Micro-aspirazione a cella singola come strategia alternativa per lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza per la separazione delle miscele di virus giganti

Riepilogo

Qui, descriviamo un metodo di microaspirazione a singola cellula per la separazione delle amebe infette. Al fine di separare le sottopopolazioni virali in Vermamoeba vermiformis infettate da Faustovirus e virus giganti sconosciuti, abbiamo sviluppato il protocollo descritto di seguito e dimostrato la sua capacità di separare due nuovi virus giganti a bassa abbondanza.

Abstract

Durante il processo di co-coltura dell'ameba, più di un virus può essere isolato in un unico pozzo. In precedenza abbiamo risolto questo problema per diluizione all'estremità e/o la fluorescenza, applicato alla popolazione virale per la diluizione e/o la fluorescenza. Tuttavia, quando i virus nella miscela hanno proprietà morfologiche simili e uno dei virus si moltiplica lentamente, la presenza di due virus viene scoperta nello stadio di assemblaggio del genoma e i virus non possono essere separati per un'ulteriore caratterizzazione. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato una procedura di microaspirazione a singola cellula che consente la separazione e la clonazione di virus altamente simili. Nel presente lavoro, presentiamo come questa strategia alternativa ci ha permesso di separare le piccole sottopopolazioni virali del Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7, virus giganti che crescono lentamente e non portano a lisi ameaka rispetto alla litetica e in rapida crescita Faustovirus. Il controllo della purezza è stato valutato da specifici virus e amplificazione genica per un'ulteriore caratterizzazione.

Introduzione

I virus del DNA di grandi dimensioni nucleocitoplasmatici (NCLDV) sono estremamente diversi, definiti da quattro famiglie che infettano gli eucarioti¹. I primi virus descritti con genomi superiori a 300 kbp sono stati Phydcodnaviridae, tra cui il virus paramecium bursaria Chlorella 1 PBCV1². L'isolamento e la prima descrizione di Mimivirus, ha mostrato che la dimensione dei virus è raddoppiata sia in termini di dimensioni della particella (450 nm) che di lunghezza del genoma (1,2 Mb)³. Da allora, sono stati descritti molti virus giganti, di solito isolati utilizzando una procedura di co-coltura ameba. Diversi virus giganti con diverse morfologie e contenuti genetici possono essere isolati dalle cellule di Acanthamoeba sp., tra cui Marseillevirus, Pandoravirus, Pithovirus, Mollivirus, Cedratvirus, Pacmanvirus, Tupanvirus, e recentemente Medusavirus^{4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,}16^,17. Parallelamente, l'isolamento di Vermamoeba vermiformis ha permesso l'isolamento e la descrizione dei virus giganti Faustovirus, Kaumoebavirus e Orpheovirus^18,19,20. Altri virus giganti sono stati isolati con i loro protisti ospiti, come Cafeteria roenbergensis²¹, Aureococcus anophagefferens²², Chrysochromulina ericina²³, e Bodo saltans ²⁴. Tutti questi isolati sono il risultato di un numero crescente di team che lavorano sull'isolamento e dell'introduzione di aggiornamenti della strategia ad alta velocità effettiva^25,26,27,28, come il miglioramento del sistema di cocoltura con l'uso della citometria di flusso.

Nel 2016 abbiamo utilizzato una strategia che associa la cocultura e la citometria di flusso per isolare i virus giganti²⁷. Questa strategia è stata sviluppata per aumentare il numero di campioni inoculati, per diversificare i protisti usati come supporti cellulari e per rilevare rapidamente la lisi del supporto cellulare. Il sistema è stato aggiornato aggiungendo un passo supplementare per evitare l'identificazione preliminare della biologia molecolare e la rapida individuazione di una popolazione virale sconosciuta come nel caso del Pacmanvirus²⁹. La citometria del flusso di accoppiamento allo smistamento cellulare ha permesso la separazione di una miscela di Mimivirus e Cedratvirus A11³⁰. Tuttavia, in seguito abbiamo incontrato i limiti della separazione e del rilevamento di queste sottopopolazioni virali per citometria di flusso. Dopo il sequenziamento, quando abbiamo assemblato i genomi di Faustovirus ST1²⁵ e Faustovirus LCD7 (dati inediti), abbiamo sorprendentemente trovato in ogni assemblaggio due genomi supplementari di due nuovi virus non identificati nei database pubblici del genoma. Tuttavia, né la citometria di flusso né la microscopia elettronica di trasmissione (TEM) hanno mostrato che le amebe sono state infettate da due virus diversi, Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7. Abbiamo progettato sistemi PCR specifici per amplificare i marcatori Faustovirus, Usurpativirus e Clandestinovirus rispettivamente in base ai loro genomi; il nostro scopo era quello di avere sistemi pcR-based che consentono la verifica della purezza dei virus separati. Tuttavia, la diluizione dell'estremità puntino e la citometria di flusso non sono riusciti a separarli. L'isolamento di questa singola popolazione virale è stato difficile perché non sono stati caratterizzati né la morfologia né gli elementi replicativi delle popolazioni di Clandestino virus e Usurpativirus. Abbiamo rilevato una sola popolazione virale per citometria di flusso a causa della sovrapposizione delle due popolazioni (testata dopo l'effettiva separazione). Abbiamo cercato di separarli usando lo smistamento di singole particelle su piastre di 96 pozzi, ma non abbiamo osservato alcun effetto citopatico, e abbiamo rilevato né Il Clandestinovirus né l'Usurpativirus dall'amplificazione PCR. Infine, è stata solo la combinazione di diluizione del punto finale seguita da una singola micro-aspirazione di ameba che ha permesso la separazione di questi due virus giganti a bassa abbondanza dai Faustovirus. Questo metodo di separazione è l'oggetto di questo articolo.

Protocollo

1. Cultura di Amoeba

1. Utilizzare Vermamoeba vermiformis (strain CDC19) come supporto cellulare.
2. Aggiungere 30 mL di proteasi-peptone-lievito medio di estratto-glucosio (PYG) (Tabella 1) e 3 mL di amebe ad una concentrazione di 1 x 10⁶ cellule/mL in un fiascheta di coltura cellulare 75 cm^2.
3. Mantenere la coltura a 28 gradi centigradi.
4. Dopo 48 h, quantificare le amebe utilizzando vetrine di conteggio.
5. Per sciacquare, raccogliere le cellule ad una concentrazione di 1 x 10⁶ cellule/mL e pellet l'amebae da centrifugazione a 720 x g per 10 min. Rimuovere il supernatante e ripagare il pellet nel volume appropriato del mezzo di fame per ottenere 1 x 10⁶ cells/mL (Tabella 1).

2. Propagazione del virus di riserva in Amebae

NOT: Prima della diluizione, è importante coltura il campione di stock per ottenere abbastanza cultura fresca, quindi procedere alla filtrazione.

1. Utilizzare 1 x 10⁶ della coltura ameba nel mezzo di fame.
2. Inoculare la miscela di virus emessi dalla soluzione di stock (Faustovirus/Usurpativirus LCD7 o Faustovirus/Clandestinovirus ST1) dopo il processo di co-coltura sul supporto cellulare a una molteplicità di infezione (MOI) di 0,01.
   NOT: Il MOI è importante per ridurre l'abbondanza della popolazione virale maggiore e il numero di cellule infette.
3. Incubare a 30 gradi centigradi fino a quando gli effetti citopatici (CPE) sono indotti, come l'arrotondamento ameato o il lisi, circa 10 a 14 h dopo l'infezione.
4. Raccogliere il supporto e filtrare attraverso un filtro di 5 m per rimuovere i detriti cellulari.

3. Diluizione del punto finale

1. Eseguire una diluizione seriale (da 10^-1 a 10^-11) del campione virale in mezzo di fame (Tabella 1).
2. Inoculare 2 mL di 1 x 10⁶ Vermiformis Di Vermamoeba contenuta in ogni piatto Petri con 100 l dell'inoculo della miscela.
3. Mettere i piatti Petri in un sacchetto di plastica sigillabile a 30 gradi centigradi.
4. Iniziare ad osservare i piatti Petri con microscopia ottica invertita a 6 h di post-infezione e controllare la morfologia cellulare ogni 4 a 8 h.
5. All'aspetto dell'effetto citopatico caratterizzato da arrotondamento delle cellule, iniziare il processo di microaspirazione a singola cellula.

4. Microaspirazione a cella singola

1. Preparare l'host.
   NOTA: Questa preparazione è fatta per il rilascio di singole cellule infette a un supporto cellulare fresco.
   1. Trattare l'amebae nella coltura con un agente antimicrobico che contiene 10 g/mL di vancomycin, 10 g/mL di imipenem, 20 g/mL di ciprofloxacin, 20 g/mL di doxycycline e 20 g/mL di voriconazolo. Questa miscela viene utilizzata per evitare la contaminazione batterica e fungina.
      NOT: La procedura si svolge su un banco al di fuori della stazione di sicurezza microbiologica. Aggiungere 2 mL di amebe concentrate a 1 x 10⁶ celle / mL ciascuna in 15 piatti Petri. Per l'aderenza all'ameba, incubare la coltura a 30 gradi centigradi per 30 min.
2. Selezionare il piatto Petri utilizzato per la microaspirazione dalla diluizione limite secondo i seguenti criteri: 1) assenza di qualsiasi contaminazione visibile da parte di agenti fungini e batterici, 2) prova di effetto citopatico delle amebe a causa dei virus, e 3) prelysis e la fase di arrotondamento delle amebe (per evitare l'aspirazione di particelle virali).
3. Impostare una workstation con i seguenti materiali (vedere la figura 1A,B):
   Micromanipolatore, che consente il posizionamento microcapillare;
   Dispositivo di pressione di controllo manuale, utilizzato per aspirare e rilasciare le cellule nel microcapillare;
   Microscopio invertito;
   Collegare e riprodurre i moduli motore;
   Fotocamera;
   Modulo computer per visualizzare la manipolazione e scattare foto.
4. Scegliere un microcapillare (vedere Figura 1C).
   NOT: La dimensione delle cellule, la deformazione e l'adesione delle loro membrane alle superfici e la motilità cellulare possono influenzare il progresso regolare della micro-aspirazione. Il diametro microcapillare può essere scelto con precisione e adattato a specifici tipi di cellule a seconda delle loro dimensioni e dei loro metodi di aspirazione. Un microcapillare di 20 m di diametro interno è stato utilizzato per aspirare un'ameba di arrotondamento (diametro di 10 m). Ciò consente la manutenzione di una posizione interna e un facile rilascio della cella.
5. Montare il sistema.
   1. Fissare l'angolo di funzionamento del sistema di presa sul modulo motorizzato a 45 gradi.
   2. Eseguire una doppia installazione, prima sul sistema di presa, e poi sul microcapillare.
   3. Concentrarsi sulle cellule dopo aver eseguito alcune gocce di olio attraverso il microcapillare.
      NOT: L'olio minerale con compatibilità biologica è fornito dal dispositivo.
   4. Montaggio completo seguendo le raccomandazioni del produttore.
6. Clonare le celle (vedere Figura 2A,B).
   NOTA: Questa procedura è simile a quella descritta da Frahlich e K'nig³¹.
   1. Mettere al microscopio la parabola Petri contenente 2 mL di amebe infette.
   2. Concentrarsi prima sulle cellule e poi sul microcapillare immerso nella coltura.
   3. Scegli una singola cellula arrotondata e avvicina il microcapillare al micromanipolatore.
   4. Esercitare aspirazione morbida con controllo manuale della pressione sulla cellula, prendendo all'interno del microcapillare. Rimuovere la singola cella dal primo campione e rilasciarlo nel supporto cellulare, quindi incubarla a 30 gradi centigradi.
   5. Condurre osservazioni quotidiane con un microscopio ottico invertito per osservare la comparsa delle cellule e per monitorare l'emergere dell'effetto citopatico.

5. Screening PCR

NOT: Dopo la fase 4, uno screening sistematico da parte della PCR è fondamentale per confermare la separazione. Sia in Usurpativirus/Faustovirus che in Clandestinovirus/Faustovirus, la progettazione e l'applicazione dei sistemi specifici di primer e sonda sono stati effettuati utilizzando Primer-BLAST online³² (Tabella 2).

1. Estrarre il DNA da una parte dei campioni di coltura positiva (cioè, dove si osserva un effetto citopatico), utilizzando un sistema di estrazione automatizzato secondo il protocollo del produttore.
2. Utilizzare primer progettati in modo appropriato.
   NOT: Qui abbiamo progettato primer per amplificare i geni del nucleo annotati come RpB2 (Faustovirus), proteina capsid principale LCD7 (Usurpatvirus) e proteina capside minore (Clanvirus)
3. Eseguire pcR standard utilizzando un termociclore.
   1. Eseguire 20 reazioni PCR l con 50 M di ogni primer (Tabella 2), 1x Master Mix e RNase acqua libera.
   2. Attivare la polimerasi del DNA Taq per 5 minuti a 95 gradi centigradi, quindi seguire con 45 cicli di 10 s denaturazione a 95 gradi C, annealing dei primer per 30 s a 58 gradi C, ed estensione per 30 s a 72 .
4. Eseguire i prodotti PCR su un gel di agarose 1.5%, macchia con macchia di gel di DNA (Tabella dei materiali) e visualizzare con UV.

6. Produzione e purificazione di virus

1. Rimettere il resto della cultura del piatto Petri in una piccola fiaschetta.
2. Per la produzione di virus, preparare 15 flaconi di 145 cm², contenenti 40 mL di vermiformis Vermamoeba in mezzo di fame e 5 mL del virus isolato già trasferito dalla piastra Petri a piccoli flaconi.
3. Trattare con la stessa miscela antibiotica e antifungina utilizzata al punto 4.1.
4. Incubare a 30 gradi centigradi. Osservare ogni giorno con microscopia ottica invertita.
5. Dopo l'infezione completa, piscina tutti i flaconi. Utilizzare un filtro da 0,45 m per eliminare i detriti.
6. Ultracentrifuga tutti i supernatanti a 50.000 x g per 45 min.
7. Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante da ogni tubo per aspirazione e rispendere il pellet in 1 mL di fosfato buffers salino (PBS).
8. Purificare il virus prodotto utilizzando il saccarosio 25% (27,5 g di saccarosio in 100 mL di PBS, sterilizzato dalla filtrazione).
9. Centrifuga 8 mL di saccarosio e 2 mL della sospensione virale a 80.000 x g per 30 min. Risospendere il pellet virale in 1 mL di PBS. Conservarlo a -80 gradi centigradi.

7. Microscopia elettronica di colorazione e trasmissione negativa

NOT: Bou Khalil ealtri pubblicato in precedenza questo protocollo²⁷.

1. Depositare 5 l del supernatante lisi sulla griglia scaricata dal bagliore. Lasciare agire per circa 20 min a temperatura ambiente.
   NOT: La scarica di bagliori ci permette di ottenere una rete idrofila dall'applicazione al plasma.
2. Asciugare accuratamente la griglia e depositare una piccola goccia di 1% di molybdate di ammonio su di esso per 10 s. Lasciare asciugare la griglia per 5 min.
3. Procedere con le osservazioni di microscopia elettronica a 200 keV.

8. Caratterizzazione del Clandestino virus ST1 e Usurpativirus LCD7

1. Caratterizzare le popolazioni pure di Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7 utilizzando il sequenziamento del genoma, l'assemblaggio del genoma, le analisi bioinformatiche e lo studio del loro ciclo replicativo come abbiamo fatto per altri virus^{10,20, 29}.

Risultati

La micro-aspirazione a cella singola è un processo di micromanipolazione ottimizzato in questo manoscritto (Figura 1). Questa tecnica consente l'acquisizione di un'ameba arrotondata e infettata (Figura 2A) e la sua uscita in una nuova lastra contenente amebe non infette (Figura 2). Si tratta di un prototipo funzionale che si applica al sistema di co-cultura e ha isolato con successo virus giganti non litici. Questo...

Discussione

La durata della gestione della microaspirazione a cella singola e il suo buon funzionamento dipendono dall'operatore. Le diverse fasi dell'esperimento richiedono precisione. L'uso dei componenti di micromanipolazione della postazione di lavoro deve essere sotto costante controllo osservando il processo di microaspirazione e il rilascio della cellula. Il follow-up per osservazione microscopica è necessario per la cattura e il trasferimento di una cellula. Un operatore esperto può prendere da 1 a 2 h per isolare 10 cellu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose Standard	Euromedex	Unkown	Standard PCR
AmpliTaq Gold 360 Master Mix	Applied Biosystems	4398876	Standard PCR
CellTram 4r Oil	Eppendorf	5196000030	Control the cells during the microaspiration process
Corning cell culture flasks 150 cm2	Sigma-aldrich	CLS430825	Culture
Corning cell culture flasks 25 cm2	Sigma-aldrich	CLS430639	Culture
Corning cell culture flasks 75 cm2	Sigma-aldrich	CLS430641	Culture
DFC 425C camera	LEICA	Unkown	Observation/Monitoring
Eclipse TE2000-S Inverted Microscope	Nikon	Unkown	Observation/Monitoring
EZ1 advanced XL	Quiagen	9001874	DNA extraction
Glasstic Slide 10 with Counting Grids	Kova International	87144E	Cell count
Mastercycler nexus	Eppendorf	6331000017	Standard PCR
Microcapillary 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	Microaspiration and release of cells
Micromanipulator InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Microcapillary positioning
Nuclease-Free Water	ThermoFischer	AM9920	Standard PCR
Optima XPN Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	A94469	Virus purification
Petri dish 35 mm	Ibidi	81158	Culture/observation
Sterile syringe filters 5 µm	Sigma-aldrich	SLSV025LS	Filtration
SYBR green Type I	Invitrogen	unknown	Fluorescent molecular probes/flow cytometry
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	Standard PCR; DNA gel stain
Tecnai G20	FEI	Unkown	Electron microscopy
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor	BECKMAN COULTER	337922	Virus purification
Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2	BECKMAN COULTER	344058	Virus purification