거대한 바이러스 혼합물 분리를 위한 형광 활성화 세포 분류에 대한 대체 전략으로서의 단일 세포 마이크로 포부

요약

여기서, 우리는 감염된 아메바의 분리를 위한 단일 세포 마이크로 흡인 방법을 기술한다. 파우스토바이러스와 알려지지 않은 거대 바이러스에 감염된 Vermamoeba vermiformis의 바이러스 하위 집단을 분리하기 위해, 우리는 아래에 자세히 설명된 프로토콜을 개발하고 두 개의 저풍부 신규 거대 바이러스를 분리하는 능력을 입증했습니다.

초록

아메바 공동 배양 과정 동안, 하나 이상의 바이러스가 단일 웰에서 단리될 수 있다. 우리는 이전에 바이러스 집단에 적용된 종점 희석 및/또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 이 문제를 해결했습니다. 그러나 혼합물의 바이러스가 유사한 형태학적 특성을 가지고 있고 바이러스 중 하나가 천천히 증식하면 게놈 조립 단계에서 두 바이러스의 존재가 발견되고 바이러스가 추가 특성화를 위해 분리 될 수 없습니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 매우 유사한 바이러스의 분리 및 복제를 허용하는 단일 세포 마이크로 흡인 절차를 개발했습니다. 본 작품에서, 우리는 이 대체 전략이 어떻게 우리가 Clandestinovirus ST1와 Usurpativirus LCD7의 작은 바이러스성 소집단을 분리하는 것을 허용하는지, 천천히 성장하고 용해 및 급속하게 성장하는 것에 비해 아메발 용해로 이끌어 내지 않는 거대한 바이러스를 제시합니다 파우스토바이러스. 순도 대조군은 특정 유전자 증폭에 의해 평가되었고 바이러스는 추가적인 특성화를 위해 생산되었다.

서문

핵세포질 대형 DNA 바이러스 (NCLDV)는 진핵생물^1을감염시키는 4개의 가족에 의해 정의된 극단적으로 다양합니다. 300 kbp 이상의 게놈을 가진 제1기 바이러스는 파라메치움 부르사리아 클로렐라 바이러스 1 PBCV1^2를포함하는 Phydcodnaviridae이었다. Mimivirus의 격리 및 첫 번째 설명은, 입자의 크기(450 nm)와 게놈(1.2 Mb)의 길이 모두에서 바이러스의 크기가 두 배로 증가한다는 것을 보여주었다^3. 그 이후로, 많은 거대한 바이러스는 아메바 공동 배양 절차를 사용하여 일반적으로 격리, 설명되었다. 상이한 형태와 유전적 내용을 가진 몇몇 거대한 바이러스는 마르세유바이러스, 판도라바이러스, 피토바이러스, 몰리바이러스, 세드라트바이러스, 팩만바이러스, 투판바이러스, 및 최근 을 포함하는 세포로부터 분리될 수 있다. 메두사 바이러스^4,5,6,7,8,^{9,10,11,12, 13,}14^,15,16,17. 이와 병행하여, Vermamoeba vermiformis의 격리는 파우스토바이러스, 카우모에바바이러스 및 오르페오바이러스^18,19,20의분리 및 설명을 허용했다. 다른 거대 바이러스는 카페테리아 로엔텐시스^21, 아우레오코커스 아노파페렌스^22, 크리소크로물리나 에리시나^23,보도 살탄과 같은 호스트 프로티스트와 함께 분리되었다. ²⁴. 이러한 모든 격리는 격리 작업 팀의 증가와 높은 처리량 전략 업데이트의 도입의 결과였다^25,26,27,28, 유세포분석의 사용과 함께 공동 배양 시스템의 개선.

2016년에는 거대 바이러스^27을분리하기 위해 공동 배양 및 유세포 분석과 연계전략을 사용했습니다. 이 전략은 접종된 샘플의 수를 늘리고, 세포 지원으로 사용되는 프로티스트를 다양화하고, 세포 지지체의 용해를 신속하게 검출하기 위해 개발되었습니다. 이 시스템은 Pacmanvirus^29의경우와 같이 예비 분자 생물학 식별 및 알 수없는 바이러스 집단의 빠른 검출을 피하기 위한 추가 단계를 추가하여 업데이트되었습니다. 미미바이러스와 세드라트바이러스 A11^30의혼합물을 분리할 수 있도록 세포 선별에 유동 세포분석. 그러나, 우리는 나중에 유세포측정에 의한 이러한 바이러스 성 하위 집단의 분리 및 검출의 한계를 만났다. 시퀀싱 후, 우리는 Faustovirus ST1²⁵ 및 Faustovirus LCD7 (미공개 데이터)의 게놈을 조립할 때, 우리는 놀랍게도 공공 게놈 데이터베이스에서 확인되지 않은 두 개의 새로운 바이러스의 두 개의 보충 게놈을 각 어셈블리에서 발견했습니다. 그러나, 유동 세포분석이나 투과 전자 현미경 검사법(TEM)은 아메바에가 두 가지 다른 바이러스인 클렌데스티노바이러스 ST1 및 우스르파티바이러스 LCD7에 감염된 것으로 나타났다. 우리는 그들의 게놈에 근거를 둔 파우스토바이러스, 우스르파티바이러스 및 클라데스티노바이러스 마커를 각각 증폭하기 위하여 특정 PCR 시스템을 설계했습니다; 우리의 목적은 분리되는 바이러스의 순도의 검증을 가능하게 하는 PCR 기반 시스템을 가지고 있었습니다. 그러나, 종점 희석 및 유세포세포는 이를 분리하지 못했다. 이 단 하나 바이러스성 인구의 고립은 Clandestinovirus와 Usurpativirus 인구의 형태 또는 복제 요소도 특징적이지 않았기 때문에 어려웠습니다. 우리는 두 집단의 중첩으로 인해 유동 세포측정에 의해 하나의 바이러스 집단을 검출했습니다 (효과적인 분리 후에 테스트). 우리는 96 웰 플레이트에 단일 입자 선별을 사용하여 그들을 분리하려고했지만, 우리는 어떤 세포 병증 효과를 관찰하지 않았다, 우리는 CLANDESTinovirus도 PCR 증폭에 의해 Usurpativirus를 감지하지 않았다. 마지막으로, 파우스토바이러스로부터 이 두 개의 저급한 거대 바이러스를 분리할 수 있게 한 것은 단 하나의 아메바 마이크로 포부에 이어 종점 희석의 조합일 뿐이었다. 이 분리 방법은 이 문서의 대상입니다.

프로토콜

1. 아메바 문화

1. Vermamoeba vermiformis (균주 CDC19)를 세포 지원으로 사용하십시오.
2. 프로테아제-펩톤-효모 추출물-글루코스 배지(PYG)(표1)와아메바의 3 mL를 75 cm² 세포 배양 플라스크에 1 x 10 6 세포/mL의 농도로 첨가한다.
3. 28°C에서 배양을 유지한다.
4. 48 시간 후, 계산 슬라이드를 사용하여 아메배를 정량화.
5. 헹구려면 세포를 1 x 10⁶ 세포 / mL의 농도로 수확하고 아메배를 원심 분리하여 10 분 동안 720 x g로 제거하십시오. 셀/mL(표1)을참조하십시오.

2. 아메바에 있는 주식 바이러스의 전파

참고: 희석 전에, 충분한 신선한 배양을 얻기 위해 스톡 샘플을 배양한 다음 여과를 진행하는 것이 중요하다.

1. 기아 매체에 아메바 배양액 1 x 10^6을 사용하십시오.
2. 0.01의 감염 (MOI)의 복합성에서 세포 지원에 공동 배양 과정 후 주식 용액 (Faustovirus / Usurpativirus LCD7 또는 파우스토 바이러스 / 클랜데스티노 바이러스 ST1)에서 발행 된 바이러스의 혼합물을 접종.
   참고: MOI는 주요 바이러스 성 인구의 풍부와 감염된 세포의 수를 줄이기 위해 중요하다.
3. 세포병증 효과(CPE)가 아메발 반올림 또는 라우징과 같은 유도될 때까지 30°C에서 배양하고, 감염 후 약 10~14시간 동안 배양한다.
4. 5 μm 필터를 통해 매체를 수집하고 여과하여 세포 이물질을 제거합니다.

3. 엔드 포인트 희석

1. 기아 배지에서 바이러스 성 샘플의 직렬 희석(10-1 ~^10-11)을수행한다(표1).
2. 각 페트리 접시에 포함된 1 x 10⁶ Vermamoeba vermiformis의 2 mL을 100 μL의 혼합물 접종으로 접종합니다.
3. 페트리 접시를 30°C의 밀봉 가능한 비닐 봉지에 넣습니다.
4. 6 h 후 감염에서 반전 된 광학 현미경 검사법으로 페트리 접시를 관찰하기 시작하고 4 ~ 8 h마다 세포 형태를 확인하십시오.
5. 반올림 세포를 특징으로하는 세포 병증 효과가 나타나면 단일 세포 미세 흡인 과정을 시작합니다.

4. 단세포 마이크로 포부

1. 호스트를 준비합니다.
   참고 : 이 제제는 감염된 단일 세포를 신선한 세포 지지체로 방출하기 위해 만들어졌습니다.
   1. 반코마이신 10 μg/mL, 이미페넴 10 μg/mL, 시프로플록사신 20 μg/mL, 독시사이클린 20 μg/mL, voriconazole 20 μg/mL를 함유한 항균제로 배양내의 아메바를 치료하십시오. 이 혼합물은 세균 및 곰팡이 오염을 피하기 위해 사용됩니다.
      참고: 절차는 미생물 안전 스테이션 외부의 벤치에서 이루어집니다. 1 x 10⁶ 세포 /mL에 농축 된 아메바 2 mL을 15 페트리 접시에 추가하십시오. 아메바 준수를 위해, 30 분 동안 30 °C에서 배양.
2. 다음 기준에 따라 제한 희석으로부터 마이크로 흡인에 사용되는 페트리 접시를 선택하십시오: 1) 곰팡이 및 세균제에 의한 눈에 보이는 오염의 부재, 2) 바이러스에 의한 아메바의 세포병증 효과의 증거, 3) 사전 용해 및 아메바의 반올림 단계 (바이러스 입자의 흡인을 피하기 위해).
3. 다음 재질로 워크스테이션 설정(그림 1A,B 참조):
   미세 모세관 위치 지정을 허용하는 미세 조작기;
   수동 제어 압력 장치, 세포를 흡입하고 미세 모세관으로 방출하는 데 사용;
   반전 된 현미경;
   플러그 앤 플레이 모터 모듈;
   카메라;
   조작을 시각화하고 사진을 찍을 수있는 컴퓨터 모듈.
4. 미세 모세관을 선택합니다(그림 1C참조).
   참고: 세포의 크기, 표면에 자신의 막의 변형 및 부착, 세포 운동성은 마이크로 포인의 원활한 진행에 영향을 미칠 수 있습니다. 미세 모세관 직경은 크기 및 포부 방법에 따라 특정 세포 유형에 정확하게 선택되고 적응될 수 있습니다. 20 μm 내경의 미세 모세관은 반올림 아메바 (직경 ~ 10 μm)를 흡인하는 데 사용되었다. 이를 통해 내부 위치의 유지 보수와 셀의 쉬운 릴리스가 가능합니다.
5. 시스템을 마운트합니다.
   1. 전동 모듈의 그립 시스템의 작동 각도를 45°로 고정합니다.
   2. 먼저 그리핑 시스템에, 그리고 미세 모세관에, 이중 설치를 수행합니다.
   3. 미세 모세관을 통해 오일 몇 방울을 실행 한 후 세포에 초점을 맞춥니다.
      참고: 생물학적 호환성을 가진 광유는 장치에 의해 공급됩니다.
   4. 제조업체의 권장 사항에 따라 완벽한 장착.
6. 복제 셀(그림 2A,B 참조).
   참고: 이 절차는 Fröhlich와 König^31에서설명한 절차와 유사합니다.
   1. 감염된 아메바 2mL를 함유한 페트리 접시를 현미경 아래에 놓습니다.
   2. 먼저 세포에 초점을 맞추고, 그 다음에 배양물에 침지된 미세 모세관에 집중한다.
   3. 둥근 단일 셀을 선택하고 미세 모세관을 마이크로 조작기에 더 가깝게 가져옵니다.
   4. 셀에 수동 압력 제어로 부드러운 포부를 발휘하여 미세 모세관 내부로 가져 가세요. 첫 번째 샘플에서 단일 세포를 제거하고 세포 지지체에서 방출한 다음 30°C에서 배양합니다.
   5. 세포의 모양을 관찰하고 세포 병증 효과의 출현을 모니터링하기 위해 반전 된 광학 현미경으로 매일 관찰을 수행합니다.

5. PCR 검열

참고: 4단계에 이어, PCR에 의한 체계적인 스크리닝은 분리를 확인하는 데 매우 중요하다. 우수르파티바이러스/파우스토바이러스와 클랜데스티노바이러스/파우스토바이러스 모두에서, 특정 프라이머 및 프로브 시스템의 설계 및 적용은 프라이머-BLAST 온라인^32(표 2)를사용하여 이루어졌다.

1. 양성 배양 샘플의 일부에서 DNA를 추출 (즉, 세포 병증 효과가 관찰되는 경우), 제조업체의 프로토콜에 따라 자동화 된 추출 시스템을 사용하여.
2. 적절하게 설계된 프라이머를 사용하십시오.
   참고: 여기에서 우리는 RpB2 (Faustovirus), LCD7 주요 capsid 단백질 (Usurpatvirus) 및 경미한 capsid 단백질 (Clandestinovirus)로 추가된 핵심 유전자를 증폭하는 프라이머를 설계했습니다.
3. 열전자전거를 사용하여 표준 PCR을 수행합니다.
   1. 각 프라이머(표2),1x 마스터 믹스 및 RNase 자유물로 20 μL PCR 반응을 수행합니다.
   2. 95°C에서 5분 동안 Taq DNA 폴리머라제를 활성화한 다음 95°C에서 10초변의 45사이클을 따라, 58°C에서 30초동안 프라이머를 어닐링하고, 72°C에서 30초동안 연장합니다.
4. PCR 제품을 1.5% 아가로즈 젤에 바르고 DNA 젤얼룩(재료 표)으로얼룩을 내고 UV로 시각화합니다.

6. 바이러스 생산 및 정화

1. 페트리 요리 문화의 나머지 부분을 작은 플라스크에 다시 넣습니다.
2. 바이러스 생산을 위해, 145 cm^2의15 플라스크를 준비, 기아 매체에 Vermamoeba vermiformis의 40 mL를 포함하고 이미 작은 플라스크에 페트리 접시에서 전송 된 고립 된 바이러스의 5 mL.
3. 4.1단계에서 사용된 항생제와 항진균성 혼합물과 동일한 것으로 치료한다.
4. 30 °C에서 배양하십시오. 거꾸로 된 광학 현미경으로 매일 관찰하십시오.
5. 완전한 감염 후 모든 플라스크를 풀합니다. 0.45 μm 필터를 사용하여 이물질을 제거하십시오.
6. 45 분 동안 50,000 x g의 모든 초원각을 초원지.
7. 원심분리 후, 포인에 의해 각 튜브에서 상상류를 제거하고 인산완충식염수(PBS)의 1 mL에서 펠릿을 다시 중단한다.
8. 25 % 자당을 사용하여 생성 된 바이러스를 정화하십시오 (PBS 100 mL에서 27.5 g의 자당, 여과에 의해 살균).
9. 원심분리기 8 mL의 자당과 2 mL의 바이러스 성 현탁액을 80,000 x g에서 30 분 동안. PBS의 1 mL에서 바이러스 성 펠릿을 다시 중단. -80 °C에서 보관하십시오.

7. 음성 염색 및 전송 전자 현미경 검사법

참고: Bou Khalil 외. 이전에이 프로토콜^27을발표했다.

1. 용해 상판의 5 μL을 광선 방출 그리드에 침전시합니다. 실온에서 약 20분 동안 그대로 둡니다.
   참고: 글로우 방전을 통해 플라즈마 적용에 의해 친수성 그리드를 얻을 수 있습니다.
2. 조심스럽게 그리드를 건조하고 10 초 동안 1 % 암모늄 몰리브 데이트의 작은 방울을 입금. 5 분 동안 건조 그리드를 둡니다.
3. 200 keV에서 전자 현미경 관찰을 진행합니다.

8. 클랜데스티노바이러스 ST1 및 우수르파티바이러스 LCD7의 특성화

1. 천체 시퀀싱, 게놈 조립, 생물 정보학 분석 및 다른 바이러스에 대해 수행 한 것처럼 복제 주기의 연구를 사용하여 Clandestinovirus ST1 및 Usurpativirus LCD7의 순수 인구를^{특성화10,20, 29}.

결과

단세포 마이크로 흡인은 이 원고에 최적화된 미세 조작 과정이다(도1). 이 기술은 둥근, 감염된 아메바(그림 2A)의포획을 가능하게하고 감염되지 않은 아메바(그림 2)를포함하는 새로운 판에서 방출한다. 그것은 공동 문화 시스템에 적용 하 고 성공적으로 비 lytic 거 대 한 바이러스를 격리 하는 기능 프로토 타입. 이 접...

토론

단일 셀 마이크로 흡인 처리의 지속 시간과 그 양호한 기능은 연산자 의존적입니다. 실험의 다른 단계에는 정밀도가 필요합니다. 워크스테이션의 미세 조작 성분의 사용은 마이크로 흡인 의 과정과 세포의 방출을 관찰하여 일정한 제어를 받아야합니다. 현미경 관찰에 의한 후속 조치는 세포의 포획 및 전달에 필요합니다. 숙련된 작업자는 10개의 세포를 분리하고 격리할 바이러스의 풍부에 따라 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose Standard	Euromedex	Unkown	Standard PCR
AmpliTaq Gold 360 Master Mix	Applied Biosystems	4398876	Standard PCR
CellTram 4r Oil	Eppendorf	5196000030	Control the cells during the microaspiration process
Corning cell culture flasks 150 cm2	Sigma-aldrich	CLS430825	Culture
Corning cell culture flasks 25 cm2	Sigma-aldrich	CLS430639	Culture
Corning cell culture flasks 75 cm2	Sigma-aldrich	CLS430641	Culture
DFC 425C camera	LEICA	Unkown	Observation/Monitoring
Eclipse TE2000-S Inverted Microscope	Nikon	Unkown	Observation/Monitoring
EZ1 advanced XL	Quiagen	9001874	DNA extraction
Glasstic Slide 10 with Counting Grids	Kova International	87144E	Cell count
Mastercycler nexus	Eppendorf	6331000017	Standard PCR
Microcapillary 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	Microaspiration and release of cells
Micromanipulator InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Microcapillary positioning
Nuclease-Free Water	ThermoFischer	AM9920	Standard PCR
Optima XPN Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	A94469	Virus purification
Petri dish 35 mm	Ibidi	81158	Culture/observation
Sterile syringe filters 5 µm	Sigma-aldrich	SLSV025LS	Filtration
SYBR green Type I	Invitrogen	unknown	Fluorescent molecular probes/flow cytometry
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	Standard PCR; DNA gel stain
Tecnai G20	FEI	Unkown	Electron microscopy
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor	BECKMAN COULTER	337922	Virus purification
Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2	BECKMAN COULTER	344058	Virus purification