit unterschiedlichen Morphologien und genetischen Inhaltsstoffen können aus Acanthamoeba sp. Zellen isoliert werden, einschließlich Marseilleviren, Pandoraviren, Pithoviren, Mollivirus, Cedratviren, Pacmanvirus, Tupanvirus und vor kurzem Medusavirus^{4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17}. Parallel dazu ermöglichte die Isolierung von Vermamoeba vermiformis die Isolierung und Beschreibung der Riesenviren Faustovirus, Kaumoebavirus und Orpheovirus^18,19,20. Andere Riesenviren wurden mit ihren Wirtsprotisten isoliert, wie Cafeteria roenbergensis²¹, Aureococcus anophagefferens²², Chrysochromulina ericina²³und Bodo saltans ²⁴. Alle diese Isolationen waren das Ergebnis einer wachsenden Anzahl von Teams, die an der Isolation arbeiten, und der Einführung von Strategieaktualisierungen mit hohem Durchsatz^25,26,27,28, wie z. B. Verbesserung des Cokultursystems durch den Einsatz von Durchflusszytometrie.

Im Jahr 2016 haben wir eine Strategie verwendet, die Co-Kultur und Durchflusszytometrie assoziiert, um Riesige Viren zu isolieren²⁷. Diese Strategie wurde entwickelt, um die Anzahl der geimpften Proben zu erhöhen, Protisten, die als Zellstützen verwendet werden, zu diversifizieren und die Lyse der Zellunterstützung schnell zu erkennen. Das System wurde durch hinzufügen eines zusätzlichen Schritts aktualisiert, um eine vorläufige molekularbiologische Identifizierung und schnellen Nachweis einer unbekannten Viruspopulation wie im Fall von Pacmanvirus²⁹zu vermeiden. Die Kopplung der Durchflusszytometrie zur Zellsortierung ermöglichte die Trennung einer Mischung aus Mimivirus und Cedratvirus A11³⁰. Später stießen wir jedoch auf die Grenzen der Trennung und Detektion dieser viralen Subpopulationen durch Durchflusszytometrie. Nach der Sequenzierung, als wir die Genome des Faustovirus ST1²⁵ und des Faustovirus LCD7 (unveröffentlichte Daten) zusammenstellten, fanden wir in jeder Baugruppe überraschenderweise zwei zusätzliche Genome von zwei neuartigen Viren, die in öffentlichen Genomdatenbanken nicht identifiziert wurden. Weder die Durchflusszytometrie noch die transmissionselektronische Mikroskopie (TEM) zeigten jedoch, dass die Amöben mit zwei verschiedenen Viren infiziert waren, dem Clandestinovirus ST1 und dem Usurpativirus LCD7. Wir haben spezielle PCR-Systeme entwickelt, um Faustovirus, Usurpativirus und Clandestinovirus-Marker auf der Grundlage ihrer Genome zu verstärken; Unser Ziel war es, PCR-basierte Systeme zu haben, die eine Überprüfung der Reinheit der zu trennenden Viren ermöglichen. Die Endpunktverdünnung und die Durchflusszytometrie konnten sie jedoch nicht trennen. Die Isolierung dieser einzelnen Viruspopulation war schwierig, da weder die Morphologie noch die replizierenden Elemente der Populationen des Clandestinovirus und des Usurpativirus charakterisiert wurden. Wir haben aufgrund der Überlappung der beiden Populationen (getestet nach der effektiven Trennung) nur eine Viruspopulation durch Durchflusszytometrie festgestellt. Wir haben versucht, sie mit einer einzigen Partikelsortierung auf 96-Well-Platten zu trennen, aber wir haben keine zytopathischen Effekte beobachtet, und wir haben weder Clandestinovirus noch Usurpativirus durch PCR-Verstärkung entdeckt. Schließlich war es nur die Kombination der Endpunktverdünnung gefolgt von einem einzigen Amöben-Mikro-Aspiration, die die Trennung dieser beiden mit geringer Häufigkeit reichenden Riesenviren von Faustoviren ermöglichte. Diese Trennungsmethode ist Gegenstand dieses Artikels.

Protokoll

1. Amoeba Kultur

1. Verwenden Sie Vermamoeba vermiformis (Stamm CDC19) als Zellunterstützung.
2. 30 ml Protease-Pepton-Hefe-Extrakt-Glukosemedium (PYG)(Tabelle 1) und 3 ml Amöben in einer Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen/ml in einem 75 cm² Zellkulturkolben hinzufügen.
3. Pflegen Sie die Kultur bei 28 °C.
4. Nach 48 h die Amöbe mit Zählfolien quantifizieren.
5. Zum Spülen, Ernten Sie die Zellen in einer Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen/ml und pellet die Amöbe durch Zentrifugation bei 720 x g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet im entsprechenden Volumen des Hungermediums wieder auf, um 1 x 10 6 zu erhalten Zellen/ml (Tabelle 1).

2. Verbreitung des Aktienvirus in Amöben

HINWEIS: Vor der Verdünnung ist es wichtig, die Stammprobe zu kulturisieren, um genügend frische Kultur zu erhalten, und dann zur Filtration überzugehen.

1. Verwenden Sie 1 x 10⁶ Amöbenkultur im Hungermedium.
2. Impfen Sie die Mischung von Viren, die aus der Stammlösung (Faustovirus/Usurpativirus LCD7 oder Faustovirus/Clandestinovirus ST1) nach dem Kokulturverfahren auf die Zellunterstützung bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 0,01 ausgegeben werden.
   HINWEIS: Die MOI ist wichtig, um die Fülle der großen viruspopulation und die Anzahl der infizierten Zellen zu reduzieren.
3. Inkubieren Sie bei 30 °C, bis zytopathische Wirkungen (CPE) induziert werden, wie Amöbenrundung oder Lyse, etwa 10 bis 14 h nach der Infektion.
4. Sammeln Sie die Medien und filtrat durch einen 5 m Filter, um Zellablagerungen zu entfernen.

3. Endpunktverdünnung

1. Führen Sie eine serielle Verdünnung (10^-1 bis 10^-11) der Virusprobe im Hungermedium (Tabelle 1) durch.
2. 2 ml von 1 x 10⁶ Vermamoeba vermiformis in jeder Petrischale mit 100 l des Gemischs Inoculum impfen.
3. Die Petri-Gerichte bei 30 °C in eine verschließbare Plastiktüte geben.
4. Beginnen Sie mit der Beobachtung der Petrischalen mit invertierter optischer Mikroskopie bei 6 h Nachinfektion und überprüfen Sie die Zellmorphologie alle 4 bis 8 h.
5. Beginnen Sie beim Auftreten des zytopathischen Effekts, der durch Rundungszellen gekennzeichnet ist, den einzelzelligen Mikro-Aspirationsprozess.

4. Single Cell Micro-Aspiration

1. Bereiten Sie den Host vor.
   HINWEIS: Dieses Präparat wird für die Freisetzung infizierter Einzelzellen in eine Frischzellenstütze hergestellt.
   1. Behandeln Sie die Amöben in der Kultur mit einem antimikrobiellen Mittel, das 10 g/ml Vancomycin, 10 g/ml Imipenem, 20 g/ml Ciprofloxacin, 20 g/ml Doxycyclin und 20 g/ml Voriconazol enthält. Diese Mischung wird verwendet, um bakterielle und Pilzkontamination zu vermeiden.
      HINWEIS: Das Verfahren findet auf einer Bank außerhalb der mikrobiologischen Sicherheitsstation statt. Fügen Sie 2 ml Amöbe konzentriert bei 1 x 10⁶ Zellen/ml jeweils in 15 Petrischalen. Für Amöben-Haftung, inkubieren Sie die Kultur bei 30 °C für 30 min.
2. Wählen Sie die Petrischale, die für die Mikroaspiration verwendet wird, aus der Grenzwertverdünnung nach den folgenden Kriterien aus: 1) Fehlen einer sichtbaren Kontamination durch Pilz- und Bakterienmittel, 2) Nachweis der zytopathischen Wirkung von Amöben aufgrund der Viren und 3) Prälyse und Rundungsphase der Amöbe (um das Abstreben von Viruspartikeln zu vermeiden).
3. Einrichten einer Arbeitsstation mit folgenden Materialien (siehe Abbildung 1A,B):
   Mikromanipulator, der mikrokapillare Positionierung ermöglicht;
   Manuelle Spulendruckvorrichtung, die zum Aspirieren und Freilassen der Zellen in die Mikrokapillare verwendet wird;
   Invertiertes Mikroskop;
   Plug&play Motormodule;
   Kamera;
   Computermodul zur Visualisierung von Manipulationen und Zum Aufnehmen von Bildern.
4. Wählen Sie eine Mikrokapillare (siehe Abbildung 1C).
   HINWEIS: Die Größe der Zellen, die Verformung und Haftung ihrer Membranen an den Oberflächen und die zelluläre Beweglichkeit können den reibungslosen Fortschritt der Mikroaspiration beeinflussen. Der Mikrokapillardurchmesser kann je nach Größe und Aspirationsmethode präzise ausgewählt und an bestimmte Zelltypen angepasst werden. Eine Mikrokapillare mit einem Innendurchmesser von 20 m wurde verwendet, um eine rundende Amöbe (Durchmesser 10 m) zu saugen. Dies ermöglicht die Aerhalt einer inneren Position und eine einfache Freisetzung der Zelle.
5. Montieren Sie das System.
   1. Fixieren Sie den Betriebswinkel des Greifsystems am motorisierten Modul auf 45°.
   2. Führen Sie eine Doppelinstallation durch, zuerst auf dem Greifsystem und dann auf der Mikrokapillare.
   3. Konzentrieren Sie sich auf die Zellen, nachdem Sie ein paar Tropfen Öl durch die Mikrokapillare laufen.
      HINWEIS: Das Mineralöl mit biologischer Verträglichkeit wird vom Gerät geliefert.
   4. Komplette Montage nach den Empfehlungen des Herstellers.
6. Klonzellen (siehe Abbildung 2A,B).
   HINWEIS: Dieses Verfahren ähnelt dem von Fröhlich und König³¹beschriebenen.
   1. Die Petrischale mit 2 ml infizierter Amöbe unter das Mikroskop stellen.
   2. Konzentrieren Sie sich zuerst auf die Zellen, und dann auf die Mikrokapillare in der Kultur eingetaucht.
   3. Wählen Sie eine abgerundete Einzelzelle und bringen Sie die Mikrokapillare näher an den Mikromanipulator.
   4. Üben Sie weiche Aspiration mit manueller Druckregelung auf die Zelle und nehmen Sie sie in die Mikrokapillare. Entfernen Sie die Einzelzelle aus der ersten Probe und lassen Sie sie in der zellulären Unterstützung frei, und inkubieren Sie sie dann bei 30 °C.
   5. Führen Sie tägliche Beobachtungen mit einem invertierten optischen Mikroskop durch, um das Aussehen der Zellen zu beobachten und die Entstehung des zytopathischen Effekts zu überwachen.

5. PCR-Screening

HINWEIS: Nach Schritt 4 ist ein systematisches Screening durch PCR entscheidend, um die Trennung zu bestätigen. Sowohl bei Usurpativirus/Faustovirus als auch bei Clandestinovirus/Faustovirus wurden das Design und die Anwendung der spezifischen Primer- und Sondensysteme mit Primer-BLAST online³² (Tabelle 2) durchgeführt.

1. Extrahieren Sie DNA aus einem Teil der positiven Kulturproben (d. h. bei beobachteter zytopathischer Wirkung) unter Verwendung eines automatisierten Extraktionssystems gemäß dem Herstellerprotokoll.
2. Verwenden Sie entsprechend gestaltete Primer.
   HINWEIS: Hier haben wir Primer entwickelt, um Kerngene zu verstärken, die als RpB2 (Faustovirus), LCD7-Hauptcapsidprotein (Usurpatvirus) und kleineres Capsid-Protein (Clandestinovirus) mit Anmerkungen verwoben sind.
3. Führen Sie Standard-PCR mit einem Thermocycler aus.
   1. Führen Sie 20 L PCR-Reaktionen mit 50 m pro Primer(Tabelle 2), 1x Master Mix und RNase-freies Wasser durch.
   2. Aktivieren Sie die Taq DNA-Polymerase für 5 min bei 95 °C, dann folgen Sie mit 45 Zyklen von 10 s Denaturierung bei 95 °C, Glühen der Primer für 30 s bei 58 °C und Verlängerung für 30 s bei 72 °C.
4. Führen Sie die PCR-Produkte auf einem 1,5% Agarose-Gel, Fleck mit DNA-Gel-Färbung (Tabelle der Materialien), und visualisieren mit UV.

6. Virusproduktion und -reinigung

1. Setzen Sie den Rest der Petrischale Kultur wieder in einem kleinen Kolben.
2. Für die Virusproduktion 15 Kolben von 145 cm²vorbereiten, die 40 ml Vermamoeba vermiformis im Hungermedium und 5 ml des isolierten Virus enthalten, die bereits von der Petrischale auf kleine Kolben übertragen wurden.
3. Behandeln Sie mit dem gleichen Antibiotikum und Antimykotika-Mischung in Schritt 4.1 verwendet.
4. Bei 30 °C inkubieren. Beobachten Sie jeden Tag mit invertierter optischer Mikroskopie.
5. Nach der vollständigen Infektion alle Kolben bündeln. Verwenden Sie einen 0,45 m-Filter, um Schmutz zu beseitigen.
6. Ultrazentrifugieren Sie alle Überräube bei 50.000 x g für 45 min.
7. Nach der Zentrifugation den Überstand aus jedem Rohr durch Aspiration entfernen und das Pellet in 1 ml Phosphatgepufferter Saline (PBS) wieder aufsetzen.
8. Reinigen Sie das Virus, das mit 25% Saccharose (27,5 g Saccharose in 100 ml PBS, sterilisiert durch Filtration) hergestellt wird.
9. Zentrifuge 8 ml Saccharose und 2 ml der viralen Suspension bei 80.000 x g für 30 min. Das virale Pellet in 1 ml PBS wieder aufsetzen. Lagern Sie es bei -80 °C.

7. Negative Färbe- und Transmissionselektronenmikroskopie

HINWEIS: Bou Khalil et al. haben dieses Protokoll zuvor veröffentlicht²⁷.

1. 5 l des Lyseüberstandes auf das glühende Gitter ablagern. Ca. 20 min bei Raumtemperatur lassen.
   HINWEIS: Die Glüh-Entladung ermöglicht es uns, ein hydrophiles Gitter durch Plasmaanwendung zu erhalten.
2. Trocknen Sie das Gitter sorgfältig und legen Sie einen kleinen Tropfen von 1% Ammonium Molybdat auf sie für 10 s. Lassen Sie das Gitter für 5 min trocknen.
3. Fahren Sie mit Elektronenmikroskopie-Beobachtungen bei 200 keV fort.

8. Charakterisierung des Clandestinovirus ST1 und des Usurpativirus LCD7

1. Charakterisieren Sie reine Populationen von Clandestinovirus ST1 und Usurpativirus LCD7 mit Genomsequenzierung, Genommontage, Bioinformatik-Analysen und Untersuchung ihres reproduktiven Zyklus, wie wir es für andere Viren getan haben^{10,20, 29}.

Ergebnisse

Die Einzelzell-Mikro-Aspiration ist ein in diesem Manuskript optimierter Mikromanipulationsprozess (Abbildung 1). Diese Technik ermöglicht die Erfassung einer abgerundeten, infizierten Amöbe (Abbildung 2A) und deren Freisetzung in einer neuartigen Platte, die nicht infizierte Amöben enthält (Abbildung 2). Es ist ein funktionaler Prototyp, der für das Co-Kultur-System gilt und erfolgreich nicht-lytische Riesenvi...

Diskussion

Die Dauer der einzelzelligen Mikroaspirationsbehandlung und ihre gute Funktion ist bedienerabhängig. Die verschiedenen Schritte des Experiments erfordern Präzision. Die Verwendung der Mikromanipulationskomponenten des Arbeitsplatzes muss durch die Beobachtung des Prozesses der Mikroaspiration und der Freisetzung der Zelle ständig kontrolliert werden. Die Nachbeobachtung durch mikroskopische Beobachtung ist für die Erfassung und Übertragung einer Zelle notwendig. Ein erfahrener Bediener kann 1 bis 2 h nehmen, um 10 Z...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose Standard	Euromedex	Unkown	Standard PCR
AmpliTaq Gold 360 Master Mix	Applied Biosystems	4398876	Standard PCR
CellTram 4r Oil	Eppendorf	5196000030	Control the cells during the microaspiration process
Corning cell culture flasks 150 cm2	Sigma-aldrich	CLS430825	Culture
Corning cell culture flasks 25 cm2	Sigma-aldrich	CLS430639	Culture
Corning cell culture flasks 75 cm2	Sigma-aldrich	CLS430641	Culture
DFC 425C camera	LEICA	Unkown	Observation/Monitoring
Eclipse TE2000-S Inverted Microscope	Nikon	Unkown	Observation/Monitoring
EZ1 advanced XL	Quiagen	9001874	DNA extraction
Glasstic Slide 10 with Counting Grids	Kova International	87144E	Cell count
Mastercycler nexus	Eppendorf	6331000017	Standard PCR
Microcapillary 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	Microaspiration and release of cells
Micromanipulator InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Microcapillary positioning
Nuclease-Free Water	ThermoFischer	AM9920	Standard PCR
Optima XPN Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	A94469	Virus purification
Petri dish 35 mm	Ibidi	81158	Culture/observation
Sterile syringe filters 5 µm	Sigma-aldrich	SLSV025LS	Filtration
SYBR green Type I	Invitrogen	unknown	Fluorescent molecular probes/flow cytometry
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	Standard PCR; DNA gel stain
Tecnai G20	FEI	Unkown	Electron microscopy
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor	BECKMAN COULTER	337922	Virus purification
Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2	BECKMAN COULTER	344058	Virus purification