JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем метод микроаспирации одной клетки для разделения инфицированных амеб. Для того, чтобы отделить вирусные субпопуляции в Vermamoeba vermiformis, инфицированных faustoviruses и неизвестных гигантских вирусов, мы разработали протокол подробно ниже и продемонстрировали его способность отделить два низкого изобилия новых гигантских вирусов.

Аннотация

Во время процесса кокультуры амебы, более одного вируса могут быть изолированы в одном колодце. Ранее мы решили эту проблему путем разбавления конечных точек и/или флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS), применяемой к вирусной популяции. Однако, когда вирусы в смеси имеют схожие морфологические свойства и один из вирусов размножается медленно, наличие двух вирусов обнаруживается на стадии сборки генома и вирусы не могут быть разделены для дальнейшей характеристики. Чтобы решить эту проблему, мы разработали процедуру микроаспирации, которая позволяет отделять и клонировать очень похожие вирусы. В настоящей работе мы представляем, как эта альтернативная стратегия позволила нам отделить небольшие вирусные субпопуляции clandestinovirus ST1 и Usurpativirus LCD7, гигантские вирусы, которые растут медленно и не приводят к амебальному лисису по сравнению с литиком и быстрорастущим Фаустовирус. Контроль чистоты оценивался по специфическим усиливанию генов, и для дальнейшей характеристики были созданы вирусы.

Введение

Нуклеоцитоплазмамические крупные ДНК-вирусы (NCLDV) чрезвычайно разнообразны, определяемые четырьмя семьями, которые заражают эукариоты1. Первые описанные вирусы с геномами выше 300 кбит/с были Phydcodnaviridae, в том числе Paramecium бурсария хлореллы вирус 1 PBCV12. Изоляция и первое описание Мимивируса, показали, что размер вирусов удвоился как с точки зрения размера частицы (450 нм) и длины генома (1,2 Мб)3. С тех пор многие гигантские вирусы были описаны, как правило, изолированы с помощью амебы совместной культуры процедуры. Несколько гигантских вирусов с различными морфологиями и генетическим содержанием могут быть выделены из клеток Acanthamoeba sp., включая Марсельскиевирусы, Пандоравирусы, Питховирусы, Молливирус, Седратвирусы, Pacmanvirus, Tupanvirus, и в последнее время Медузавирус4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Параллельно изоляция Vermamoeba vermiformis позволила изоляции и описания гигантских вирусов Faustovirus, Kaumoebavirus, и Орфеовирус18,19,20. Другие гигантские вирусы были изолированы с их принимающей протеистов, таких как кафетерий roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina ericina23, и Бодо saltans 24. Все эти изоляции были результатом увеличения числа групп, работающих над изоляцией и введением обновлений стратегии высокой пропускной связи25,26,27,28,таких как улучшение системы совместной культуры с использованием цитометрии потока.

В 2016 году мы использовали стратегию, связывающую кокультуру и цитометрию потока, чтобы изолировать гигантские вирусы27. Эта стратегия была разработана для увеличения количества образцов, чтобы диверсифицировать протистов, используемых в качестве клеточных опор, и быстро обнаружить лиза клеточной поддержки. Система была обновлена путем добавления дополнительного шага, чтобы избежать предварительной молекулярной биологии идентификации и быстрого обнаружения неизвестной вирусной популяции, как в случае Pacmanvirus29. Соединение цитометрии потока к сортировке клеток позволило разделить смесь мимивируса и седратвируса А1130. Однако позже мы столкнулись с ограничениями разделения и обнаружения этих вирусных субпопуляций цитометрией потока. После секвенирования, когда мы собрали геномы Faustovirus ST125 и Faustovirus LCD7 (неопубликованные данные), мы удивительно обнаружили в каждой сборке два дополнительных генома двух новых вирусов, не идентифицированных в базах данных общественного генома. Однако ни цитометрия потока, ни электронная микроскопия передачи (ТЭМ) не показали, что амебы были заражены двумя различными вирусами: Clandestinovirus ST1 и Usurpativirus LCD7. Мы разработали специальные ПЦР-системы для усиления маркеров Фаустовируса, Усурпативируса и кландедестовируса соответственно на основе их геномов; нашей целью было наличие систем на основе ПЦР, которые позволяют проверить чистоту разделенных вирусов. Однако, конечная точка разбавления и потока цитометрии не удалось разделить их. Изоляция этой единственной вирусной популяции была трудной, поскольку ни морфология, ни репликационные элементы популяций кландестовируса и узурпативируса не были охарактеризованы. Мы обнаружили только одну вирусную популяцию цитометрией потока из-за перекрытия двух популяций (проверено после эффективного разделения). Мы пытались разделить их с помощью сортировки одной частицы на 96-колодцах пластинах, но не наблюдали никаких цитопатических эффектов, и мы не обнаружили ни кландестовируса, ни усурпативируса при усилении ПЦР. Наконец, только сочетание разбавления конечной точки, за которым последовало микроапиратное амеба, позволило отделить эти два гигантских вируса с низким изобилием от фаустовирусов. Этот метод разделения является объектом этой статьи.

протокол

1. Культура Амебы

  1. Используйте Vermamoeba vermiformis (напряжение CDC19) в качестве поддержки клеток.
  2. Добавьте 30 мл протеазы-пептон-дрожжи экстракт-глюкоза среднего (PYG)(Таблица 1) и 3 мл амеба в концентрации 1 х 106 клеток / мл в 75 см2 колбы культуры клеток.
  3. Поддерживайте культуру при 28 градусах Цельсия.
  4. После 48 ч количествуа амеб с помощью подсчитывающих слайдов.
  5. Для промывки, урожай клеток в концентрации 1 х 106 клеток / мл и гранулы амеба путем центрифугирования при 720 х г в течение 10 мин. Удалить супернатант и повторной гранулы в соответствующем объеме голодания среды для получения 1 х 106 клетки/мл(таблица 1).

2. Распространение фондового вируса в Amoebae

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед разбавлением, важно культуры запас образца для получения достаточного количества свежей культуры, а затем приступить к фильтрации.

  1. Используйте 1 х 106 культуры амебы в среде голода.
  2. Прививать смесь вирусов, выданных из фондового раствора (Faustovirus/Usurpativirus LCD7 или Faustovirusvirus/Clandestindovirus ST1) после процесса совместной культуры на клеточной поддержке при многообразии инфекции (MOI) 0,01.
    ПРИМЕЧАНИЕ: МВД важно уменьшить обилие основной вирусной популяции и количество инфицированных клеток.
  3. Инкубировать при 30 градусах Цельсия до тех пор, пока не будут индуцированы цитопатические эффекты (CPE), такие как округление амеб или лиза, примерно от 10 до 14 ч после заражения.
  4. Соберите средства массовой информации и фильтрации через фильтр 5 мкм для удаления клеточного мусора.

3. Разбавление конечных точек

  1. Выполните серийное разбавление (10-1 до 10-11) вирусного образца в среде голодания(таблица 1).
  2. Прививать 2 мл 1 х 106 Vermamoeba vermiformis, содержащиеся в каждом блюде Петри с 100 зл инокулум смеси.
  3. Поместите посуду Петри в герметичный полиэтиленовый пакет при 30 градусах Цельсия.
  4. Начните наблюдать за чашками Петри с перевернутой оптической микроскопией при постинфекции 6 ч и проверьте морфологию клеток каждые 4-8 ч.
  5. При появлении цитопатического эффекта, характеризующегося округлением клеток, начинается процесс микроаспирации одной клетки.

4. Одноклеточная микроаспирация

  1. Подготовьте услик.
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Этот препарат производится для выпуска инфицированных одиночных клеток в поддержку свежих клеток.
    1. Лечить амебы в культуре с антимикробным агентом, содержащим 10 мкг/мл ванкомицина, 10 мкг/мл имипенема, 20 мкг/мл ципрофлоксацина, 20 мкг/мл доксициклина и 20 мкг/мл вориконазола. Эта смесь используется, чтобы избежать бактериального и грибкового загрязнения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура проходит на скамейке возле станции микробиологической безопасности. Добавьте 2 мл амеб, сосредоточенных на 1 х 106 клеток/мл каждый в 15 блюд Петри. Для присоединения амебы, инкубировать культуру при 30 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
  2. Выберите чашку Петри, используемую для микро-аспирации от предельного разбавления в соответствии со следующими критериями: 1) отсутствие видимого загрязнения грибковыми и бактериальными агентами, 2) доказательства цитопатического эффекта амеб из-за вирусов, и 3) прелиза и округление фазы амеба (во избежание аспирации вирусных частиц).
  3. Настройка рабочей станции со следующими материалами (см. Рисунок 1A,B):
    Микроманипуликотор, позволяющий позиционировать микрокапиллярные;
    Ручное устройство давления управления, используемое для аспирирома и выпуска клеток в микрокапилляр;
    Перевернутый микроскоп;
    Подключайте и играйте в моторные модули;
    Камера;
    Компьютерный модуль для визуализации манипуляций и съемки.
  4. Выберите микрокапилляр (см. рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер клеток, деформация и прилипание их мембран к поверхностям, а также подвижность клеток могут влиять на плавный прогресс микроаспирации. Диаметр микрокапилляров может быть точно выбран и адаптирован к определенным типам клеток в зависимости от их размеров и методов аспирации. Для аспирирования округляющей амебы (диаметром 10 мкм) использовался микрокапилляр внутреннего диаметра 20 мкм. Это позволяет поддерживать внутреннее положение и легко высвобождение клетки.
  5. Смонтировать систему.
    1. Зафиксировать угол работы системы захвата на моторизованном модуле на уровне 45 градусов.
    2. Выполните двойную установку, сначала на сжимающей системе, а затем на микрокапилляре.
    3. Сосредоточьтесь на клетках после запуска нескольких капель масла через микрокапилляр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минеральное масло с биологической совместимостью поставляется устройством.
    4. Полная установка в соответствии с рекомендациями производителя.
  6. Ячейки клонов (см. Рисунок 2A,B).
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Эта процедура аналогична той, описанной Фредериком и Кёнигом31.
    1. Поместите чашку Петри, содержащую 2 мл инфицированных амеб под микроскопом.
    2. Сосредоточьтесь сначала на клетках, а затем на микрокапилляре, погруженном в культуру.
    3. Выберите округлую одну ячейку и принесите микрокапилляр ближе к микроманипулятору.
    4. Осуществлять мягкое стремление с ручным контролем давления на клетку, принимая его внутрь микрокапилляра. Удалите одну ячейку из первого образца и выпустите в клеточной поддержке, затем инкубировать ее при 30 градусах Цельсия.
    5. Проводите ежедневные наблюдения с перевернутым оптическим микроскопом для наблюдения за появлением клеток и мониторинга появления цитопатического эффекта.

5. ПЦР скрининг

ПРИМЕЧАНИЕ: После 4-го шага систематический скрининг ПЦР имеет решающее значение для подтверждения разделения. В обоих Усурпативирус / Фаустовирус и Подпольовирус / Фаустовирус, проектирование и применение конкретных грунтовки и зонд системы были сделаны с помощью Primer-BLAST онлайн32 (Таблица 2).

  1. Извлекайте ДНК из части образцов положительной культуры (т.е. при наблюдении цитопатического эффекта), используя автоматизированную систему экстракции в соответствии с протоколом производителя.
  2. Используйте надлежащим образом разработанные грунтовки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы разработали праймеры для усиления основных генов, аннотированных как RpB2 (Faustovirus), LCD7 основных капсидов белка (Usurpatvirus) и незначительные капсид белка (Clandestinovirus)
  3. Выполните стандартный ПЦР с помощью термоциклора.
    1. Проведите 20 реакций ПЦР с 50 мкм каждой грунтовки(Таблица 2),1x Master Mix и свободной водой RNase.
    2. Активируйте полимераза ДНК Taq в течение 5 мин при 95 градусах По Цельсию, затем следуйте 45 циклов 10 s денатурации при 95 градусах Цельсия, аннулирование грунтовки для 30 s при 58 градусах По Цельсию, и расширение на 30 с при 72 градусах по Цельсию.
  4. Запустите продукты ПЦР на 1,5% агарозный гель, пятно с пятном геля ДНК(Таблица материалов),и визуализировать с УФ.

6. Производство и очистка вирусов

  1. Положите остальную часть культуры чашки Петри обратно в небольшую колбу.
  2. Для производства вируса приготовьте 15 колб по 145 см2,содержащих 40 мл Vermamoeba vermiformis в среде голодания и 5 мл изолированного вируса, уже перенесенного из чашки Петри в небольшие фляги.
  3. Лечить с тем же антибиотиком и противогрибковой смеси, используемой в шаге 4.1.
  4. Инкубировать при 30 градусах Цельсия. Наблюдайте каждый день с перевернутой оптической микроскопией.
  5. После полной инфекции, бассейн все фляги. Используйте фильтр 0,45 мкм для устранения мусора.
  6. Ультрацентрифуг все супернатанты на 50000 х г в течение 45 мин.
  7. После центрифугации, удалить супернатант из каждой трубки по аспирации и повторной гранулы в 1 мл фосфата буферного солевой (PBS).
  8. Очистите вирус, вырабатываемый с использованием 25% сахарозы (27,5 г сахарозы в 100 мл PBS, стерилизованной фильтрацией).
  9. Centrifuge 8 мл сахарозы и 2 мл вирусной подвески при 80 000 х г в течение 30 мин. Отреждайте вирусные гранулы в 1 мл PBS. Храните его при -80 градусах по Цельсию.

7. Отрицательная опрыски и трансмиссионная микроскопия

ПРИМЕЧАНИЕ: Bou Khalil et al. ранее опубликовали этот протокол27.

  1. Депозит 5 Зл л супернатанта лисиса на светящуюся сетку. Оставьте примерно на 20 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Светящийся разряд позволяет нам получить гидрофиловскую сетку с помощью плазменного применения.
  2. Тщательно высушите сетку и напишите на нее небольшое падение в 1% аммония на 10 с. Оставьте сетку высохнуть в течение 5 мин.
  3. Приступайке к наблюдениям электронной микроскопии при 200 кэВ.

8. Характеристика подпольноговируса ST1 и усурпативирусного LCD7

  1. Характеризуйте чистые популяции Clandestinovirus ST1 и Usurpativirus LCD7 с использованием секвенирования генома, сборки генома, биоинформатики анализов и изучения их репликативного цикла, как мы сделали для других вирусов10,20, 29.

Результаты

Одноклеточная микроаспирация — это процесс микроманипуляции, оптимизированный в данной рукописи(рисунок 1). Этот метод позволяет захватить округлые, инфицированные амебы(Рисунок 2)и его выпуск в новой пластине, содержащей неинфицированных аме...

Обсуждение

Продолжительность обработки микроаспирации одной ячейки и ее хорошее функционирование зависят от оператора. Различные этапы эксперимента требуют точности. Использование микроманипуляций компонентов рабочей станции должно находиться под постоянным контролем, наблюдая за процессом...

Раскрытие информации

Всем авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить как Jean-Pierre Baudoin, так и Оливье Мбарек за их советы и Клэр Андреани за ее помощь в коррекции и модификации английского языка. Эта работа была поддержана грантом от французского государства, управляемым Национальным исследовательским агентством в рамках программы «Инвестиции в будущее» с помощью anR-10-IAHU-03 (Инфекция Медитерране) и Региона Провансальских Альп Лазурный берег и европейское финансирование FEDER PRIMI.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose StandardEuromedexUnkownStandard PCR
AmpliTaq Gold 360 Master MixApplied Biosystems4398876Standard PCR
CellTram 4r OilEppendorf5196000030Control the cells during the microaspiration process
Corning cell culture flasks 150 cm2Sigma-aldrichCLS430825Culture
Corning cell culture flasks 25 cm2Sigma-aldrichCLS430639Culture
Corning cell culture flasks 75 cm2Sigma-aldrichCLS430641Culture
DFC 425C cameraLEICAUnkownObservation/Monitoring
Eclipse TE2000-S Inverted MicroscopeNikonUnkownObservation/Monitoring
EZ1 advanced XLQuiagen9001874DNA extraction
Glasstic Slide 10 with Counting GridsKova International87144ECell count
Mastercycler nexusEppendorf6331000017Standard PCR
Microcapillary 20 µmEppendorf5175 107.004Microaspiration and release of cells
Micromanipulator InjectMan NI2Eppendorf631-0210Microcapillary positioning
Nuclease-Free WaterThermoFischerAM9920Standard PCR
Optima XPN UltracentrifugeBECKMAN COULTERA94469Virus purification
Petri dish 35 mmIbidi81158Culture/observation
Sterile syringe filters 5 µmSigma-aldrichSLSV025LSFiltration
SYBR green Type IInvitrogenunknownFluorescent molecular probes/flow cytometry
SYBR SafeInvitrogenS33102Standard PCR; DNA gel stain
Tecnai G20FEIUnkownElectron microscopy
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium RotorBECKMAN COULTER337922Virus purification
Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2BECKMAN COULTER344058Virus purification

Ссылки

  1. Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses. Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).
  2. Li, Y., et al. Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome. Virology. 237 (2), 360-377 (1997).
  3. Scola, B. L. A Giant Virus in Amoebae. Science. 299 (5615), 2033 (2003).
  4. Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
  5. Antwerpen, M. H., et al. Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba. Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).
  6. Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).
  7. Legendre, M., et al. In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).
  8. Legendre, M., et al. Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family. Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).
  9. Aherfi, S., et al. A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses. Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).
  10. Andreani, J., et al. Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses. Viruses. 8 (11), 300 (2016).
  11. Rodrigues, R. A. L., et al. Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses. Journal of Virology. , 00372 (2018).
  12. Bertelli, C., et al. Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity. Environmental Microbiology. , (2017).
  13. Levasseur, A., et al. Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution. Genome Biology and Evolution. , (2016).
  14. Dornas, F. P., et al. A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae. Viruses. 8 (3), 76 (2016).
  15. Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water. Journal of Virology. , (2019).
  16. Legendre, M., et al. Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes. Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).
  17. Abrahão, J., et al. Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere. Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).
  18. Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).
  19. Bajrai, L., et al. Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae. Viruses. 8 (12), 278 (2016).
  20. Andreani, J., et al. Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses. Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).
  21. Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).
  22. Moniruzzaman, M., et al. Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution. Virology. 466-467, 60-70 (2014).
  23. Gallot-Lavallée, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family. Journal of Virology. , (2017).
  24. Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea. eLife. 7, 235 (2018).
  25. Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).
  26. Khalil, J. Y. B., et al. High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining. Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).
  27. Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).
  28. Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. Updating strategies for isolating and discovering giant viruses. Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).
  29. Andreani, J., et al. Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses. Journal of Virology. , (2017).
  30. Khalil, J. Y. B., et al. Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).
  31. Fröhlich, J., König, H. New techniques for isolation of single prokaryotic cells. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).
  32. Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).
  33. Kimura, Y., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

152Vermamoeba vermiformFACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены