Établissement et caractérisation des sphéroïdes neuroendocrines de la petite intestin

Résumé

Les tumeurs neuroendocrines (NET) proviennent des cellules neuroendocrines de la crête neurale. Ils sont à croissance lente et difficiles à la culture. Nous présentons une stratégie alternative pour cultiver des NETs des petites entrailles en les cultivant en tant que sphéroïdes. Ces sphéroïdes ont de petits marqueurs NET intestin et peuvent être utilisés pour le dépistage des drogues.

Résumé

Les tumeurs neuroendocrines de petite entrailles (SBNETs) sont des cancers rares provenant des cellules d'entéroochromaffin de l'intestin. La recherche dans ce domaine a été limitée parce que très peu de lignées cellulaires SBNET dérivées de patients ont été générées. Les cellules SBNET bien différenciées se développent lentement et sont difficiles à propager. Les quelques lignées cellulaires qui ont été établies ne sont pas facilement disponibles, et après le temps dans la culture peut ne pas continuer à exprimer des caractéristiques des cellules NET. La génération de nouvelles lignées cellulaires pourrait prendre de nombreuses années puisque les cellules SBNET ont un long temps de doublement et de nombreuses étapes d'enrichissement sont nécessaires afin d'éliminer les fibroblastes rapidement associés au cancer. Pour surmonter ces limitations, nous avons développé un protocole à la culture des cellules de SBNET des tumeurs chirurgicalement enlevées comme sphéroïdes dans la matrice extracellulaire (ECM). L'ECM forme une matrice tridimensionnelle qui encapsule les cellules SBNET et imite le micro-environnement tumoral pour permettre aux cellules SBNET de se développer. Ici, nous avons caractérisé le taux de croissance des sphéroïdes de SBNET et décrit des méthodes pour identifier des marqueurs de SBNET utilisant la microscopie et l'immunohistochimie d'immunofluorescence pour confirmer que les sphéroïdes sont des cellules neuroendocrines de tumeur. En outre, nous avons utilisé des sphéroïdes SBNET pour tester la cytotoxicité de la rapamycine.

Introduction

Les petites tumeurs neuroendocrines d'entrailles (SBNETs) proviennent des cellules d'entérosochromaffin du petit intestin. Bien que les SBNETs soient généralement connus pour se développer lentement, ils métastasent généralement au foie¹. Tandis que le déplacement chirurgical ou l'ablation de tumeur peut être considéré dans beaucoup de cas, la répétition est presque universelle, et, par conséquent, la thérapie médicale joue un rôle important dans la gestion. D'énormes efforts ont été investis pour générer de nouvelles lignées cellulaires SBNET pour le dépistage des drogues. Cependant, il y a eu très peu de succès. Seules 6 lignées cellulaires SBNET (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) ont été signalées^2,3,4,5; et malheureusement, une lignée cellulaire n'exprime plus de marqueurs NET⁶ et trois autres lignées cellulaires SBNET (KRJ-I, L-STS, H-STS) ont été déterminées à provenir de lymphoblastes transformés au lieu de NETs⁷. Afin d'accélérer l'identification des médicaments pour cibler les SBNET, d'autres méthodes de dépistage in vitro des drogues sont nécessaires.

Ici, nous profitons de la disponibilité des SBNETs réséqués et avons établi un moyen de cultiver ces SBNETs dérivés du patient comme des sphéroïdes de plus en plus en ECM. L'objectif global de ce manuscrit est de décrire une méthode de culture SBNET comme une culture tridimensionnelle (3D) et des procédures de contour pour caractériser ces sphéroïdes pour la rétention des marqueurs SBNET par la coloration immunofluorescence et l'immunohistochimie.

En outre, nous démontrons comment ces sphéroïdes SBNET peuvent être utilisés pour tester l'effet de la rapamycine, un médicament anticancéreux pour les^NET8. La raison d'être de ce protocole est de développer une nouvelle méthode pour cultiver les cellules SBNET in vitro et de les utiliser pour le dépistage des drogues. L'avantage de cette technique par rapport à la méthode traditionnelle d'établissement d'une lignée cellulaire SBNET est que les cultures 3D des SBNETs peuvent être rapidement obtenues et que des tests de dépistage de drogues peuvent être effectués dans les 3 semaines. Les sphéroïdes SBNET pourraient potentiellement être utilisés comme modèle pour effectuer des écrans de médicaments in vitro afin d'identifier de nouveaux médicaments pour les patients atteints de SBNET. Étant donné que les lignées cellulaires SBNET ne sont pas largement disponibles, les cultures 3D des sphéroïdes SBNET peuvent servir de nouveau modèle in vitro pour l'étude des SBNETs et peuvent être partagées entre les scientifiques dans le domaine.

Protocole

Toutes les expériences utilisant des échantillons neuroendocrines humains de tumeur ont été approuvées par le comité d'hôpital et de cliniques d'université de l'Iowa (numéro de protocole 199911057). Une liste de tous les matériaux et équipements est décrite dans le Tableau des matériaux. Une liste des médias de croissance et des solutions clés se trouve dans le tableau 1.

1. La collecte de la tumeur neuroendocrine des petites entrailles (SBNET) et la dissociation cellulaire

1. Obtenir des échantillons sOFET de patient réséqués après confirmation de tissus de tumeur du noyau chirurgical de pathologie.
2. Couper les SBNET en cubes de 5 mm et les conserver dans 25 ml de milieu DMEM/F12 dans un tube conique pour le transport jusqu'au laboratoire.
3. Transférer les tumeurs dans DMEM contenant 1% FBS, 1% pénicilline/streptomycine (Pen/Strep), 1% glutamine (Wash Medium) et incuber dans ce moyen de lavage pendant 15 min.
4. Transférer les tumeurs dans un nouveau plat et hacher les tumeurs à moins de 1 mm à l'aide de ciseaux incurvés stériles.
5. Transférer les tissus hachés dans un nouveau tube de 50 ml contenant 25 ml de lave-vaisselle.
6. Centrifuger l'échantillon à 500 x g pendant 15 min à 4 oC.
7. Jeter le supernatant et resuspendre les granulés dans 10 ml de lave-vaisselle contenant de la collagène (100 U/mL) et du DNase (0,1 mg/ml).
8. Permettre à la digestion des tumeurs hachées de se produire dans un incubateur de 37 oC avec des secousses lentes (50 tr/min) pendant 1,5 h.

2. Culture des SBNETs comme sphéroïdes de tumeur dans L'ECM

1. Une fois la digestion terminée (étape 1,8), centrifugeuse à 500 x g pendant 15 min à 4 oC, jetez le supernatant et suspendez la pastille dans 15 ml de lavave moyenne.
2. Placer une passoire cellulaire de 70 m sur un nouveau tube de 50 ml et transférer 10 ml du milieu de lavage au-dessus de la passoire cellulaire. Faites tourbillonner le moyen de lavage pour couvrir le côté du tube en plastique pour empêcher les cellules NET de coller sur le côté du tube en plastique.
3. Filtrer la suspension cellulaire par la passoire cellulaire.
4. Centrifugeuse à 500 x g pendant 15 min à 4 oC, jetez le supernatant, suspendez la pastille dans 200 l de Lave-Feu (volume total est de 250 l) et placez-la sur la glace.
5. Transférer 5 l l de cellules à 500 oL de facteur de lavage moyen (1/100 facteur de dilution). Utilisez les cellules diluées pour le comptage cellulaire à l'aide d'un hémocytomètre pour obtenir le nombre de cellules par millilitre. Multipliez par 100 pour corriger le facteur de dilution.
6. Multipliez le nombre de cellules par mL obtenue à l'étape 2.5 par le volume total de cellules en suspension obtenue à l'étape 2.4 (250 l).
7. Centrifugeuse à 500 x g pendant 15 min à 4 oC, jetez le supernatant et suspendez les cellules en ECM liquide (1 x 10⁶ cellules/mL) et conservez-les sur la glace.
8. Transférer 5 à 20 l de sphéroïdes SBNET dans l'ECM dans une plaque de 96 puits et permettre à l'ECM liquide de se solidifier en plaçant la plaque dans un incubateur de 37 oC pendant 5 min.
9. Ajouter 200 l de milieu de culture SBNET (DMEM/F12 - 10% FBS - 1% PEN/STREP - 1% glutamine - 10 mM de nicotinamide et 10 'g/mL d'insuline) à chaque puits de la plaque de 96 puits contenant les sphéroïdes SBNET en ECM.
10. Alternativement, la culture sBNET organoïdes dans les médias de cellules souches semblables à ce qui a été précédemment décrit pour la croissance du foie humain ou des organoïdes pancréatiques⁹ et énumérés dans le tableau des matériaux.
11. Changez de média tous les 5-7 jours.

3. Quantification de la taille sphéroïde SBNET à l'aide d'ImageJ

1. Prenez 5-10 photos de sphéroïdes SBNET au jour 1, 4, 7, 14, 23 et 97 de la culture en utilisant un objectif 10x.
2. Ouvrez les images enregistrées dans ImageJ. Passez à l'onglet Analyse, sélectionnez l'option Mesures de définir et vérifiez l'option Zone.
3. Utilisez l'outil de sélection ovale de la barre d'outils pour générer un ellipsoïde ou un cercle autour d'un sphéroïde bien ciblé.
4. Passez à l'onglet Analyse et sélectionnez l'option Mesure. Répétez les étapes 3.4 et 3.5 afin d'obtenir la mesure de zone de 25-50 sphéroïdes SBNET. Les valeurs sont fournies en pixel carré.
5. Convertissez la zone de pixels en 'm² en divisant la taille de chaque pixel avec la longueur de chaque pixel en facteur de conversion 'm des images de microscopie.
   REMARQUE : Les cellules SBNET se développent principalement sous forme de sphéroïdes et parfois d'ellipsoïdes.

4. Caractérisation des sphéroïdes SBNETS par immunofluorescence

1. Transférer les organoïdes cultivés en ECM dans un tube de 1,5 ml à l'aide d'une pipette P1000.
2. Centrifugeuse à 1 500 x g pendant 1 min et retirer le supernatant.
3. Laver la culture organoïde en ajoutant 1 ml de PBS, mélanger, centrifugeuse à 1500 x g pendant 1 min et retirer le supernatant.
4. Fixer les organoïdes en ajoutant 500 L de 4% de paraformaldéhyde et incuber pendant 15 min.
5. Laver la culture deux fois avec 1 ml de PBS.
6. Perméabilisez la culture en ajoutant 500 L de PBS - 3% BSA - 0,1% Triton X 100 pour 5 min.
7. Ensuite, laver trois fois avec 1 ml de PBS - 3% BSA.
8. Incuber pendant 1 h avec des anticorps primaires contre la synaptophyse (SYP)¹⁰ à 1/600 dilution ou chromogranine A (CgA)¹¹ et le récepteur de la somatostatine 2 (SSTR2)¹² à 1/400 dilution dans la mémoire tampon d'anticorps (2,5% d'albumine de sérum bovin, 0,1% de sodium azide, 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM de chlorure de sodium).
   REMARQUE : Utilisez 300 L ou plus de solution d'anticorps par tube.
9. Laver trois fois avec 1 ml de PBS et 3% de BSA.
10. Incuber avec des anticorps secondaires couplés à FITC à 1/500 dilution dans le tampon d'anticorps pendant 1 h. Utilisez 300 L ou plus de solution d'anticorps par tube.
11. Laver 3 fois avec 1 ml de PBS et 3% de BSA. Assurez-vous d'aspirer et de jeter tous les supernatants.
12. Ajouter 5 ll de support de montage contenant la tache nucléaire DAPI.
13. Utilisez une pipette P20 pour transférer 5 l des sphéroïdes SBNET de l'étape 4.12 à une lame de verre et sceller avec un bordereau de couverture.
14. Prenez des images à l'aide d'un microscope fluorescent à l'aide des objectifs 10x, 20x ou 40x.

5. SBNET sphéroïdes caractérisation par immunohistochimie (IHC)

1. Transférer les sphéroïdes SBNET de la plaque de culture à un tube de 1,5 ml à l'aide d'une pipette P1000.
2. Centrifugeuse à 1 500 x g pendant 1 min et retirer le supernatant.
3. Fixez les sphéroïdes SBNET en ajoutant 500 l de formaline de 10 % au tube à partir de l'étape 5.2 et incubez à température ambiante pendant 2-5 jours avant l'embedding de paraffine et coupez les sections sphéroïdes de 4 m d'épaisseur.
4. Déparaffiniser, réhydrater et utiliser la récupération d'épitope induite par la chaleur dans la solution de récupération d'antigène au pH 9 en chauffant à 97 oC pendant 20 min à l'aide de la station automatisée de traitement des diapositives 3-en-1 pour préparer des diapositives pour l'incubation des anticorps.
5. Bloquer les diapositives et incuber avec des anticorps primaires contre SYP¹⁰ à une dilution 1/100 pendant 15 min, CgA¹¹ à une dilution 1/800 pendant 15 min, et SSTR2¹² à une dilution de 1/5 000 pour 30 min.
6. Incuber avec le système secondaire de détection d'anticorps pendant 15 min pour la coloration anti-SYP et CgA et 30 min pour la coloration anti-SSTR2. Prenez des photos à l'aide d'un objectif 400x.

6. Traitement des organoïdes SBNET avec de la rapamycine

1. Dissoudre la rapamycine dans DMSO pour obtenir une solution de stock de 10 mM.
2. Préparer le milieu de culture SBNET avec DMSO (p. ex., 1 mL de milieu de culture SBNET et 1 euro de DMSO) et le milieu de culture SBNET avec 10 M de rapamycine (p. ex., 1 mL de milieu de culture SBNET - 1 l de 10 mM de solution de rapamycine).
3. Transférer 200 médias L avec le milieu de culture SBNET avec DMSO ou 10 M rapamycine aux cultures sphéroïdes SBNET.
4. Incuber les sphéroïdes SBNET pendant 5 jours dans un incubateur de 37 oC.
5. Ajouter 1 m d'éthidium homodimère et incuber pendant 30 min. Retirez le milieu contenant de l'homodimère d'éthidium, lavez-le avec 200 L de PBS et transférez 200 L de PBS à chaque puits.
6. Prenez des images de microscopie de sphéroïdes SBNET avec et sans traitement médicamenteux à l'aide du cube de filtre rouge avec les objectifs 10x, 20x ou 40x d'un microscope fluorescent.
   REMARQUE : Les cellules mortes tachées d'ethidium homodimer apparaissent en rouge à l'aide du cube de filtre rouge G d'un microscope disponible dans le commerce (Tableau des matériaux). Alternativement, le signal peut être capturé à l'aide d'un spectrophotomètre à 535 nm d'excitation et 624 nm d'émission.

7. Fractionnement des sphéroïdes SBNET

REMARQUE : Ceci est fait pour l'expansion et pour le partage avec d'autres chercheurs.

1. Utilisez une pipette P1000 pour briser mécaniquement l'ECM et aspirer l'ECM avec des sphéroïdes SBNET à un tube stérile de 1,5 ml.
2. Centrifugeuse à 1 000 x g à 4 oC, retirez tout le supernatant et placez le tube sur la glace.
3. Ajouter 2-4x le volume de nouveau ECM à la pastille. Mélangez le nouvel ECM avec les anciens sphéroïdes ECM et SBNET en faisant monter et descendre 10 fois. Éviter d'introduire des bulles d'air.
4. Transférer 5 à 20 L du mélange de sphéroïdes ECM et SBNET dans une nouvelle assiette et permettre à l'ECM de se solidifier.
5. Couvrir avec le nouveau support SBNET et le transférer à l'incubateur. Le taux de récupération est d'environ 95 à 100%.
6. Pour l'expédition des sphéroïdes SBNET dans un autre laboratoire, transférez les sphéroïdes SBNET avec un nouveau ECM dans un flacon T25 et permettez à ECM de se solidifier.
7. Remplissez le flacon T25 avec le milieu sphéroïde SBNET, vissez fermement le bouchon et préparez le paquet d'expédition.
8. En recevant une culture sphéroïde SBNET, retirez le milieu de culture et effectuez l'étape 7.1 à 7.5 pour remettre les sphéroïdes SBNET dans la culture.

8. Cryostorage et récupération des sphéroïdes SBNET

1. Transférer les sphéroïdes SBNET de 5 à 10 petits puits à un tube de 15 ml. Centrifugeuse à 500 x g pendant 15 min à 4 oC, retirer le supernatant, le suspendre dans un milieu de congélation (90 % FBS et 10 % DMSO), le conserver dans un contenant de congélation cellulaire et le placer à -80 oC.
2. Transférer dans l'azote liquide pour un stockage plus long.
3. Pour récupérer les sphéroïdes SBNET, placez le flacon congelé sur la glace et attendez que le contenu soit complètement décongelé. Inverser le tube et le re-placer sur la glace afin d'accélérer le processus de décongélation.
4. Une fois l'échantillon décongelé, placé à l'intérieur d'une centrifugeuse préréfrigérée et tourner à 1 000 x g pendant 10 min.
5. Retirez le supernatant et suspendez les sphéroïdes dans ECM. Gardez le tube sur la glace, transférez 20 l dans une nouvelle plaque et attendez que l'ECM se solidifie.
6. Transférer 200 l de milieu de culture SBNET avec 10 M d'inhibiteur ROCK (Y-27632)¹³ et transférer à l'incubateur.
7. Permettre aux sphéroïdes SBNET de récupérer et de croître pendant 1 semaine. Retirez l'ancien milieu de culture, réapprovisionnez-vous avec 200 l de milieu de culture SBNET et retournez à l'incubateur.
8. Permettre aux sphéroïdes SBNET de continuer à croître.
   REMARQUE: Il faut au moins 1 semaine pour les sphéroïdes à croissance rapide pour commencer à récupérer après cryoconservation¹³. Les sphéroïdes SBNET prennent au moins 2-4 semaines pour commencer à croître. De nombreuses cellules SBNET mourront dans les 2 premières semaines et le taux de survie est inférieur à 10%. Comme il s'agit d'un processus très long et à faible rendement, il est préférable de partager avec d'autres chercheurs SBNET sphéroïdes dans les flacons de culture (comme décrit à l'étape 7). Le cryostockage et la récupération ne doivent être utilisés qu'en tant que plan de sauvegarde en cas de contamination bactérienne.

Résultats

Il n'y a actuellement que 2 lignées cellulaires SBNET établies et publiées^2,3,4,5 et elles ne sont pas facilement disponibles pour de nombreux chercheurs. Ici, nous proposons à la culture SBNET comme sphéroïdes dans eCM et l'utiliser comme un modèle alternatif pour étudier la sensibilité des médicaments SBNET. La tumeur patient-dérivée d'un SBNET qui a métastasé au foie a été ra...

Discussion

Les cultures 3D tumorales sont devenues une ressource précieuse pour les tests précliniques¹⁵. Diverses biobanques organoïdes tumorales ont récemment été établies à partir du cancer du sein et des tumeurs du cancer de la prostate^16,17. Dans cette étude, nous fournissons un protocole détaillé à la culture SBNET comme sphéroïdes et une méthode simple et rapide pour valider les cultures sphéroïdes pour les marqueurs NET par i...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-rabbit FITC	Jackson ImmunoResearch	11-095-152	Secondary antibody couple to a green fluorophore
Antigen Retrieval Solution	Agilent Dako	S2367	Solution at pH 9 for preparing slides for IHC
Autostainer Link 48	Agilent Dako	Not Available	Automated system for antibody staining
Cell freezing container	Thermo Scientific	5100-0001	Container to for freezing cells
CellSence	Olympus	Version 1.18	Computer software for using fluorescent microscope
Chromogranin A antibody	Abcam-45179	RB-9003-PO	Antibodies for IF
Chromogranin A antibody (clone LK2H10)	Thermo Scientific	MA5-13096	Antibodies for IHC
Collagenase	Sigma	C0130	Enzyme for digesting tumor tissue
DMEM	Gibco	11965-092	Medium for tissue preparation
DMEM/F12	Gibco	11320-033	Medium for organoid cultures
DMSO	Sigma	D8418	Solvent for dissolving drug
DNAse	Sigma	DN25	Enzyme for digesting tumor tissue
Ethidium Homodimer	Chemodex	CDX-E0012-T1E	DNA and RNA binding dye
FBS	Gibco	16000044	Reagent for culture media
Fluorescent microscope	Olympus	CKX35	Microscope for taking pictures of SBENT spheroids
Glutamine	Gibco	A2916801	Reagent for culture media
ImageJ	National Institutes of Health	Version 1.51	Computer software for image analysis
Insulin	Sigma	I0516	Reagent for culture media
Matrigel	Corning	356235	Matrix to embed and anchore organoids
Mounting medium (VECTASHIELD)	Vector Laboratories	H-1200	Fixative for labelled-cells with a nuclear stain
Nicotinamide	Sigma	72340	Reagent for culture media
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Reagent to fix cells
PEN/STREP	Gibco	15140-122	Reagent for culture media
PT Link	Agilent Dako	Not Available	Automated system to prepare slides for IHC staining
Rapamycin	Alfa Aesar	J62473	Drug that can inhibit NET growth
Secondary antibodies for IHC	Agilent Dako	K8000	Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system
SSTR2 antibody	GeneScritp	A01591	Antibodies for IF
SSTR2 antibody (clone UMB1)	Abcam	ab134152	Antibodies for IHC
Synaptophysin antibody	Abcam	32127	Antibodies for IF
Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP)	Agilent Dako	M7315	Antibodies for IHC
TritonX	Mallinckrodt	3555 KBGE	Reagent to permeablize cells
Y-2763 ROCK inhibitor	Adipogen	AG-CR1-3564-M005	To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw