JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Нейроэндокринные опухоли (NET) происходят из нейроэндокринных клеток нервного гребня. Они медленно растут и бросают вызов культуре. Мы представляем альтернативную стратегию для выращивания NETs из тонкой кишки, культивируя их как сфероиды. Эти сфероиды имеют маркеры NET тонкой кишки и могут быть использованы для тестирования на наркотики.

Аннотация

Опухоли тонкой кишки (SBNETs) являются редкими раковыми заболеваниями, происходящими из энтерохромаффиновых клеток кишечника. Исследования в этой области были ограничены, потому что очень мало пациентов, полученных SBNET клеточных линий были созданы. Хорошо дифференцированные клетки SBNET медленно растут и их трудно размножаться. Несколько установленных клеточных линий не всегда доступны, и через некоторое время в культуре может не продолжать выражать характеристики клеток NET. Создание новых клеточных линий может занять много лет, так как клетки SBNET имеют долгое время удвоения и многие шаги по обогащению необходимы для того, чтобы устранить быстрое разделение связанных с раком фибробластов. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали протокол к культуре SBNET клеток из хирургически удаленных опухолей, как сфероиды во внеклеточной матрицы (ECM). ECM образует трехмерную матрицу, которая инкапсулирует клетки SBNET и имитирует микро-среду опухоли, позволяя клеткам SBNET расти. Здесь мы охарактеризовали темпы роста сфероидов SBNET и описали методы выявления маркеров SBNET с помощью иммунофлюоресценциальной микроскопии и иммуногистохимии, чтобы подтвердить, что сфероиды являются нейроэндокринными опухолевыми клетками. Кроме того, мы использовали сфероиды SBNET для тестирования цитотоксичности рапамицина.

Введение

Опухоли тонкой кишки нейроэндокринных (SBNETs) происходят из энтерохромаффина клеток тонкой кишки. Хотя SBNETs, как известно, растут медленно, они обычно метастазируют в печень1. Хотя хирургическое удаление или абляция опухоли может быть рассмотренво во многих случаях, рецидив почти универсальный, и, следовательно, медицинская терапия играет важную роль в управлении. Огромные усилия были вложены для создания новых линий клеток SBNET для тестирования на наркотики. Однако успеха получило очень мало. Только 6 сотовых линий SBNET (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) были зарегистрированы2,3,4,5; и, к сожалению, одна клеточная линия больше не выражает NET маркеры6 и три других SBNET клеточных линий (KRJ-I, L-STS, H-STS) были определены, чтобы быть производным от преобразованных лимфобластов вместо NETs7. Для ускорения выявления лекарств для таргетирования СБНЕТ необходимы альтернативные методы тестирования на наркотики in vitro.

Здесь мы пользуемся наличием резецированных SBNETs и создали способ культуры этих пациентов полученных SBNETs как сфероиды, растущие в ECM. Общая цель этой рукописи заключается в описании метода культуры SBNET как трехмерной (3D) культуры и наброски процедур для характеристики этих сфероидов для удержания маркеров SBNET путем обертывания иммунофлюоресценции и иммуногистохимии.

Кроме того, мы демонстрируем, как эти сфероиды SBNET могут быть использованы для тестирования эффекта рапамицина, противоракового препарата для NETs8. Обоснованием этого протокола является разработка нового метода для выращивания клеток SBNET in vitro и их использования для тестирования на наркотики. Преимущество этого метода по сравнению с традиционным методом создания клеточной линии SBNET заключается в том, что 3D культуры SBNETs могут быть быстро получены и тестирование на наркотики может быть сделано в течение 3 недель. Сфероиды SBNET потенциально могут быть использованы в качестве модели для выполнения экранов в пробирке наркотиков для выявления новых препаратов для пациентов SBNET. Поскольку линии клеток SBNET не являются широко доступными, 3D культуры сфероидов SBNET могут служить новой моделью in vitro для изучения SBNETs и могут быть распространены среди ученых в этой области.

протокол

Все эксперименты с использованием образцов нейроэндокринной опухоли человека были одобрены комитетом больницы и клиник Университета Айовы (Протокол No 199911057). Список всех материалов и оборудования описан в таблице материалов. Список медиа-медиа роста и ключевых решений можно найти в таблице 1.

1. Небольшая нейроэндокривая опухоль кишечника (SBNET) сбор и диссоциация клеток

  1. Получить резектые образцы пациента SBNET после подтверждения опухолевых тканей от хирургической патологии core.
  2. Разрежьте SBNET s на 5 мм кубиками и храните в 25 мл среды DMEM/F12 в конической трубке для транспортировки в лабораторию.
  3. Передача опухолей в DMEM, содержащий 1% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина (Pen/Strep), 1% глутамина (Wash Medium) и инкубировать в этом мочевом среднем в течение 15 мин.
  4. Перенесите опухоли в новое блюдо и фарш опухоли менее 1 мм штук с помощью стерильных изогнутых ножниц.
  5. Перенесите измельченные ткани в новую трубку 50 мл, содержащую 25 мл стиральной среды.
  6. Центрифуги образца на 500 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия.
  7. Откажитесь от супернатанта и отбросите гранулы в 10 мл стиральной среды, содержащей коллагеназу (100 U/mL) и DNase (0,1 мг/мл).
  8. Разрешить пищеварение фарш опухоли происходят в инкубаторе 37 градусов с медленной тряски (50 об/мин) для 1,5 ч.

2. Культура SBNETs как опухолевые сфероиды в ECM

  1. После завершения пищеварения (шаг 1.8), центрифуга при 500 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия, отбросить супернатант и повторно заткнить гранулы в 15 мл Wash Medium.
  2. Поместите 70 мкм ячейки ситечко на вершине новой трубки 50 мл и передачи 10 мл мыть яйцы medium над ячейкой ситечко. Swirl Wash Medium, чтобы покрыть сторону пластиковой трубки, чтобы предотвратить прилипание net клеток к стороне пластиковой трубки.
  3. Фильтр клеточной подвески через клеточный ситечко.
  4. Центрифуга при 500 х г в течение 15 мин при 4 градусах По Цельсию, отбросьте супернатант, отбросьте гранулы в 200 л стиральной среды (общий объем составляет 250 градусов по Цельсию) и поместите его на лед.
  5. Передача 5 злителков на 500 л стиральной среды (коэффициент разбавления 1/100). Используйте разбавленные клетки для подсчета клеток с помощью гемоситометра, чтобы получить количество клеток на миллилитр. Умножьте на 100, чтобы исправить фактор разбавления.
  6. Умножьте количество ячеек на мл, полученных в шаге 2,5, на общий объем клеток в подвеске, полученных в шаге 2.4 (250 л).
  7. Центрифуга при 500 х г в течение 15 мин при 4 градусах По Цельсию, отбросить супернатант, и resuspend клеток в жидком ECM (1 х 106 клеток / мл) и держать на льду.
  8. Перенесите 5-20 л сфероидов SBNET в ECM в 96-хорошую пластину и дайте жидкости ECM затвердеть, поместив пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение 5 мин.
  9. Добавьте 200 кЛ культуры SBNET (DMEM/F12 , 10% FBS , 1% PEN/STREP - 1% глутамина no 10 мМ никотинамида, 10 мкм инсулина) к каждой скважине 96-хорошей пластины, содержащей сфероиды SBNET в ECM.
  10. Кроме того, культура SBNET органоидов в стволовых клеток средств, аналогичныхтому, что ранее было описано для выращивания либо человеческой печени или поджелудочной железы органоидов9 и перечислены в таблице материалов .
  11. Меняйте носители каждые 5-7 дней.

3. Количественная оценка размера сфероидов SBNET с использованием ImageJ

  1. Возьмите 5-10 фотографий сфероидов SBNET на 1, 4, 7, 14, 23 и 97 культуры с использованием 10x цели.
  2. Откройте сохраненные изображения в ImageJ. Перейдите на вкладку «Анализ», выберите опцию Set Measurements и разместите чек на опции Area.
  3. Используйте инструмент овального выбора из панели инструментов для создания эллипсоида или круг вокруг хорошо сфокусированного сфероида.
  4. Перейдите на вкладку «Анализ» и выберите опцию «Мера». Повторите шаги 3.4 и 3.5 для того, чтобы получить измерение области от 25-50 сфероидов SBNET. Значения приведены в квадрате пикселей.
  5. Преобразуйте область пикселей домм 2, разделив размер каждого пикселя с длиной каждого пикселя на коэффициент преобразования микроскопических изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SBNET клетки растут в основном как сфероиды и когда-то, как эллипсоиды.

4. Характеристика сфероидов SBNETS с помощью иммунофлюоресценции

  1. Перенесите органоиды, выращенные в ECM, в трубку 1,5 мл с помощью пипетки P1000.
  2. Центрифуга при 1500 х г в течение 1 мин и удалить супернатант.
  3. Вымойте органоидную культуру, добавив 1 мл PBS, перемешайте, центрифугу при 1500 х г в течение 1 мин и удалите супернатант.
  4. Зафиксировать органоиды, добавив 500 л параформальдегида и инкубировать в течение 15 мин.
  5. Вымойте культуру дважды с 1 мл PBS.
  6. Permeabilize культуры, добавив 500 л PBS 3% BSA 0,1% Тритон X 100 в течение 5 мин.
  7. Затем мыть в течение трех раз с 1 мл PBS и 3% BSA.
  8. Инкубировать на 1 ч с первичными антителами против синаптофизина (SYP)10 при 1/600 разбавления или хромогранина A (CGA)11 и рецепторе соматостатина 2 (SSTR2)12 при 1/400 разбавления в буфере антител (2,5% крупного сыворотки альбумина, 0,1% азид, 25 мм Tris pH 7.4, 150 мМ хлорид натрия).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 300 зл и более раствора антител на трубку.
  9. Вымойте три раза с 1 мл PBS и 3% BSA.
  10. Инкубировать вторичными антителами в сочетании с FITC при 1/500 разбавления в буфере антител в течение 1 ч. Используйте 300 л или более антитела раствора на трубку.
  11. Вымойте 3 раза с 1 мл PBS и 3% BSA. Убедитесь в том, чтобы аспирировать и отказаться от всех супернатант.
  12. Добавьте 5 злмонтажа среды, содержащей ядерное пятно DAPI.
  13. Используйте пипетку P20 для передачи 5 зЛ сфероидов SBNET со ступени 4.12 на стеклянную горку и печать с крышкой скольжения.
  14. Сфотографруй с помощью флуоресцентного микроскопа с помощью 10x, 20x или 40x целей.

5. Характеристика сфероидов SBNET иммуногистохимией (IHC)

  1. Перенесите сфероиды SBNET из культуры в трубку 1,5 мл с помощью пипетки P1000.
  2. Центрифуга при 1500 х г в течение 1 мин и удалить супернатант.
  3. Исправить Сфероиды SBNET, добавив 500 л 10% формалина в трубку от шага 5.2 и инкубировать при комнатной температуре в течение 2-5 дней до встраивания парафина и сократить 4 мкм толщиной сфероидов разделов.
  4. Депарафинизацию, регидратацию и использование теплового эпитопа поиска в Антигена Поиск решение при pH 9 путем нагрева до 97 градусов по Цельсию в течение 20 минут с помощью 3-в-1 автоматизированной станции обработки слайдов для подготовки слайдов для инкубации антител.
  5. Блок слайды и инкубировать с первичными антителами против SYP10 на 1/100 разбавления в течение 15 минут, CgA11 на 1/800 разбавления в течение 15 минут, и SSTR212 на 1/ 5,000 разбавления в течение 30 минут.
  6. Инкубировать с вторичной системой обнаружения антител в течение 15 минут для анти-SYP и CGA окрашивания и 30 минут для анти-SSTR2 окрашивания. Сфотографируйте с помощью 400x цели.

6. Лечение органоидов SBNET с рапамицином

  1. Растворите рапамицин в DMSO, чтобы получить решение запаса 10 мМ.
  2. Подготовьте среду культуры SBNET с DMSO (например, 1 мл культуры SBNET среднего - 1 л DMSO) и среду культуры SBNET с 10 мкм рапамицина (например, 1 мл культуры SBNET среднего - 1 л 10 мМ рапамицина складского раствора).
  3. Передача 200 мультимедиа с культурой SBNET со средой культуры СМСО или 10 мкм рапамицин в сфероидные культуры SBNET.
  4. Инкубировать сфероиды SBNET в течение 5 дней в инкубаторе 37 градусов по Цельсию.
  5. Добавьте 1 мкм имхидия-омодимера и инкубировать в течение 30 мин. Удалите среду, содержащую гомидий, промойте с 200 зл. PbS, и перенесите 200 Л ПБС на каждую скважину.
  6. Возьмите микроскопические изображения сфероидов SBNET с помощью и без медикаментозного лечения с помощью красного куба фильтра с 10x, 20x или 40x целей флуоресцентного микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мертвые клетки, окрашенные в него, появляются красным цветом, используя красный куб фильтра G коммерчески доступного микроскопа(Таблица материалов). Кроме того, сигнал может быть захвачен с помощью спектрофотометра при возбуждении 535 нм и 624 нм эмиссии.

7. Расщепление сфероидов SBNET

ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается для расширения и для обмена с другими исследователями.

  1. Используйте пипетку P1000, чтобы механически сломать ECM и аспирировать ECM с сфероидами SBNET к стерильной трубке 1,5 мл.
  2. Центрифуга при 1000 х г при 4 градусах Цельсия, удалите все супернатанты и поместите трубку на лед.
  3. Добавьте в гранулы 2-4 x объема нового ECM. Смешайте новый ECM со старыми ECM и SBNET сфероидов труба вверх и вниз 10x. Как избежать введения пузырьков воздуха.
  4. Передача 5-20 л смеси сфероидов ECM и SBNET на новую пластину и дайте ECM затвердеть.
  5. Накрыть новым средством SBNET и перевести в инкубатор. Скорость восстановления составляет примерно от 95 до 100%.
  6. Для доставки сфероидов SBNET в другую лабораторию перенесите сфероиды SBNET с новым ECM на колбу T25 и дайте ECM затвердеть.
  7. Заполните флягу T25 сфероидной средой SBNET, плотно завинчите крышку и подготовьте пакет груза.
  8. После получения сфероидной культуры SBNET удалите среду культуры и выполните шаг 7.1 до 7.5, чтобы вернуть сфероиды SBNET в культуру.

8. Криохранилище и восстановление сфероидов SBNET

  1. Перенос сфероидов SBNET из 5-10 небольших скважин в трубку 15 мл. Центрифуга при температуре 500 х г в течение 15 мин при температуре 4 градуса Цельсия, удалите супернатант, отдохните в морозильной среде (90% FBS и 10% DMSO), храните в контейнере для замораживания ячеек и поместите это при -80 градусов по Цельсию.
  2. Передача в жидкий азот для более длительного хранения.
  3. Чтобы восстановить сфероиды SBNET, поместите замороженный флакон на лед и подождите, пока содержимое полностью разморозится. Переворачивайте трубку и повторно поместите на лед, чтобы ускорить процесс оттаивания.
  4. После того, как образец размораживаются, помещается внутри предварительно охлажденной центрифуги и спина на 1000 х г в течение 10 минут.
  5. Удалите супернатант и повторно сфероиды в ECM. Держите трубку на льду, перенесите 20 л на новую пластину и подождите, пока ECM затвердеет.
  6. Передача 200 зл и номинала культуры SBNET с 10 мкм ингибитора ROCK (Y-27632)13 и передача в инкубатор.
  7. Разрешить SBNET сфероидов, чтобы восстановить и расти в течение 1 недели. Удалите старую культурную среду, пополнить с 200 Зл культуры среды SBNET и вернуться в инкубатор.
  8. Разрешить SBNET сфероидов продолжать расти.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это занимает по крайней мере 1 неделю для быстро растущих сфероидов, чтобы начать восстанавливаться после криоконсервации13. SBNET сфероидов занять как минимум 2-4 недель, чтобы начать расти. Многие клетки SBNET умрут в течение первых 2 недель, а выживаемость составляет менее 10%. Так как это очень трудоемкий и низкий процесс выхода, лучше поделиться с другими исследователями SBNET сфероидов в культуре фляги (как описано в шаге 7). Криохранилище и восстановление должны использоваться только в качестве резервного плана в случае бактериального загрязнения происходит.

Результаты

Есть в настоящее время только 2 SBNET клеточных линий, установленных и опубликованных2,3,4,5, и они не легко доступны для многих исследователей. Здесь мы предлагаем культуре SBNET в качестве сфероидов в ECM и использовать его в...

Обсуждение

Опухолевые 3D культуры стали ценным ресурсом для доклинического тестирования нанаркотики 15. Различные опухолевые органоидные биобанки недавно были созданы из рака молочной железы и опухолей рака предстательной железы16,17. В этом исследован?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIH грантов P50 CA174521 (J.R. Хоу и А. М. Bellizzi). P.H. Ear является получателем премии P50 CA174521 по улучшению карьеры.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-rabbit FITCJackson ImmunoResearch11-095-152Secondary antibody couple to a green fluorophore
Antigen Retrieval SolutionAgilent DakoS2367Solution at pH 9 for preparing slides for IHC
Autostainer Link 48Agilent DakoNot AvailableAutomated system for antibody staining
Cell freezing containerThermo Scientific5100-0001Container to for freezing cells
CellSenceOlympusVersion 1.18Computer software for using fluorescent microscope
Chromogranin A antibodyAbcam-45179RB-9003-POAntibodies for IF
Chromogranin A antibody (clone LK2H10)Thermo ScientificMA5-13096Antibodies for IHC
CollagenaseSigmaC0130Enzyme for digesting tumor tissue
DMEMGibco11965-092Medium for tissue preparation
DMEM/F12Gibco11320-033Medium for organoid cultures
DMSOSigmaD8418Solvent for dissolving drug
DNAseSigmaDN25Enzyme for digesting tumor tissue
Ethidium HomodimerChemodexCDX-E0012-T1EDNA and RNA binding dye
FBSGibco16000044Reagent for culture media
Fluorescent microscopeOlympusCKX35Microscope for taking pictures of SBENT spheroids
GlutamineGibcoA2916801Reagent for culture media
ImageJNational Institutes of HealthVersion 1.51Computer software for image analysis
InsulinSigmaI0516Reagent for culture media
MatrigelCorning356235Matrix to embed and anchore organoids
Mounting medium (VECTASHIELD)Vector LaboratoriesH-1200Fixative for labelled-cells with a nuclear stain
NicotinamideSigma72340Reagent for culture media
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710Reagent to fix cells
PEN/STREPGibco15140-122Reagent for culture media
PT LinkAgilent DakoNot AvailableAutomated system to prepare slides for IHC staining
RapamycinAlfa AesarJ62473Drug that can inhibit NET growth
Secondary antibodies for IHCAgilent DakoK8000Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system
SSTR2 antibodyGeneScritpA01591Antibodies for IF
SSTR2 antibody (clone UMB1)Abcamab134152Antibodies for IHC
Synaptophysin antibodyAbcam32127Antibodies for IF
Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP)Agilent DakoM7315Antibodies for IHC
TritonXMallinckrodt3555 KBGEReagent to permeablize cells
Y-2763 ROCK inhibitorAdipogenAG-CR1-3564-M005To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw

Ссылки

  1. Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
  2. Pfragner, R., et al. Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I). International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).
  3. Kolby, L., et al. A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake. American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).
  4. Van Buren, G., et al. The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line. Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).
  5. Pfragner, R., et al. Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid. Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).
  6. Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter. Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).
  7. Hofving, T., et al. The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines. Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).
  8. Moreno, A., et al. Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors. Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).
  9. Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).
  10. Saito, Y., et al. Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma. Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).
  11. Park, S. J., et al. Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin. Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).
  12. Clifton-Bligh, R. J., et al. Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).
  13. Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture. Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).
  14. Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids. Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).
  15. Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).
  16. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, 373-386 (2018).
  17. Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communication. 9, 2404 (2018).
  18. Singh, S. P., et al. SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model. Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1522

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены