إنشاء وتوصيف الأمعاء العصبية الصغيرة ورم الغدد الصماء خزان

Summary

أورام الغدد الصماء العصبية (الناموسيات) تنشا من خلايا الغدد الصماء العصبية. فهي بطيئه النمو وتحديا للثقافة. نحن نقدم استراتيجية بديله لزراعه الشباك من الأمعاء الصغيرة عن طريق الخياطة لهم كما خزان. هذه الخزان لديها علامات الأمعاء الصغيرة NET ويمكن استخدامها لاختبار المخدرات.

Abstract

أورام الغدد الصماء العصبية الصغيرة (SBNETsات) هي سرطانات نادره منشؤها خلايا enterochromaffinه من الأمعاء. وقد كان البحث في هذا المجال محدودا لأنه تم إنشاء عدد قليل جدا من خطوط الخلايا SBNET المستمدة من المريض. خلايا SBNET المتمايزة بشكل جيد بطيئه النمو ويصعب نشرها. والخطوط الخلوية القليلة التي أنشئت ليست متاحه بسهوله ، وبعد وقت في الثقافة قد لا تستمر في التعبير عن خصائص الخلايا NET. توليد خطوط الخلايا الجديدة قد يستغرق سنوات عديده منذ الخلايا SBNET لديها وقت مضاعفه طويلة وهناك حاجه إلى العديد من الخطوات الإثراء من أجل القضاء علي الأورام الليفية المرتبطة بالسرطان بسرعة الانقسام. للتغلب علي هذه القيود ، قمنا بتطوير بروتوكول للثقافة SBNET الخلايا من الأورام المزالة جراحيا كما خزان في مصفوفة خارج الخلية (ECM). يشكل ECM مصفوفة ثلاثية الابعاد تغلف خلايا SBNET وتحاكي البيئة الصغرى للورم للسماح لخلايا SBNET بالنمو. هنا ، ونحن ميزت معدل النمو من SBNET خزان ووصفت طرق لتحديد علامات SBNET باستخدام المجهر المناعي ومناعي للتاكد من ان الخزان هي خلايا الورم الغدد الصماء العصبية. الاضافه إلى ذلك ، استخدمنا SBNET خزان لاختبار السمية الخلوية من rapamycin.

Introduction

الأورام العصبية المعوية الصغيرة (سبنتس) تنشا من خلايا enterochromaffinه من الأمعاء الصغيرة. علي الرغم من انه من المعروف عموما SBNETs تنمو ببطء, انها تنتشر عاده إلى الكبد¹. في حين يمكن النظر في أزاله الجراحية أو استئصال الورم في كثير من الحالات ، وتكرار يكاد يكون عالميا ، التالي ، العلاج الطبي يلعب دورا هاما في الاداره. وقد استثمرت جهود هائله لتوليد خطوط خلوية جديده SBNET لاختبار المخدرات. ومع ذلك ، لم يكن هناك نجاح يذكر. فقط 6 خطوط الخلايا sbnet (krj-I, CND2, GOT1, ف-sts, L-sts, H-sts) وقد تم الإبلاغ عن^2,3,4,5; وللاسف خط خليه واحده لم يعد يعبر عن علامات NET⁶ وثلاثه أخرى خطوط الخلية sbnet (krj-I ، L-Sts ، H-sts) كانت مصممه علي ان تستمد من الليمفاوية تحولت بدلا من الشباك⁷. وللتعجيل بتحديد الادويه اللازمة لاستهداف الشبكات الكهربائية الخاصة ، هناك حاجه إلى أساليب بديله لاختبار المخدرات في المختبر.

هنا ، ونحن نستفيد من توافر SBNETsات وانشات وسيله للثقافة هذه SBNETs المستمدة من المريض كما خزان النمو في ECM. الهدف العام لهذه المخطوطة هو وصف طريقه للثقافة SBNET كثقافة ثلاثية الابعاد (3D) والخطوط العريضة الإجراءات لتوصيف هذه الخزان للاحتفاظ بعلامات SBNET عن طريق تلطيخ المناعي والمناعي.

الاضافه إلى ذلك ، فاننا نظهر كيف يمكن استخدام هذه SBNET خزان لاختبار تاثير rapamycin ، وهو دواء مضاد للسرطان لشبكات⁸. الأساس المنطقي وراء هذا البروتوكول هو تطوير طريقه جديده لزراعه خلايا SBNET في المختبر واستخدامها لاختبار المخدرات. الميزة من هذا تقنيه علي الطريقة تقليديه من يؤسس [سبنت] خليه خط ان ثقافات [3 د] من [سبنتس] يستطيع بسرعة كنت نلت واختبار المخدر يستطيع كنت أنجزت ضمن 3 أسابيع. ويمكن استخدام SBNET خزان كنموذج لأداء في شاشات المخدرات في المختبر لتحديد الادويه الجديدة للمرضي SBNET. منذ خطوط الخلايا SBNET ليست متاحه علي نطاق واسع ، والثقافات 3D من خزان SBNET يمكن ان تكون بمثابه نموذج جديد في المختبر لدراسة Sbnetات ويمكن تقاسمها بين العلماء في هذا المجال.

Protocol

وقد تمت الموافقة علي جميع التجارب باستخدام عينات الورم العصبي الغدد الصماء البشرية من قبل جامعه أيوا مستشفي وعيادات اللجنة الهجرة والامومه (البروتوكول رقم 199911057). وترد قائمه بجميع المواد والمعدات في جدول المواد. وترد في الجدول 1قائمه بوسائط النمو والحلول الرئيسية.

1. أورام الأمعاء العصبية الصغيرة (SBNET) جمع وتفكك الخلية

1. الحصول علي عينات SBNET المريض المقسمة بعد تاكيد انسجه الأورام من النواة الجراحية الامراض.
2. قطع SBNETs إلى مكعبات 5 ملم وتخزينها في 25 مل من DMEM/F12 المتوسطة في أنبوب مخروطي للنقل إلى المختبر.
3. نقل الأورام في DMEM التي تحتوي علي 1 ٪ ، 1 ٪ البنسلين/ستربتومايسين (القلم/بكتيريا) ، 1 ٪ الجلوتامين (غسل المتوسطة) واحتضان في هذا المتوسط يغسل لمده 15 دقيقه.
4. نقل الأورام إلى طبق جديد والأورام المفروم إلى اقل من 1 ملم القطع باستخدام مقص المنحنية العقيمة.
5. نقل الانسجه المفروم إلى أنبوب 50 mL جديده تحتوي علي 25 مل من غسل المتوسطة.
6. الطرد المركزي العينة في 500 x g لمده 15 دقيقه في 4 ° c.
7. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق الكريات في 10 مل من غسل المتوسطة التي تحتوي علي كولاجيناز (100 U/ml) و dnase (0.1 mg/ml).
8. السماح بهضم الأورام المفرومة تحدث في حاضنه 37 درجه مئوية مع اهتزاز بطيء (50 دوره في الدقيقة) ل 1.5 h.

2. ثقافة من [سبنتس] بما ان ورم خزان في [ECM]

1. بعد اكتمال عمليه الهضم (الخطوة 1.8) ، جهاز الطرد المركزي في 500 x g لمده 15 دقيقه في 4 °c ، وتجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 15 مل من غسل المتوسطة.
2. وضع مصفاه الخلية 70 μm علي راس أنبوب 50 mL جديده ونقل 10 مل من متوسط غسل فوق مصفاه الخلية. دوامه غسل المتوسطة لتغطيه الجانب من أنبوب من البلاستيك لمنع الخلايا NET من التصاق إلى جانب أنبوب من البلاستيك.
3. تصفيه تعليق الخلية من خلال مصفاه الخلية.
4. جهاز الطرد المركزي في 500 x g لمده 15 دقيقه في 4 °c ، وتجاهل supernatant ، وأعاده تعليق بيليه في 200 Μl من غسل المتوسطة (حجم الكلي هو ~ 250 μl) ووضعه علي الجليد.
5. نقل 5 μL من الخلايا إلى 500 μL من غسل المتوسطة (1/100 عامل التخفيف). استخدم الخلايا المخففة لعد الخلايا باستخدام مقياس الكريات الدموية للحصول علي عدد الخلايا في المليلتر. اضرب ب100 لتصحيح عامل التخفيف.
6. ضرب عدد الخلايا لكل مل الحصول عليها في الخطوة 2.5 بالحجم الإجمالي للخلايا في تعليق الحصول عليها في الخطوة 2.4 (~ 250 μL).
7. جهاز الطرد المركزي في 500 x g لمده 15 دقيقه في 4 °c ، وتجاهل supernatant ، وأعاده تعليق الخلايا في ECM السائل (1 × 10⁶ خلايا/مل) والحفاظ علي الجليد.
8. نقل 5-20 μL من SBNET خزان في ECM إلى لوحه 96 البئر والسماح لل ECM السائل ليصلب عن طريق وضع لوحه في الحاضنة 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
9. أضافه 200 μL من المتوسطة الثقافة SBNET (DMEM/F12 + 10 ٪ + 1 ٪ القلم/بكتيريا + 1 ٪ الجلوتامين + 10 ملم نيكوتيناميد + 10 ميكروغرام/مل الانسولين) إلى كل بئر من لوحه 96-حسنا التي تحتوي علي خزان SBNET في ECM.
10. بدلا من ذلك ، الثقافة SBNET العضوية في وسائل الاعلام الخلايا الجذعية مماثله لما سبق وصفه لزراعه الكبد البشري أو البنكرياس العضوي⁹ والمدرجة في جدول المواد.
11. تغيير الوسائط كل 5-7 يوما.

3. القياس الكمي لحجم كروي SBNET باستخدام ImageJ

1. التقاط 5-10 الصور من SBNET خزان في اليوم 1 ، 4 ، 7 ، 14 ، 23 و 97 من الثقافة باستخدام هدف 10x.
2. افتح الصور المحفوظة في ImageJ. انتقل إلى علامة التبويب تحليل ، حدد الخيار تعيين القياسات ووضع الاختيار علي منطقه الخيار.
3. استخدم أداه التحديد البيضاوية من شريط الاداات لإنشاء مجسم اهليلجي أو دائره حول كروي مركزه بشكل جيد.
4. انتقل إلى علامة التبويب تحليل وحدد الخيار قياس . كرر الخطوات 3.4 و 3.5 من أجل الحصول علي قياس مساحة من 25-50 SBNET خزان. يتم توفير القيم في مربع بكسل.
5. تحويل منطقه بكسل إلى μm² عن طريق تقسيم حجم كل بكسل مع طول كل بكسل لعامل التحويل ميكرومتر من الصور المجهري.
   ملاحظه: خلايا SBNET تنمو أساسا كما خزان وأحيانا الاهليلجي.

4-توصيف الخزان المناعية لل SBNETS

1. نقل العضو العضوي المزروع في ECM إلى أنبوب 1.5 مل باستخدام ماصه P1000.
2. الطرد المركزي في 1,500 x g لمده دقيقه واحده وأزاله supernatant.
3. غسل الثقافة العضوية عن طريق أضافه 1 مل من تلفزيوني ، مزيج ، الطرد المركزي في 1,500 x g لمده 1 دقيقه وأزاله supernatant.
4. إصلاح الهيكل التنظيمي عن طريق أضافه 500 μL من 4 ٪ بارافورمالدهيد واحتضان لمده 15 دقيقه.
5. غسل الثقافة مرتين مع 1 مل من تلفزيوني.
6. يتخلل الثقافة عن طريق أضافه 500 μL من تلفزيوني + 3 ٪ بوسنيا + 0.1 ٪ تريتون X 100 لمده 5 دقائق.
7. ثم يغسل لمده ثلاث مرات مع 1 مل من تلفزيوني + 3 ٪ جيش الصرب البوسنيين.
8. احتضان لمده 1 ساعة مع الأجسام المضادة الاوليه ضد سينابتوفيسين (SYP)¹⁰ في 1/600 التخفيف أو كروموغرانين A (cga)¹¹ ومستقبلات سوماتوستاتين 2 (SSTR2)¹² في 1/400 التخفيف في العازلة المضادة (2.5 ٪ الزلال المصل البقري ، 0.1 ٪ الصوديوم أزيد ، 25 ملم تريس pH 7.4 ، 150 mM كلوريد الصوديوم).
   ملاحظه: استخدام 300 μL أو أكثر من حل الأجسام المضادة لكل أنبوب.
9. يغسل ثلاث مرات مع 1 مل من تلفزيوني + 3 ٪ جيش الصرب البوسنيين.
10. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية إلى FITC في التخفيف 1/500 في العازلة المضادة ل 1 ح. استخدام 300 μL أو أكثر من حل الأجسام المضادة لكل أنبوب.
11. يغسل 3 مرات مع 1 مل من تلفزيوني + 3 ٪ بوسني. تاكد من ان يستنشق والتخلص من كل supernatant.
12. أضافه 5 μL من المتوسطة المتصاعدة التي تحتوي علي DAPI وصمه عار النووية.
13. استخدام ماصه P20 لنقل 5 μL من خزان SBNET من الخطوة 4.12 إلى شريحة زجاجيه وختم مع زلة الغطاء.
14. التقاط الصور باستخدام المجهر الفلورسنت باستخدام 10x ، 20x أو 40x الأهداف.

5-التوصيف الخزان لشركه SBNET بواسطة مناعي (IHC)

1. نقل SBNET خزان من لوحه الثقافة إلى أنبوب 1.5 mL باستخدام ماصه P1000.
2. الطرد المركزي في 1,500 x g لمده دقيقه واحده وأزاله supernatant.
3. إصلاح sbnet خزان عن طريق أضافه 500 μl من 10 ٪ الفورمالين إلى أنبوب من الخطوة 5.2 واحتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 2-5 أيام قبل تضمين البارافين وقطع 4 ميكرون سميكه كروي المقاطع.
4. المغادرين ، وأعاده هيدرات ، واستخدام استرداد الحرارة المستحثة في محلول Antigen استرداد في pH 9 عن طريق التسخين إلى 97 درجه مئوية لمده 20 دقيقه باستخدام 3 في 1 محطه معالجه الشرائح الألى لاعداد الشرائح لاحتضان الأجسام المضادة.
5. كتله الشرائح واحتضان مع الأجسام المضادة الاوليه ضد¹⁰ ليرة سوريه في تخفيف 1/100 لمده 15 دقيقه ، cga¹¹ في 1/800 التخفيف لمده 15 دقيقه ، SSTR2¹² في 1/5000 التخفيف لمده 30 دقيقه.
6. احتضان مع نظام الكشف عن الأجسام المضادة الثانوية لمده 15 دقيقه لتلطيخ لل ليرة سوريه و CgA و 30 دقيقه لتلطيخ المضادة لSSTR2. التقاط الصور باستخدام هدف 400x.

6. علاج العضو العضوي sbnet مع راباميسين

1. ذوب راتاميسين في DMSO للحصول علي حل الأسهم 10 ملم.
2. اعداد sbnet الثقافة المتوسطة مع dmso (علي سبيل المثال ، 1 مل من sbnet الثقافة المتوسطة + 1 μl من dmso) و sbnet الثقافة المتوسطة مع 10 ميكرومتر من راباميسين (علي سبيل المثال ، 1 مل من sbnet الثقافة المتوسطة + 1 μl من 10 مم راباميسين الأسهم الحل).
3. نقل 200 μl الوسائط مع وسط الثقافة sbnet مع dmso أو 10 μM راباميسين إلى الثقافات كروي sbnet.
4. احتضان SBNET خزان لمده 5 أيام في 37 درجه مئوية حاضنه.
5. أضف 1 μM من ايثيديوم هوديومير وحضن لمده 30 دقيقه. أزاله المتوسطة التي تحتوي علي التماثل المتماثل ، وغسل مع 200 μL من تلفزيوني ، ونقل 200 μL من الخدمات التلفزيونية لكل بئر.
6. التقاط الصور المجهرية من SBNET خزان مع وبدون علاج المخدرات باستخدام مكعب فلتر احمر مع 10x ، 20x ، أو 40x الأهداف من المجهر الفلورسنت.
   ملاحظه: تظهر الخلايا الميتة الملطخة بالحمص الأحمر الملون بالحمراء باستخدام المكعب المرشح الأحمر G من المجهر المتاح تجاريا (جدول المواد). بدلا من ذلك ، يمكن التقاط اشاره باستخدام مقياس طيفي في 535 nm الاثاره و 624 nm الانبعاثات.

7. تقسيم SBNET خزان

ملاحظه: يتم ذلك للتوسع والمشاركة مع الباحثين الآخرين.

1. استخدام ماصه P1000 لكسر ميكانيكيا ECM ويستنشق ECM مع SBNET خزان أنبوب معقم 1.5 mL.
2. الطرد المركزي في 1,000 x g في 4 درجه مئوية ، وأزاله كل ماده طافي ووضع أنبوب علي الجليد.
3. أضافه 2-4x حجم ECM جديده لبيليه. خلط ECM الجديد مع ECM القديمة و SBNET خزان عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا 10x. تجنب إدخال فقاعات الهواء.
4. نقل 5-20 μL لمزيج ECM و SBNET خزان إلى لوحه جديده والسماح ECM لترسيخ.
5. تغطيه مع المتوسطة SBNET الجديدة ونقل إلى الحاضنة. ويبلغ معدل الاسترداد حوالي 95 إلى 100 في المائة.
6. للشحن خزان SBNET إلى مختبر آخر ، نقل SBNET خزان مع ECM جديده إلى قارورة T25 والسماح ECM لترسيخ.
7. ملء قارورة T25 مع SBNET كروي المتوسطة ، والمسمار علي الغطاء باحكام ، واعداد حزمه الشحن.
8. عند تلقي الثقافة كروي SBNET ، أزاله المتوسطة الثقافة وتنفيذ الخطوة 7.1 إلى 7.5 لوضع SBNET خزان مره أخرى في الثقافة.

8. مخزن واستعاده خزان SBNET

1. نقل SBNET خزان من 5-10 الآبار الصغيرة إلى أنبوب 15 مل. أجهزه الطرد المركزي في 500 x g لمده 15 دقيقه في 4 °c ، أزاله supernatant ، أعاده التعليق في تجميد المتوسطة (90 ٪ + 10 ٪ dmso) ، تخزين في حاويه تجميد الخلية ، ووضع هذا في-80 درجه مئوية.
2. نقل إلى النيتروجين السائل لتخزين أطول.
3. لاستعاده خزان SBNET ، ضع القارورة المجمدة علي الثلج وانتظر حتى يذوب المحتوي تماما. عكس الأنبوب وأعاده وضعه علي الجليد من أجل تسريع عمليه الذوبان.
4. مره واحده يتم أذابه العينة ، وضعت داخل الطرد المركزي قبل المبردة وتدور في 1,000 x g لمده 10 دقيقه.
5. أزاله ماده طافي وأعاده تعليق خزان في ECM. الحفاظ علي أنبوب علي الجليد ، ونقل 20 μL إلى لوحه جديده ، والانتظار لل ECM لترسيخ.
6. نقل 200 μL من وسط الثقافة SBNET مع 10 μM من المثبط روك (27632)¹³ ونقل إلى الحاضنة.
7. السماح لخزان SBNET بالانتعاش والنمو لمده أسبوع واحد. أزاله المتوسطة الثقافة القديمة ، وتجديد مع 200 μL من المتوسطة الثقافة SBNET والعودة إلى الحاضنة.
8. السماح لخزان SBNET بالاستمرار في النمو.
   ملاحظه: يستغرق الأمر أسبوعا واحدا علي الأقل لخزان المتزايدة بسرعة للبدء في التعافي بعد التجميد¹³. SBNET خزان تاخذ الحد الأدنى من 2-4 أسابيع للبدء في النمو. سوف يموت العديد من الخلايا SBNET خلال الأسابيع الاولي 2 ومعدل البقاء علي قيد الحياة اقل من 10 ٪. لان هذا هو عمليه تستغرق وقتا طويلا جدا ومنخفضه الغلة ، فمن الأفضل لتبادل مع الباحثين الآخرين SBNET خزان في قوارير الثقافة (كما هو موضح في الخطوة 7). يجب استخدام مخزن والاسترداد فقط كخطه احتياطيه في حاله حدوث تلوث بكتيري.

النتائج

هناك حاليا فقط 2 خطوط الخلية sbnet التي أنشئت ونشرت^2,3,4,5 وانها ليست متاحه بسهوله لكثير من الباحثين. هنا, نقترح علي الثقافة SBNET كما خزان في ECM واستخدام هذا كنموذج بديل لدراسة الحساسية SBNET المخدرات. تم جمع الورم المشتق من المري?...

Discussion

أصبحت الثقافات الورم 3D موردا قيما لاختبار المخدرات قبل السريرية¹⁵. وقد أنشئت في الاونه الاخيره الأورام العضوية المختلفة بيوانكات من سرطان الثدي وأورام سرطان البروستاتا^16,17. في هذه الدراسة ، ونحن نقدم بروتوكولا مفصلا للثقافة SBNET كما خزان وطريقه ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-rabbit FITC	Jackson ImmunoResearch	11-095-152	Secondary antibody couple to a green fluorophore
Antigen Retrieval Solution	Agilent Dako	S2367	Solution at pH 9 for preparing slides for IHC
Autostainer Link 48	Agilent Dako	Not Available	Automated system for antibody staining
Cell freezing container	Thermo Scientific	5100-0001	Container to for freezing cells
CellSence	Olympus	Version 1.18	Computer software for using fluorescent microscope
Chromogranin A antibody	Abcam-45179	RB-9003-PO	Antibodies for IF
Chromogranin A antibody (clone LK2H10)	Thermo Scientific	MA5-13096	Antibodies for IHC
Collagenase	Sigma	C0130	Enzyme for digesting tumor tissue
DMEM	Gibco	11965-092	Medium for tissue preparation
DMEM/F12	Gibco	11320-033	Medium for organoid cultures
DMSO	Sigma	D8418	Solvent for dissolving drug
DNAse	Sigma	DN25	Enzyme for digesting tumor tissue
Ethidium Homodimer	Chemodex	CDX-E0012-T1E	DNA and RNA binding dye
FBS	Gibco	16000044	Reagent for culture media
Fluorescent microscope	Olympus	CKX35	Microscope for taking pictures of SBENT spheroids
Glutamine	Gibco	A2916801	Reagent for culture media
ImageJ	National Institutes of Health	Version 1.51	Computer software for image analysis
Insulin	Sigma	I0516	Reagent for culture media
Matrigel	Corning	356235	Matrix to embed and anchore organoids
Mounting medium (VECTASHIELD)	Vector Laboratories	H-1200	Fixative for labelled-cells with a nuclear stain
Nicotinamide	Sigma	72340	Reagent for culture media
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Reagent to fix cells
PEN/STREP	Gibco	15140-122	Reagent for culture media
PT Link	Agilent Dako	Not Available	Automated system to prepare slides for IHC staining
Rapamycin	Alfa Aesar	J62473	Drug that can inhibit NET growth
Secondary antibodies for IHC	Agilent Dako	K8000	Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system
SSTR2 antibody	GeneScritp	A01591	Antibodies for IF
SSTR2 antibody (clone UMB1)	Abcam	ab134152	Antibodies for IHC
Synaptophysin antibody	Abcam	32127	Antibodies for IF
Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP)	Agilent Dako	M7315	Antibodies for IHC
TritonX	Mallinckrodt	3555 KBGE	Reagent to permeablize cells
Y-2763 ROCK inhibitor	Adipogen	AG-CR1-3564-M005	To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw