单细胞微吸气作为荧光激活细胞分类的替代策略，用于巨型病毒混合物分离

摘要

在这里，我们描述了一个单细胞微吸入方法分离受感染的阿米巴。为了分离受福斯托病毒和未知巨病毒感染的Vermamoeba病毒的病毒亚群，我们开发了下面详述的规程，并展示了其分离两种低丰度的新型巨病毒的能力。

摘要

在阿米巴共同培养过程中，多个病毒可能在一个井中分离。我们之前通过应用于病毒群的端点稀释和/或荧光活化细胞分拣 （FACS） 解决了这个问题。然而，当混合物中的病毒具有相似的形态特性，并且其中一种病毒繁殖缓慢时，在基因组组装阶段发现两种病毒的存在，并且病毒无法分离以进一步表征。为了解决这个问题，我们开发了一个单细胞微吸气程序，允许分离和克隆高度相似的病毒。在目前的工作中，我们介绍这种替代策略如何允许我们分离克兰迪索病毒ST1和Usurpati病毒LCD7的小病毒亚群，与溶酶和快速生长相比，这些巨型病毒生长缓慢，不会导致阿米巴溶血症浮病毒通过特定基因扩增来评估纯度控制，并产生病毒以进一步表征。

引言

核细胞质大DNA病毒（NCLDV）是极其多样化的，由四个家族，感染真核^生物1定义。第一个描述的病毒基因组超过300kbp是植物dnavire，包括紫杉醇小球状病毒1 PBCV1^2。咪咪病毒的分离和首次描述表明，病毒的大小在颗粒大小（450nm）和基因组长度（1.2Mb）3方面都增加了一倍。自那时以来，许多巨大的病毒被描述，通常使用阿米巴共培养程序分离。几个具有不同形态和遗传内容的巨型病毒可以从阿坎塔莫巴病毒细胞中分离出来，包括马赛病毒、潘多拉病毒、皮托病毒、莫利病毒、塞德拉病毒、帕克曼病毒、图潘病毒，以及最近美杜莎病毒^{4，5，6，7，8，9，10，11，1213，14，15，16，17}。同时，对Vermamoeba病毒的分离使得对巨病毒福斯托病毒、考莫埃巴病毒和奥菲奥病毒18、19、20的分离和描述得以进行。其他巨型病毒被分离为他们的宿主原虫，如卡福龙根^西21，奥雷球菌阿诺费伦^斯22，克雷索穆利^纳23和博多盐 ²⁴.所有这些隔离都是由于越来越多的团队致力于隔离，并引入了高吞吐量策略更新 25、26、27、28，例如利用流式细胞测定，改进共培养系统。

2016年，我们采用一种将共培养和流细胞学相结合的策略来分离巨型^病毒27。制定这一策略是为了增加接种的样本数量，使用作细胞支持的培养者多样化，并快速检测细胞支持的莱沙。该系统通过添加补充步骤来更新，以避免初步的分子生物学鉴定和快速检测未知的病毒群，如Pacman^病毒29。耦合流细胞测定细胞分类允许分离咪咪病毒和塞德拉病毒A11³⁰的混合物。然而，我们后来遇到了通过流式细胞测定分离和检测这些病毒亚群的局限性。测序后，当我们组装Fausto病毒ST1²⁵和Fausto病毒LCD7（未公布的数据）的基因组时，我们惊奇地发现，每个集合中有两个补充基因组，两个新病毒的基因组在公共基因组数据库中未识别。然而，无论是流动细胞学还是传输电子显微镜（TEM）都显示阿米巴感染了两种不同的病毒，即克兰迪索病毒ST1和佩兰皮塔蒂病毒LCD7。我们设计了特定的PCR系统，分别根据其基因组扩增浮法托病毒、汉迪斯坦病毒和克兰迪索病毒标记;我们的目的是建立基于PCR的系统，能够验证被分离的病毒的纯度。然而，端点稀释和流式细胞测量未能将它们分开。分离这一单一病毒种群是困难的，因为无论是克兰斯蒂诺病毒和汉里帕蒂病毒种群的形态或复制元素都没有特征。由于两个种群的重叠（在有效分离后测试），我们只通过流式细胞测定检测出一个病毒群。我们试图用96孔板的单粒子分拣来分离它们，但我们没有观察到任何细胞病的影响，我们也没有通过PCR扩增来检测克兰斯蒂诺病毒和汉皮拉蒂病毒。最后，只有端点稀释和单阿米巴微吸气的组合，才使得这两种低丰度的巨型病毒从浮力病毒中分离出来。这种分离方法是本文的对象。

研究方案

1. 阿米巴文化

1. 使用Vermamoeba 纤维化（应变 CDC19）作为细胞支持。
2. 在75cm²细胞培养瓶中，在浓度为1 x 10⁶细胞/mL的阿米巴中加入30 mL蛋白酶-肽-酵母提取物-葡萄糖培养基（PYG）和3mL的阿米巴。
3. 将培养保持在28°C。
4. 48小时后，使用计数幻灯片对阿米巴进行量化。
5. 要冲洗，以1 x10⁶细胞/mL的浓度收获细胞，在720 x g下离心10分钟，将阿米巴颗粒化10分钟。 去除上清液，在适当的饥饿培养液中重新悬浮颗粒，以获得1 x 10⁶细胞/mL （表 1）。

2. 库存病毒在阿米巴的传播

注:在稀释之前，重要的是培养库存样品，以获得足够的新鲜培养，然后继续过滤。

1. 在饥饿培养基中使用阿米巴培养的1 x 10^6。
2. 接种从库存溶液（浮华病毒/汉皮塔蒂病毒LCD7或福斯托病毒/克兰迪索病毒ST1）发出的病毒混合物后，在细胞支持的共同培养过程在倍数感染（MOI）0.01。
   注:MOI对于减少主要病毒种群的丰度和受感染的细胞数量非常重要。
3. 在30°C孵育，直到细胞病效（CPE）被诱导，如阿米巴四舍或溶化，大约10至14小时后感染。
4. 收集介质并通过 5 μm 过滤器进行过滤，以清除细胞碎屑。

3. 端点稀释

1. 在饥饿培养基中对病毒样本进行连续稀释（10^-1至10-11）。
2. 接种 2 mL 1 x 10⁶ Vermamoeba vermaeba vermeba vermea纤维化包含在每个培养皿中，含有 100 μL 的混合物接种。
3. 将培养皿置于 30°C 的可密封塑料袋中。
4. 在感染后6小时用倒置光学显微镜观察培养皿，每4至8小时检查细胞形态。
5. 在以四舍五入细胞为特征的细胞病变效应的出现时，开始单细胞微吸气过程。

4. 单细胞微吸

1. 准备主机。
   注:此制剂用于将受感染的单细胞释放到新的细胞支持。
   1. 使用含有10微克/mL的万古霉素、10微克/mL的伊美宁、20微克/mL的环丙沙星、20微克/mL的多氧环素和20微克/mL的沃利孔素，在培养基中治疗阿米巴。这种混合物用于避免细菌和真菌污染。
      注:手术在微生物安全站外的长凳上进行。将2 mL的阿米巴浓缩在1 x 10⁶细胞/mL每个到15个培养皿。对于阿米巴依从性，在 30°C 孵育培养 30 分钟。
2. 根据以下标准，从极限稀释中选择用于微吸气的培养皿:1） 没有任何真菌和细菌制剂的可见污染，2） 证明阿米巴因病毒而具有细胞病菌效应，以及 3） 预溶和阿米巴的四舍五入阶段（以避免病毒颗粒的吸入）。
3. 使用以下材料设置工作站（参见图 1A，B）:
   微操作器，允许微毛细管定位;
   手动控制压力装置，用于吸入并释放细胞到微毛细管;
   倒置显微镜;
   即插即用电机模块;
   相机;
   计算机模块，用于可视化操作和拍照。
4. 选择微毛细管（参见图1C）。
   注:细胞的大小、膜对表面的变形和粘附性以及细胞运动性会影响微吸气的平滑进度。微毛细管直径可以精确选择，并适应特定的细胞类型，这取决于其大小和吸气方法。内径为20微米的微毛细管用于吸出圆环状阿米巴（直径±10μm）。这允许维护内部位置和轻松释放单元。
5. 安装系统。
   1. 将抓取系统的操作角度固定在电动模块上，温度为 45°。
   2. 执行双重安装，首先在夹持系统上，然后在微毛细管上。
   3. 在微毛细管中流下几滴油后，专注于细胞。
      注:具有生物相容性矿物油由设备提供。
   4. 按照制造商的建议完成安装。
6. 克隆细胞（参见图2A，B）。
   注:此过程类似于弗吕利希和柯尼^格31所述。
   1. 将含有2 mL感染阿米巴的培养皿置于显微镜下。
   2. 首先关注细胞，然后关注浸入培养的微毛细管。
   3. 选择一个圆的单个细胞，使微毛细管更接近微操作器。
   4. 在细胞上进行手动压力控制，将其吸入微毛细管内，实现软吸气。从第一个样本中取出单个细胞，并在细胞支架中释放，然后在 30°C 孵育。
   5. 用倒置光学显微镜进行日常观察，观察细胞的外观，并监测细胞病变效应的出现。

5. PCR筛查

注:在步骤 4 之后，PCR 的系统筛选对于确认分离至关重要。在Usurpati病毒/浮法托病毒和克兰斯蒂诺病毒/浮法托病毒中，使用引体-BLAST^在线32（表2）完成了特定引录和探测系统的设计和应用。

1. 根据制造商的协议，使用自动提取系统从部分阳性培养样本中提取DNA（即观察到细胞病变效应的地方）。
2. 使用设计适当的引体。
   注:在这里，我们设计了引源来放大核心基因，这些基因被作为RpB2（浮病毒）、LCD7主要辣椒蛋白（Usurpat病毒）和微小辣椒蛋白（克兰迪索病毒）来扩充
3. 使用热循环器执行标准 PCR。
   1. 使用每个引水50μM（表2）、1x主混合物和无RNase水进行20μLPCR反应。
   2. 在95°C下激活Taq DNA聚合酶5分钟，随后在95°C下进行45次10秒变性，在58°C下退火30秒，在72°C下延长30秒。
4. 在1.5%的胶凝糖凝胶上运行PCR产品，用DNA凝胶染色（材料表）染色，并用紫外线可视化。

6. 病毒生产和纯化

1. 把剩下的培养皿放回小瓶中。
2. 对于病毒的生产，准备15个145^厘米2的烧瓶，含有40mL的Vermamoeba在饥饿介质和5 mL的分离病毒已经从培养皿转移到小烧瓶。
3. 使用步骤 4.1 中使用的相同抗生素和抗真菌混合物进行治疗。
4. 在30°C孵育。每天用倒置光学显微镜观察。
5. 完全感染后，将所有烧瓶池。使用 0.45 μm 过滤器消除碎屑。
6. 在 50，000 x g下超离所有超生物 45 分钟。
7. 离心后，通过吸入从每个管中取出上清液，并将颗粒重新悬浮在1 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
8. 用25%蔗糖（27.5克蔗糖在100 mL的PBS中，通过过滤消毒）来纯化病毒。
9. 离心8 mL的蔗糖和2 mL的病毒悬浮液在80，000 x g下30分钟。将其储存在-80°C。

7. 负染色和透射电子显微镜

注:布哈利勒等人^此前27日公布了这一议定书。

1. 将莱沙上清液的5 μL沉积到发光释放的网格上。在室温下离开约20分钟。
   注:发光放电使我们能够通过等离子体应用获得亲水网格。
2. 小心干燥电网，在网格上沉积1%的少量铵，等待10秒，让电网干燥5分钟。
3. 继续以200 keV进行电子显微镜观察。

8. 克兰斯蒂诺病毒ST1和汉地帕蒂病毒LCD7的特性

1. 使用基因组测序、基因组组装、生物信息学分析以及研究其复制周期来描述克兰斯提诺病毒ST1和Usurpati病毒LCD7的纯种群，正如我们对其他病毒^{所做的10、20 29}.

结果

单细胞微吸气是本手稿中优化的微操作过程（图1）。这种技术能够捕获一个圆的，受感染的阿米巴（图2A），并在含有未感染阿米巴（图2）的新型板中释放它。它是一个适用于共培养系统的功能原型，并成功地分离了非溶性巨病毒。这种方法首次在巨病毒领域被应用，并使得分离出两种新的低丰度巨病毒成为可能。?...

讨论

单细胞微吸气处理的持续时间及其良好功能取决于操作员。实验的不同步骤要求精度。工作站的微操作组件的使用必须通过观察微吸气过程和细胞释放来持续控制。通过微观观察进行随访对于捕获和转移细胞是必要的。有经验的操作员可能需要 1 到 2 小时来分离 10 个细胞，并根据要分离的病毒的丰度逐一重新传输它们。操作的数量可能有所不同。我们建议从 10 个操作开始。根据定义，我们不知?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose Standard	Euromedex	Unkown	Standard PCR
AmpliTaq Gold 360 Master Mix	Applied Biosystems	4398876	Standard PCR
CellTram 4r Oil	Eppendorf	5196000030	Control the cells during the microaspiration process
Corning cell culture flasks 150 cm2	Sigma-aldrich	CLS430825	Culture
Corning cell culture flasks 25 cm2	Sigma-aldrich	CLS430639	Culture
Corning cell culture flasks 75 cm2	Sigma-aldrich	CLS430641	Culture
DFC 425C camera	LEICA	Unkown	Observation/Monitoring
Eclipse TE2000-S Inverted Microscope	Nikon	Unkown	Observation/Monitoring
EZ1 advanced XL	Quiagen	9001874	DNA extraction
Glasstic Slide 10 with Counting Grids	Kova International	87144E	Cell count
Mastercycler nexus	Eppendorf	6331000017	Standard PCR
Microcapillary 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	Microaspiration and release of cells
Micromanipulator InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Microcapillary positioning
Nuclease-Free Water	ThermoFischer	AM9920	Standard PCR
Optima XPN Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	A94469	Virus purification
Petri dish 35 mm	Ibidi	81158	Culture/observation
Sterile syringe filters 5 µm	Sigma-aldrich	SLSV025LS	Filtration
SYBR green Type I	Invitrogen	unknown	Fluorescent molecular probes/flow cytometry
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	Standard PCR; DNA gel stain
Tecnai G20	FEI	Unkown	Electron microscopy
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor	BECKMAN COULTER	337922	Virus purification
Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2	BECKMAN COULTER	344058	Virus purification