작은 창자 신경 내분비 종양 스페로이드의 설치 그리고 특성화

요약

신경 내분비 종양 (NETs) 신경 문장의 신경 내분비 세포에서 유래. 그들은 천천히 성장하고 문화에 도전. 우리는 스페로이드로 그들을 배양하여 작은 창자에서 NET를 성장하는 대체 전략을 제시한다. 이 스페로이드는 작은 창자 그물 마커가 있고 약 시험을 위해 이용될 수 있습니다.

초록

작은 창자 신경 내분비 종양 (SBNETs)는 창자의 enterochromaffin 세포에서 유래하는 희소한 암입니다. 이 분야의 연구는 SBNET 세포주에서 유래된 환자가 거의 없기 때문에 제한적이었다. 잘 분화된 SBNET 셀은 천천히 성장하고 전파하기 어렵습니다. 확립된 몇몇 세포주는 쉽게 유효하지 않으며, 배양에 있는 시간 후에 NET 세포의 특성을 발현하는 것을 계속하지 않을 수 있습니다. SBNET 세포는 긴 두 배의 시간을 가지고 있기 때문에 새로운 세포주를 생성하는 것은 많은 년이 걸릴 수 있고 급속하게 분할하는 암 관련 섬유아세포를 제거하기 위하여 많은 농축 단계가 필요합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 세포 외 매트릭스 (ECM)에서 스페로이드로 외과적으로 제거 된 종양으로부터 SBNET 세포를 배양하는 프로토콜을 개발했습니다. ECM은 SBNET 세포를 캡슐화하고 SBNET 세포가 성장할 수 있도록 종양 미세 환경을 모방하는 3차원 매트릭스를 형성합니다. 여기서, 우리는 SBNET 스페로이드의 성장 속도를 특징으로 하고, spheroids가 신경 내분비 종양 세포임을 확인하기 위해 면역형광 현미경 및 면역조직화학을 사용하여 SBNET 마커를 식별하는 방법을 기술하였다. 또한, 우리는 라파마이신의 세포 독성을 테스트하기 위해 SBNET 스페로이드를 사용했습니다.

서문

작은 창자 신경 내분비 종양 (SBNETs)는 소장의 엔테로크로마틴 세포에서 유래합니다. SBNETs는 일반적으로 천천히 성장하는 것으로 알려져 있지만, 그들은 일반적으로 간^1에전이. 외과 제거 또는 종양 절제는 많은 경우에 고려될 수 있는 동안, 재발은 거의 보편적이고, 그러므로, 의학 치료는 관리에 있는 중요한 역할을 합니다. 약물 검사를 위한 새로운 SBNET 세포주를 생성하기 위해 엄청난 노력을 기울였습니다. 그러나, 거의 성공이 있었다. 만 6 SBNET 세포주 (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS)^{2,3,4,5보고되었습니다;} 불행하게도 하나의 세포주들은 더 이상 NET 마커^6및 3개의 다른 SBNET 세포주(KRJ-I, L-STS, H-STS)를 발현하지 않고 NETs⁷대신형 림프체로부터 유래되는 것으로 결정되었다. SBNET를 표적으로 하는 약물의 식별을 가속화하기 위해서는 시험관 내 약물 검사를 위한 대체 방법이 필요합니다.

여기에서, 우리는 절제된 SBNETs의 가용성을 이용하고 ECM에서 성장하는 스페로이드로 이 환자 파생 SBNETs를 배양하는 쪽을 설치했습니다. 이 원고의 전반적인 목표는 면역형광 염색 및 면역조직화학에 의한 SBNET 마커의 보존을 위해 이러한 스페로이드를 특성화하는 3차원(3D) 배양 및 개요 절차로서 SBNET 배양 방법을 설명하는 것이다.

또한, 우리는 이러한 SBNET 스페로이드가 NETS^8의항암 약물인 라파마이신의 효과를 테스트하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 이 프로토콜의 근거는 시험관에서 SBNET 세포를 성장하고 약물 검사에 사용하는 새로운 방법을 개발하는 것입니다. SBNET 세포주를 확립하는 전통적인 방법에 비해 이 기술의 장점은 SBNE의 3D 배양이 빠르게 얻을 수 있고 약물 검사가 3 주 이내에 수행 될 수 있다는 것입니다. SBNET 스페로이드는 잠재적으로 SBNET 환자를 위한 새로운 약을 확인하기 위하여 시험관 내 약 스크린을 능력을 발휘하기 위한 모형으로 이용될 수 있었습니다. SBNET 세포주들은 널리 사용할 수 없기 때문에, SBNET 스페로이드의 3D 배양은 SBNE를 연구하기 위한 새로운 시험관 내 모델로 사용될 수 있으며, 현장의 과학자들 사이에서 공유될 수 있다.

프로토콜

인간 신경 내분비 종양 견본을 사용하여 모든 실험은 아이오와 대학 병원 및 진료소 IRB 위원회에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 번호 199911057). 모든 재료 및 장비 의 목록은 재료 표에설명되어 있습니다. 성장 미디어 및 주요 솔루션 목록은 표 1에서찾을 수 있습니다.

1. 작은 창자 신경 내분비 종양 (SBNET) 수집 및 세포 해리

1. 외과 병리학 코어에서 종양 조직 확인 후 절제된 환자 SBNET 샘플을 얻습니다.
2. SBNE를 5mm 큐브로 자르고 실험실로 운반하기 위해 원유관에 DMEM/F12 배지 25mL에 보관합니다.
3. 1% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신(펜/스트렙), 1% 글루타민(워시 매질)을 함유한 DMEM에서 종양을 옮기고 이 세척 매체에서 15분 동안 배양한다.
4. 새로운 접시에 종양을 옮기고 종양을 멸균 된 곡선 가위를 사용하여 1mm 미만으로 다림작합니다.
5. 다진 조직을 워시 매질의 25 mL를 포함하는 새로운 50 mL 튜브로 옮김.
6. 4°C에서 15분 동안 500 x g에서 샘플을 원심분리한다.
7. 상급제를 버리고 콜라게나아제(100 U/mL)와 DNase(0.1 mg/mL)를 함유한 워시 매미 10 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
8. 다진 종양의 소화가 1.5 시간 동안 느린 흔들림 (50 rpm)으로 37 °C 인큐베이터에서 발생하도록 허용하십시오.

2. ECM에 있는 종양 스페로이드로 SBNETs의 문화

1. 소화가 완료된 후(단계 1.8), 4°C에서 15분 동안 500 x g에서 원심분리기를 폐기하고, 세척 매체의 15 mL에서 펠릿을 다시 중단한다.
2. 새로운 50 mL 튜브 위에 70 μm 세포 스트레이너를 놓고 셀 스트레이너 위에 세척 매체의 10 mL를 옮니다. 세척 매체를 소용돌이로 플라스틱 튜브의 측면을 덮어 NET 셀이 플라스틱 튜브의 측면에 달라붙지 않도록 합니다.
3. 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 필터링합니다.
4. 500 x g에서 4 °C에서 15 분 동안 원심 분리기를 폐기하고 상온제를 버리고 200 μL의 세척 매체 (총 부피 ~ 250 μL)로 펠렛을 다시 일시 중단하고 얼음위에 놓습니다.
5. 셀의 5 μL을 세척 매체 (1/100 희석 인자)의 500 μL로 옮니다. 혈세포계를 사용하여 세포 계수를 계산하기 위해 희석 된 세포를 사용하여 밀리리터 당 세포 수를 얻습니다. 희석 계수를 보정하려면 100을 곱합니다.
6. 2.5단계에서 수득된 mL당 셀수를 2.4단계(~250 μL)에서 수득된 현탁액의 세포의 총 부피에 곱한다.
7. 4 °C에서 15 분 동안 500 x g의 원심 분리기를 폐기하고 액체 ECM (1 x 10⁶ 세포 / mL)에서 세포를 다시 일시 중단하고 얼음을 유지하십시오.
8. ECM에서 SBNET 스페로이드의 5-20 μL을 96웰 플레이트로 옮기고 37°C 인큐베이터에 플레이트를 5분 동안 배치하여 액체 ECM이 고화되도록 합니다.
9. 200 μL의 SBNET 배양 배지(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% 글루타민 + 10 mM 니코틴아미드 + 10 μg/mL 인슐린)를 ECM에서 SBNET 스페로이드를 함유하는 96웰 플레이트의 각 우물에 추가합니다.
10. 대안적으로, 줄기세포 배지에서 의 배양 SBNET 오르가노이드는 이전에 인간 간 또는 췌장 오르가노이드^9의 성장을 위해 기술된 것과 유사하고 물질의 표에열거되었다.
11. 5-7일마다 미디어를 변경합니다.

3. ImageJ를 사용하여 SBNET 스페로이드 크기의 정량화

1. 10배 의 목표를 사용하여 배양물의 1일, 4일, 7일, 14일, 23일 및 97일에 SBNET 스페로이드 5-10장의 사진을 찍습니다.
2. ImageJ에서 저장된 이미지를 엽니다. 분석 탭으로 이동하여 측정 설정 옵션을 선택하고 영역 옵션을 확인합니다.
3. 도구 모음에서 타원형 선택 도구를 사용하여 잘 초점을 맞춘 스페로이드 주위에 타원이나 원을 생성합니다.
4. 분석 탭으로 이동하여 측정 옵션을 선택합니다. 25-50 SBNET 스페로이드에서 영역 측정을 얻으려면 3.4 단계와 3.5 단계를 반복합니다. 값은 픽셀 정사각형으로 제공됩니다.
5. 픽셀 영역을 각 픽셀의 크기와 각 픽셀의 길이를 현미경 이미지의 μm 변환 계수로 나누어 픽셀 영역을 μm^2로 변환합니다.
   참고 : SBNET 세포는 주로 구형으로 성장하고 언젠가는 타원으로 성장합니다.

4. 면역 형광에 의한 SBNETS 스페로이드의 특성화

1. P1000 파이펫을 사용하여 ECM에서 자란 오르가노이드를 1.5 mL 튜브로 옮김.
2. 1,500 x g에서 1 분 동안 원심 분리기를 제거하고 상류를 제거하십시오.
3. 1 mL의 PBS를 추가하여 오르가노이드 배양을 씻고, 혼합하고, 원심분리기를 1분 동안 1,500 x g에 첨가하고 상급체를 제거한다.
4. 4% 파라포름알데히드 500 μL을 첨가하여 오르가노이드를 고치고 15분 동안 배양합니다.
5. PBS 의 1 mL로 배양을 두 번 씻으하십시오.
6. 500 μL의 PBS + 3% BSA + 0.1% 트리톤 X 100을 5분 동안 첨가하여 배양을 퍼메라빌화한다.
7. 그런 다음 PBS 1 mL + 3% BSA로 세 번 씻으십시오.
8. 시냅토피신(SYP)에 대하여 10에 대하여 1 시간 동안 배양 (SYP)^10에서 1/600 희석 또는 염색체 A (CgA)^및 소마토스타틴 수용체 2 (SSTR2)^12에서 1/400 항체 완충액에 희석 (2.5% 소 혈청 알부민, 0.1% 나트륨 azide, 25 mM 트리스 pH 7.4, 150 mM 염화 나트륨).
   참고: 튜브당 300 μL 이상의 항체 용액을 사용하십시오.
9. PBS 1 mL + 3% BSA로 세 번 씻으십시오.
10. 1 시간 동안 항체 완충액에서 FITC에 결합 된 이차 항체와 배양. 튜브 당 300 μL 이상의 항체 용액을 사용하십시오.
11. PBS 1 mL + 3% BSA로 3회 세척하십시오. 모든 상급을 흡인하고 폐기하십시오.
12. 핵 얼룩 DAPI를 포함하는 마운팅 매질 의 5 μL을 추가합니다.
13. P20 파이펫을 사용하여 4.12단계에서 SBNET 스페로이드 5 μL을 유리 슬라이드로 옮기고 커버 슬립으로 밀봉하십시오.
14. 10x, 20x 또는 40x 목표를 사용하여 형광 현미경을 사용하여 이미지를 찍습니다.

5. SBNET 면역 화학에 의한 SBNET 스페로이드 특성 분석 (IHC)

1. P1000 파이펫을 사용하여 배양 플레이트에서 1.5 mL 튜브로 SBNET 스페로이드를 이송합니다.
2. 1,500 x g에서 1 분 동안 원심 분리기를 제거하고 상류를 제거하십시오.
3. SBNET 스페로이드는 5.2단계에서 튜브에 10% 포르말린의 500 μL을 첨가하고 파라핀을 포함하기 전에 2-5일 동안 실온에서 배양하고 4 μm 두께의 스페로이드 섹션을 절단하여 수정합니다.
4. 3-in-1 자동 슬라이드 처리 스테이션을 사용하여 20분 동안 97°C로 가열하여 pH 9에서 항원 회수 용액에서 열 유도 에피토프 회수를 탈파화, 재수화 및 사용하여 항체 배양용 슬라이드를 준비한다.
5. 1/100 희석에서 SYP^10에 대한 1차 항체를 1/100 분 동안, CgA^11은 15 분 동안 1/800 희석에서, SSTR2^12는 1/5,000 희석에서 30 분 동안 1/5,000 희석으로 슬라이드를 차단하고 배양합니다.
6. 항-SYP 및 CgA 염색을 위해 15분 동안 이차 항체 검출 시스템과 배양하고, 반대로 SSTR2 염색을 위해 30분. 400x 목표를 사용하여 사진을 찍습니다.

6. 라파마이신으로 SBNET 오르가노이드 치료

1. 10 mM 재고 용액을 얻기 위해 DMSO에서 라파마이신을 용해하십시오.
2. SBNET 배양 배지를 DMSO(예를 들어, SBNET 배양 배지 의 1 mL + 1 μL의 DMSO) 및 10 μM의 라파마이신(예를 들어, 1 mL의 SBNET 배양 배지 + 10 mMM 라파마이신 스톡 액액)으로 SBNET 배양 배지를 준비한다.
3. 200 μL 배지를 DMSO 또는 10 μM 라파마이신을 SBNET 스페로이드 배양물로 전송합니다.
4. 37°C 인큐베이터에서 5일 동안 SBNET 스페로이드를 배양하였다.
5. 에티듐 호모디머 1 μM을 넣고 30 분 동안 배양하십시오. 에티듐 호모디머를 함유 한 배지를 제거하고 200 μL의 PBS로 씻고 각 우물에 200 μL을 옮긴다.
6. 형광 현미경의 10x, 20x 또는 40x 목표와 빨간 필터 큐브를 사용하여 약물 치료 유무에 관계없이 SBNET 스페로이드의 현미경 이미지를 가져 가라.
   참고: 에티듐 호모디머로 염색된 죽은 세포는 시판되는 현미경의 적색 필터 큐브 G를 사용하여 빨간색으로나타난다(재료표). 또는, 535 nm 여기 및 624 nm 방출에서 분광광도계를 사용하여 신호를 캡처할 수 있습니다.

7. 스플리징 SBNET 스페로이드

참고 : 이것은 확장 및 다른 연구자와 공유하기 위한 것입니다.

1. P1000 파이펫을 사용하여 기계적으로 ECM을 부수고 SBNET 스페로이드로 ECM을 멸균 된 1.5 mL 튜브에 흡인하십시오.
2. 4 °C에서 1,000 x g의 원심 분리기를 제거하고 모든 상급체를 제거하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
3. 펠릿에 새 ECM 의 부피를 2-4배 더넣습니다. 새로운 ECM을 기존 ECM 및 SBNET 스페로이드와 혼합하여 10배 위아래로 파이펫팅합니다. 기포를 도입하지 마십시오.
4. ECM 및 SBNET 스페로이드 혼합물의 5-20 μL을 새 플레이트에 옮기고 ECM이 고화되도록 합니다.
5. 새로운 SBNET 매체로 덮고 인큐베이터로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 드시면 됩니다. 복구율은 약 95~100%입니다.
6. SBNET 스페로이드를 다른 실험실로 배송하려면 새로운 ECM이 있는 SBNET 스페로이드를 T25 플라스크로 전송하고 ECM이 굳어지도록 합니다.
7. T25 플라스크에 SBNET 스페로이드 매체를 채우고 캡에 단단히 고정하고 선적 포장물을 준비하십시오.
8. SBNET 스페로이드 배양을 받은 후, 배양 배지를 제거하고 7.1~7.5단계를 수행하여 SBNET 스페로이드를 배양에 다시 넣는다.

8. SBNET 스페로이드의 냉동 저장 및 회수

1. SBNET 스페로이드를 5-10개의 작은 우물에서 15mL 튜브로 옮김. 4 °C에서 15 분 동안 500 x g의 원심 분리기를 제거하고, 상류를 제거하고, 동결 매체 (90 % FBS + 10 % DMSO)에서 다시 중단하고, 세포 동결 용기에 보관하고-80 °C에 놓습니다.
2. 액체 질소로 옮겨 보관이 더 오래 됩니다.
3. SBNET 스페로이드를 회수하려면 얼어붙은 유리병을 얼음 위에 놓고 내용이 완전히 해동될 때까지 기다립니다. 해동 과정을 가속화하기 위해 튜브를 반전시키고 얼음 위에 다시 놓습니다.
4. 시료가 해동되면, 미리 냉각된 원심분리기 안에 넣고 10분 동안 1,000 x g으로 회전시다.
5. 상급체를 제거하고 ECM에서 스페로이드를 다시 일시 중단합니다. 튜브를 얼음 위에 유지하고 20 μL을 새 접시에 옮기고 ECM이 굳어질 때까지 기다립니다.
6. 10 μM의 ROCK 억제제(Y-27632)(Y-27632)를 사용하여 SBNET 배양 배지의 200 μL을 이송하고 인큐베이터로 이송한다.
7. SBNET 스페로이드가 1주일 동안 회복되고 자랄 수 있도록 합니다. 구 배양 배지를 제거하고, SBNET 배양 배지의 200 μL로 보충하고 인큐베이터로 복귀한다.
8. SBNET 스페로이드가 계속 성장할 수 있도록 합니다.
   참고 : 급속하게 성장하는 스페로이드가 냉동 보존¹³후 회복을 시작하는 데 적어도 1 주가 걸립니다. SBNET 스페로이드는 성장을 시작하는 데 최소 2-4주가 소요됩니다. 많은 SBNET 세포는 첫번째 2 주 안에 정지하고 생존율은 10% 미만입니다. 이것은 매우 시간이 많이 소요되고 낮은 수율 과정이기 때문에 배양 플라스크에서 다른 연구자 SBNET 스페로이드를 공유하는 것이 좋습니다 (7 단계에서 설명된 대로). 저온 저장 및 복구는 세균 오염이 발생할 경우 백업 계획으로만 사용해야 합니다.

결과

현재 2개의 SBNET 세포주만 설립되고 출판되어^2,3,4,5가 있으며 많은 연구자들이 쉽게 이용할 수 없습니다. 여기서, 우리는 ECM에서 스페로이드로 배양 SBNET을 제안하고 SBNET 약물 감도를 연구하는 대체 모델로 이것을 사용합니다. 간으로 전이된 SBNET으로부터 환자 유래 종양을 수집, 소화하여 SBNET 세포를 ?...

토론

종양 3D 배양은 전임상 약물 시험^15에대한 귀중한 자원이 되었다. 다양한 종양 오르가노이드 바이오뱅크는 최근 유방암 및 전립선암 종양^16,17에서설립되었다. 본 연구에서, 우리는 SBNET배양에 대한 상세한 프로토콜을 스페로이드로 하고 면역형광 및 시험 약물 감도에 의해 NET 마커에 대한 스페로이드 배양을 검증하는 간단하고 빠른 방?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-rabbit FITC	Jackson ImmunoResearch	11-095-152	Secondary antibody couple to a green fluorophore
Antigen Retrieval Solution	Agilent Dako	S2367	Solution at pH 9 for preparing slides for IHC
Autostainer Link 48	Agilent Dako	Not Available	Automated system for antibody staining
Cell freezing container	Thermo Scientific	5100-0001	Container to for freezing cells
CellSence	Olympus	Version 1.18	Computer software for using fluorescent microscope
Chromogranin A antibody	Abcam-45179	RB-9003-PO	Antibodies for IF
Chromogranin A antibody (clone LK2H10)	Thermo Scientific	MA5-13096	Antibodies for IHC
Collagenase	Sigma	C0130	Enzyme for digesting tumor tissue
DMEM	Gibco	11965-092	Medium for tissue preparation
DMEM/F12	Gibco	11320-033	Medium for organoid cultures
DMSO	Sigma	D8418	Solvent for dissolving drug
DNAse	Sigma	DN25	Enzyme for digesting tumor tissue
Ethidium Homodimer	Chemodex	CDX-E0012-T1E	DNA and RNA binding dye
FBS	Gibco	16000044	Reagent for culture media
Fluorescent microscope	Olympus	CKX35	Microscope for taking pictures of SBENT spheroids
Glutamine	Gibco	A2916801	Reagent for culture media
ImageJ	National Institutes of Health	Version 1.51	Computer software for image analysis
Insulin	Sigma	I0516	Reagent for culture media
Matrigel	Corning	356235	Matrix to embed and anchore organoids
Mounting medium (VECTASHIELD)	Vector Laboratories	H-1200	Fixative for labelled-cells with a nuclear stain
Nicotinamide	Sigma	72340	Reagent for culture media
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Reagent to fix cells
PEN/STREP	Gibco	15140-122	Reagent for culture media
PT Link	Agilent Dako	Not Available	Automated system to prepare slides for IHC staining
Rapamycin	Alfa Aesar	J62473	Drug that can inhibit NET growth
Secondary antibodies for IHC	Agilent Dako	K8000	Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system
SSTR2 antibody	GeneScritp	A01591	Antibodies for IF
SSTR2 antibody (clone UMB1)	Abcam	ab134152	Antibodies for IHC
Synaptophysin antibody	Abcam	32127	Antibodies for IF
Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP)	Agilent Dako	M7315	Antibodies for IHC
TritonX	Mallinckrodt	3555 KBGE	Reagent to permeablize cells
Y-2763 ROCK inhibitor	Adipogen	AG-CR1-3564-M005	To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw