Micro-aspiration à cellule unique comme stratégie alternative au tri cellulaire activé par fluorescence pour la séparation du mélange de virus géants

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode de micro-aspiration de cellules simples pour la séparation des amibes infectées. Afin de séparer les sous-populations virales de Vermamoeba vermiformis infectés par des Faustovirus et des virus géants inconnus, nous avons développé le protocole détaillé ci-dessous et démontré sa capacité à séparer deux nouveaux virus géants à faible abondance.

Résumé

Pendant le processus de co-culture de l'amibe, plus d'un virus peut être isolé dans un seul puits. Nous avons précédemment résolu ce problème par dilution de point final et/ou tri activé de cellules de fluorescence (FACS) appliqué à la population virale. Cependant, lorsque les virus dans le mélange ont des propriétés morphologiques similaires et que l'un des virus se multiplie lentement, la présence de deux virus est découverte au stade de l'assemblage du génome et les virus ne peuvent pas être séparés pour une autre caractérisation. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une procédure de micro-aspiration à cellule unique qui permet la séparation et le clonage de virus très similaires. Dans le présent travail, nous présentons comment cette stratégie alternative nous a permis de séparer les petites sous-populations virales de Clandestinovirus ST1 et Usurpativirus LCD7, virus géants qui se développent lentement et ne conduisent pas à la lyse amiale par rapport à la lytique et à croissance rapide Le Faustovirus. Le contrôle de pureté a été évalué par amplification spécifique de gène et des virus ont été produits pour davantage de caractérisation.

Introduction

Les virus nucléocytoplasmiques de gros virus d'ADN (NCLDV) sont extrêmement divers, définis par quatre familles qui infectent des eucaryotes¹. Les premiers virus décrits avec des génomes supérieurs à 300 kbp étaient Phydcodnaviridae, y compris Paramecium bursaria Chlorella virus 1 PBCV1². L'isolement et la première description de Mimivirus, a montré que la taille des virus a doublé en termes à la fois de la taille de la particule (450 nm) et la longueur du génome (1,2 Mo)³. Depuis lors, de nombreux virus géants ont été décrits, généralement isolés à l'aide d'une procédure de co-culture de l'amibe. Plusieurs virus géants avec des morphologies et des contenus génétiques différents peuvent être isolés à partir des cellules acanthamoeba sp., y compris les virus de Marseille, Pandoravirus, Pithovirus, Mollivirus, Cedratvirus, Pacmanvirus, Tupanvirus, et récemment Médusavirus^{4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17}. En parallèle, l'isolement de Vermamoeba vermiformis a permis l'isolement et la description des virus géants Faustovirus, Kaumoebavirus, et Orpheovirus^18,19,20. D'autres virus géants ont été isolés avec leurs protistes hôtes, tels que la cafétéria roenbergensis²¹, Aureococcus anophagefferens²², Chrysochromulina ericina²³, et Bodo saltans ²⁴. Tous ces isolements sont le résultat d'un nombre croissant d'équipes travaillant sur l'isolement et de l'introduction de mises à jour de stratégie à haut débit^25,26,27,28, telles que le l'amélioration du système de co-culture avec l'utilisation de la cytométrie de flux.

En 2016, nous avons utilisé une stratégie associant la co-culture et la cytométrie des flux pour isoler les virus géants²⁷. Cette stratégie a été développée pour augmenter le nombre d'échantillons inoculés, pour diversifier les protistes utilisés comme supports cellulaires, et pour détecter rapidement la lyse du support cellulaire. Le système a été mis à jour en ajoutant une étape supplémentaire pour éviter l'identification préliminaire de la biologie moléculaire et la détection rapide d'une population virale inconnue comme dans le cas de Pacmanvirus²⁹. La cytométrie de flux de couplage au tri cellulaire a permis la séparation d'un mélange de Mimivirus et cedratvirus A11³⁰. Cependant, nous avons plus tard rencontré les limites de la séparation et de la détection de ces sous-populations virales par cytométrie de flux. Après le séquençage, lorsque nous avons assemblé les génomes du Faustovirus ST1²⁵ et du Faustovirus LCD7 (données non publiées), nous avons étonnamment trouvé dans chaque assemblage deux génomes supplémentaires de deux nouveaux virus non identifiés dans les bases de données du génome public. Cependant, ni la cytométrie de flux ni la microscopie électronique de transmission (TEM) n'ont montré que les amibes étaient infectées par deux virus différents, le clandestinovirus ST1 et l'usurpativirus LCD7. Nous avons conçu des systèmes PCR spécifiques pour amplifier les marqueurs de Faustovirus, d'Usurpativirus et de Clandestinovirus respectivement en fonction de leurs génomes ; notre but était d'avoir des systèmes basés sur PCR qui permettent de vérifier la pureté des virus séparés. Cependant, la dilution et la cytométrie de flux de point final n'ont pas réussi à les séparer. L'isolement de cette population virale unique a été difficile parce que ni la morphologie ni les éléments réplicateurs des populations de clandestinovirus et d'usurpativirus n'ont été caractérisés. Nous avons détecté une seule population virale par cytométrie de flux due au chevauchement des deux populations (testéeaprès la séparation effective). Nous avons essayé de les séparer à l'aide d'un seul tri de particules sur des plaques de 96 puits, mais nous n'avons observé aucun effet cytopathique, et nous n'avons détecté ni clandestinovirus ni usurpativirus par amplification PCR. Enfin, ce n'est que la combinaison de la dilution des points de terminaison suivie d'une seule micro-aspiration à l'amibe qui a permis la séparation de ces deux virus géants à faible abondance des Faustovirus. Cette méthode de séparation fait l'objet de cet article.

Protocole

1. Culture Amoeba

1. Utilisez Vermamoeba vermiformis (souche CDC19) comme support cellulaire.
2. Ajouter 30 ml de protéase-peptone-levure extrait-glucose milieu (PYG) (tableau 1) et 3 ml d'amibes à une concentration de 1 x 10⁶ cellules/mL dans un flacon de culture cellulaire de 75 cm^2.
3. Maintenir la culture à 28 oC.
4. Après 48 h, quantifier les amibes à l'aide de diapositives de comptage.
5. Pour rincer, récolter les cellules à une concentration de 1 x 10⁶ cellules/mL et granuler les amibes par centrifugation à 720 x g pendant 10 min. Retirez le supernatant et suspendez le granule dans le volume approprié du milieu de famine pour obtenir 1 x 10⁶ cellules/mL (tableau 1).

2. Propagation du virus des stocks dans les amibes

REMARQUE: Avant la dilution, il est important de culture de l'échantillon de stock pour obtenir suffisamment de culture fraîche, puis procéder à la filtration.

1. Utilisez 1 x 10⁶ de la culture de l'amibe dans le milieu de la famine.
2. Inoculer le mélange de virus émis par la solution stock (Faustovirus/Usurpativirus LCD7 ou Faustovirus/Clandestinovirus ST1) après le processus de co-culture sur le support cellulaire à une multiplicité d'infection (MOI) de 0,01.
   REMARQUE: Le MOI est important pour réduire l'abondance de la population virale majeure et le nombre de cellules infectées.
3. Incuber à 30 oC jusqu'à ce que les effets cytopathiques (CPE) soient induits, comme l'arrondi de l'amibal ou la lyse, environ 10 à 14 h après l'infection.
4. Recueillir les supports et les filtrate à travers un filtre de 5 m pour enlever les débris cellulaires.

3. Dilution de point final

1. Effectuer une dilution en série (10^-1 à 10^-11) de l'échantillon viral dans le milieu de la famine (tableau 1).
2. Inoculer 2 ml de 1 x 10⁶ Vermamoeba vermiformis contenudans chaque plat Petri avec 100 l l de l'inoculum de mélange.
3. Placer la vaisselle Petri dans un sac en plastique hermétique à 30 oC.
4. Commencez à observer les plats Petri avec microscopie optique inversée à 6 h postinfection et vérifiez la morphologie cellulaire tous les 4 à 8 h.
5. À l'apparition de l'effet cytopathique caractérisé par les cellules arrondies, commencer le processus de micro-aspiration à cellule unique.

4. Micro-aspiration à cellule unique

1. Préparez l'hôte.
   REMARQUE: Cette préparation est faite pour la libération de cellules individuelles infectées à un soutien cellulaire frais.
   1. Traiter les amibes dans la culture avec un agent antimicrobien contenant 10 g/mL de vancomycine, 10 g/mL d'imipenem, 20 g/mL de ciprofloxacine, 20 g/mL de doxycycline et 20 g/mL de voriconazole. Ce mélange est utilisé pour éviter la contamination bactérienne et fongique.
      REMARQUE: La procédure se déroule sur un banc à l'extérieur de la station de sécurité microbiologique. Ajouter 2 ml d'amibes concentrées à 1 x 10⁶ cellules/mL chacune dans 15 plats Petri. Pour l'adhésion à l'amibe, incuber la culture à 30 oC pendant 30 min.
2. Sélectionnez le plat Petri utilisé pour la micro-aspiration à partir de la dilution limite selon les critères suivants : 1) absence de contamination visible par des agents fongiques et bactériens, 2) preuve d'effet cytopathique des amibes due aux virus, et 3) prélyse et la phase d'arrondissement des amibes (pour éviter l'aspiration des particules virales).
3. Mettre en place un poste de travail avec les matériaux suivants (voir la figure 1A,B) :
   Micromanipulateur, qui permet un positionnement microcapillaire;
   Dispositif de pression de commande manuel, utilisé pour aspirer et libérer les cellules dans le microcapillary;
   microscope inversé;
   Branchez et jouez aux modules moteurs;
   Appareil photo;
   Module informatique pour visualiser la manipulation et prendre des photos.
4. Choisissez un microcapillary (voir Figure 1C).
   REMARQUE: La taille des cellules, la déformation et l'adhérence de leurs membranes aux surfaces, et la motilité cellulaire peuvent avoir un impact sur le bon déroulement de la micro-aspiration. Le diamètre microcapillaire peut être choisi avec précision et adapté à des types de cellules spécifiques en fonction de leur taille et de leurs méthodes d'aspiration. Un microcapillaire de 20 m de diamètre intérieur a été utilisé pour aspirer une amibe arrondie (diamètre de 10 m). Cela permet l'entretien d'une position interne et une libération facile de la cellule.
5. Montez le système.
   1. Fixez l'angle de fonctionnement du système de préhension sur le module motorisé à 45 degrés.
   2. Effectuer une double installation, d'abord sur le système de préhension, puis sur le microcapillary.
   3. Concentrez-vous sur les cellules après avoir fait fonctionner quelques gouttes d'huile à travers le microcapillaire.
      REMARQUE: L'huile minérale avec compatibilité biologique est fournie par l'appareil.
   4. Montage complet suivant les recommandations du fabricant.
6. Cellules clones (voir Figure 2A,B).
   REMARQUE : Cette procédure est similaire à celle décrite par Frôhlich et Konig³¹.
   1. Placer le plat Petri contenant 2 ml d'amibes infectées sous le microscope.
   2. Concentrez-vous d'abord sur les cellules, puis sur le microcapillaire immergé dans la culture.
   3. Choisissez une cellule unique arrondie et rapprochez le microcapillary du micromanipulateur.
   4. Exercez une aspiration douce avec un contrôle manuel de la pression sur la cellule, en la prenant à l'intérieur du microcapillaire. Retirez la cellule unique du premier échantillon et relâchez-la dans le support cellulaire, puis incubez-la à 30 oC.
   5. Effectuez des observations quotidiennes avec un microscope optique inversé pour observer l'apparence des cellules et pour surveiller l'émergence de l'effet cytopathique.

5. Dépistage PCR

REMARQUE: Après l'étape 4, un dépistage systématique par PCR est crucial pour confirmer la séparation. Dans les systèmes usurpativirus/Faustovirus et clandestinovirus/Faustovirus, la conception et l'application des systèmes spécifiques d'apprêt et de sonde ont été faites à l'aide de Primer-BLAST en ligne³² (tableau 2).

1. Extraire l'ADN d'une partie des échantillons de culture positive (c.-à-d. où un effet cytopathique est observé), à l'aide d'un système d'extraction automatisé selon le protocole du fabricant.
2. Utilisez des amorces bien conçues.
   REMARQUE: Ici, nous avons conçu des amorces pour amplifier les gènes de base annotés comme RpB2 (Faustovirus), LCD7 protéine capside majeure (Usurpatvirus) et protéine capside mineure (Clandestinovirus)
3. Effectuez PCR standard à l'aide d'un thermocycler.
   1. Effectuer 20 réactions PCR ll avec 50 M de chaque amorce (tableau 2), 1x Master Mix, et de l'eau libre RNase.
   2. Activer la polymérase d'ADN Taq pendant 5 min à 95 oC, puis suivre avec 45 cycles de dénaturation de 10 s à 95 oC, annealing des amorces pour 30 s à 58 oC, et l'extension pour 30 s à 72 oC.
4. Exécuter les produits PCR sur un gel agarose de 1,5%, tache avec la tache de gel d'ADN (Tableau des matériaux), et visualiser avec UV.

6. Production et purification de virus

1. Remettre le reste de la culture du plat Petri dans un petit flacon.
2. Pour la production du virus, préparer 15 flacons de 145 cm², contenant 40 ml de vermiforme Vermamoeba dans le milieu de la famine et 5 ml du virus isolé déjà transféré du plat Petri à de petits flacons.
3. Traiter avec le même mélange antibiotique et antifongique utilisé à l'étape 4.1.
4. Incuber à 30 oC. Observez tous les jours avec la microscopie optique inversée.
5. Après l'infection complète, mettre en commun tous les flacons. Utilisez un filtre de 0,45 m pour éliminer les débris.
6. Ultracentrifuge tous les supernatants à 50.000 x g pendant 45 min.
7. Après centrifugation, retirer le supernatant de chaque tube par aspiration et resuspendre le granule dans 1 ml de phosphate tamponné salin (PBS).
8. Purifez le virus produit à l'aide de 25 % de saccharose (27,5 g de saccharose dans 100 ml de PBS, stérilisé par filtration).
9. Centrifugement 8 ml de saccharose et 2 ml de suspension virale à 80 000 x g pendant 30 min. Resuspendre la pastille virale dans 1 ml de PBS. Conservez-le à -80 oC.

7. Microscopie négative de la coloration et de la transmission d'électrons

REMARQUE: Bou Khalil et coll. ont déjà publié ce protocole²⁷.

1. Déposer 5 ll du supernatant de lyse sur la grille lumineuse. Laisser reposer environ 20 min à température ambiante.
   REMARQUE: La décharge lumineuse nous permet d'obtenir un réseau hydrophile par application de plasma.
2. Séchez soigneusement la grille et déposez une petite goutte de molybdate d'ammonium de 1 % pendant 10 s. Laissez la grille sécher pendant 5 min.
3. Procéder à des observations de microscopie électronique à 200 keV.

8. Caractérisation du clandestinovirus ST1 et de l'usurpativirus LCD7

1. Caractériser les populations pures de Clandestinovirus ST1 et Usurpativirus LCD7 en utilisant le séquençage du génome, l'assemblage du génome, les analyses bioinformatiques, et l'étude de leur cycle réplicif comme nous l'avons fait pour d'autres virus^{10,20, 29}.

Résultats

La micro-aspiration à cellule unique est un processus de micromanipulation optimisé dans ce manuscrit (figure 1). Cette technique permet la capture d'une amibe arrondie et infectée (figure 2A) et sa libération dans une nouvelle plaque contenant des amibes non infectées (figure 2). Il s'agit d'un prototype fonctionnel qui s'applique au système de co-culture et a réussi à isoler les virus géants non-lytiques....

Discussion

La durée de la manipulation de micro-aspiration à cellule unique et son bon fonctionnement dépendent de l'opérateur. Les différentes étapes de l'expérience exigent de la précision. L'utilisation des composants de micromanipulation du poste de travail doit être sous contrôle constant en observant le processus de micro-aspiration et la libération de la cellule. Le suivi par observation microscopique est nécessaire pour la capture et le transfert d'une cellule. Un opérateur expérimenté peut prendre 1 à 2 h p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose Standard	Euromedex	Unkown	Standard PCR
AmpliTaq Gold 360 Master Mix	Applied Biosystems	4398876	Standard PCR
CellTram 4r Oil	Eppendorf	5196000030	Control the cells during the microaspiration process
Corning cell culture flasks 150 cm2	Sigma-aldrich	CLS430825	Culture
Corning cell culture flasks 25 cm2	Sigma-aldrich	CLS430639	Culture
Corning cell culture flasks 75 cm2	Sigma-aldrich	CLS430641	Culture
DFC 425C camera	LEICA	Unkown	Observation/Monitoring
Eclipse TE2000-S Inverted Microscope	Nikon	Unkown	Observation/Monitoring
EZ1 advanced XL	Quiagen	9001874	DNA extraction
Glasstic Slide 10 with Counting Grids	Kova International	87144E	Cell count
Mastercycler nexus	Eppendorf	6331000017	Standard PCR
Microcapillary 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	Microaspiration and release of cells
Micromanipulator InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Microcapillary positioning
Nuclease-Free Water	ThermoFischer	AM9920	Standard PCR
Optima XPN Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	A94469	Virus purification
Petri dish 35 mm	Ibidi	81158	Culture/observation
Sterile syringe filters 5 µm	Sigma-aldrich	SLSV025LS	Filtration
SYBR green Type I	Invitrogen	unknown	Fluorescent molecular probes/flow cytometry
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	Standard PCR; DNA gel stain
Tecnai G20	FEI	Unkown	Electron microscopy
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor	BECKMAN COULTER	337922	Virus purification
Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2	BECKMAN COULTER	344058	Virus purification