Estabelecimento e caracterização de spheroids do tumor neuroendócrino das entranhas pequenas

Resumo

Os tumores neuroendócrinos (NETs) são originários de células neuroendócrinas da crista neural. Eles são lentos crescimento e desafiador para a cultura. Nós apresentamos uma estratégia alternativa para crescer redes das entranhas pequenas cultivando as como spheroids. Estes esferoides têm marcadores líquidos das entranhas pequenas e podem ser usados para o teste de droga.

Resumo

Os tumores neuroendócrinos das entranhas pequenas (SBNETs) são os cancros raros que originam das pilhas enterochromaffin do intestino. A pesquisa neste campo foi limitada porque muito poucas linhas de pilha derivadas paciente do SBNET foram geradas. As células SBNET bem diferenciadas são de crescimento lento e são difíceis de propagar. As poucas linhas celulares que foram estabelecidas não estão prontamente disponíveis, e após o tempo na cultura pode não continuar a expressar características de células NET. A geração de novas linhas celulares pode levar muitos anos desde que as células SBNET têm um longo tempo de duplicação e muitas etapas de enriquecimento são necessárias para eliminar os fibroblastos associados ao câncer em rápida divisão. Para superar estas limitações, nós desenvolvemos um protocolo às pilhas de sbnet da cultura dos tumores cirùrgica removidos como esferoides na matriz extracelular (ECM). O ECM forma uma matriz tridimensional que encapsula as células SBNET e imita o microambiente tumoral para permitir que as células da SBNET cresçam. Aqui, nós caracterizamos a taxa de crescimento de esferoides de sbnet e métodos descritos para identificar marcadores de sbnet usando a microscopia da imunofluorescência e immunohistochemistry para confirmar que os esferoides são pilhas neuroendócrinas do tumor. Além, nós usamos esferoides de sbnet para testar a citotoxicidade do Rapamycin.

Introdução

Os tumores neuroendócrinos das entranhas pequenas (SBNETs) originam das pilhas enterochromaffin do intestino pequeno. Embora os sbnets sejam geralmente conhecidos para crescer lentamente, eles comumente metástase para o fígado¹. Quando a remoção cirúrgica ou a ablação do tumor puder ser considerada em muitos casos, o retorno é quase universal, e, conseqüentemente, a terapia médica joga um papel importante na gerência. Esforços enormes foram investidos para gerar novas linhas de células SBNET para o teste de drogas. No entanto, houve muito pouco sucesso. Apenas 6 linhas de células sbnet (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-MS, H-STS) foram relatadas^2,3,4,5; e, infelizmente, uma linha celular não expressa mais marcadores NET⁶ e três outras linhas de células sbnet (KRJ-I, L-STS, H-STS) foram determinadas como derivadas de linfoblastos transformados em vez de redes⁷. A fim de acelerar a identificação de fármacos para a segmentação da SBNETs, são necessários métodos alternativos para o teste in vitro de fármacos.

Aqui, nós aproveitamos a disponibilidade de sbnets resected e estabelecemos uma maneira de cultivar estes sbnets paciente-derivados como esferoides que crescem no ECM. O objetivo geral deste manuscrito é descrever um método para cultura da SBNET como uma cultura tridimensional (3D) e delinear procedimentos para caracterizar esses esferóides para a retenção de marcadores da SBNET por imunofluorescência e imunohistoquímica.

Além, Nós demonstramos como estes esferoides de sbnet podem ser usados testando o efeito do Rapamycin, uma droga anticancerígena para redes⁸. A fundamentação subjacente a este protocolo é desenvolver um novo método para cultivar as células da SBNET in vitro e utilizá-las para testes de drogas. A vantagem desta técnica sobre o método tradicional de estabelecer uma linha de pilha de SBNET é que as culturas 3D de SBNETs podem ràpida ser obtidas e o teste de droga pode ser feito dentro de 3 semanas. Os esferoides de sbnet poderiam potencialmente ser usados como um modelo para executar telas in vitro da droga para identificar drogas novas para pacientes de sbnet. Uma vez que as linhas de células SBNET não estão amplamente disponíveis, as culturas 3D de esferóides SBNET podem servir como um novo modelo in vitro para estudar SBNETs e podem ser compartilhadas entre cientistas no campo.

Protocolo

Todos os experimentos com amostras de tumores neuroendócrinos humanos foram aprovados pelo Comitê do hospital da Universidade de Iowa e clínicas IRB (protocolo número 199911057). Uma lista de todos os materiais e equipamentos é descrita na tabela de materiais. Uma lista de meios de crescimento e soluções-chave encontra-se na tabela 1.

1. tumor neuroendócrino das entranhas pequenas (SBNET) coleção e dissociação da pilha

1. Obtenha amostras de SBNET paciente resected após a confirmação dos tecidos do tumor do núcleo cirúrgico da patologia.
2. Corte SBNETs em cubos de 5 mm e armazene em 25 mL de meio DMEM/F12 em um tubo cônico para o transporte para o laboratório.
3. Transfira os tumores em DMEM contendo 1% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep), 1% de glutamina (meio de lavagem) e incubar neste meio de lavagem por 15 min.
4. Transfira tumores para um novo prato e mince tumores para menos de 1 mm peças usando estéril tesoura curvada.
5. Transfira os tecidos triturados para um novo tubo de 50 mL contendo 25 mL de meio de lavagem.
6. Centrifugue a amostra a 500 x g durante 15 min a 4 ° c.
7. Descarte o sobrenadante e ressuspender as pelotas em 10 mL de meio de lavagem contendo colagenase (100 U/mL) e DNase (0,1 mg/mL).
8. Permita que a digestão dos tumores triturados ocorra em uma incubadora de 37 ° c com agitação lenta (50 rpm) para 1,5 h.

2. cultura de sbnets como esferoides do tumor no ECM

1. Depois que a digestão é terminada (etapa 1,8), Centrifugue em 500 x g por 15 minutos em 4 ° c, descarte o sobrenadante e resuma o pellet em 15 ml de meio de lavagem.
2. Coloque um filtro de células de 70 μm em cima de um novo tubo de 50 mL e transfira 10 mL do meio de lavagem sobre o filtro da célula. Gire o meio de lavagem para cobrir o lado do tubo de plástico para evitar que as células líquidas aderem ao lado do tubo de plástico.
3. Filtre a suspensão da célula através do filtro de células.
4. Centrifugador a 500 x g durante 15 min a 4 ° c, descarte o sobrenadante, Ressuspender o pellet em 200 μL de meio de lavagem (o volume total é de ~ 250 μL) e colocá-lo no gelo.
5. Transferir 5 μL de células para 500 μL de meio de lavagem (1/100 factor de diluição). Use as células diluídas para contagem de células usando um hemociômetro para obter o número de células por mililitro. Multiplicar por 100 para corrigir o fator de diluição.
6. Multiplique o número de células por mL obtidas na etapa 2,5 pelo volume total de células em suspensão obtidas na etapa 2,4 (~ 250 μL).
7. Centrifugar a 500 x g durante 15 min a 4 ° c, descartar o sobrenadante e suspender as células em ECM líquido (1 x 10⁶ células/ml) e manter o gelo.
8. Transfira 5-20 μL de esferoides de sbnet no ECM a uma placa de 96 poços e permita que o ECM líquido solidificar coloc a placa em uma incubadora de 37 ° c por 5 minutos.
9. Adicionar 200 μL de meio de cultura SBNET (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% de glutamina + 10 mM de nicotinamida + 10 μg/mL de insulina) a cada poço da placa 96-well contendo os esferóides da SBNET no ECM.
10. Alternativamente, os organóides da cultura sbnet em meios da pilha de haste similares a o que foi descrito previamente para crescer o fígado humano ou os organóides pancreatic⁹ e alistados na tabela dos materiais.
11. Mude a mídia a cada 5-7 dias.

3. quantificação do tamanho do esferóide de sbnet usando ImageJ

1. Tome 5-10 retratos de esferoides de sbnet no dia 1, 4, 7, 14, 23 e 97 da cultura usando um objetivo 10x.
2. Abra imagens salvas no ImageJ. Vá para a guia analisar , selecione a opção definir medições e coloque uma verificação na opção área .
3. Use a ferramenta de seleção oval da barra de ferramentas para gerar um elipsóide ou círculo em torno de um spheroid bem focado.
4. Vá para a guia Analyze e selecione a opção Measure . Repita as etapas 3,4 e 3,5 a fim começ a medida da área de 25-50 spheroids de SBNET. Os valores são fornecidos em pixel Square.
5. Converta a área de pixel para μm² dividindo o tamanho de cada pixel com o comprimento de cada pixel para o fator de conversão μm das imagens de microscopia.
   Nota: as células sbnet crescem principalmente como esferoides e, em algum momento como elipsóides.

4. caracterização de esferóides da SBNETS por imunofluorescência

1. Transfira os organóides cultivados em ECM para um tubo de 1,5 mL usando uma pipeta P1000.
2. Centrifugue a 1.500 x g durante 1 min e retire o sobrenadante.
3. Lave a cultura organóide adicionando 1 mL de PBS, misture, Centrifugue a 1.500 x g durante 1 min e retire o sobrenadante.
4. Fixar os organóides adicionando 500 μL de paraformaldeído a 4% e incubar por 15 min.
5. Lave a cultura duas vezes com 1 mL de PBS.
6. Permeabilize a cultura adicionando 500 μL de PBS + 3% BSA + 0,1% Triton X 100 por 5 min.
7. Em seguida, lave por três vezes com 1 mL de PBS + 3% BSA.
8. Incubar por 1 h com anticorpos primários contra A Sinaptofisina (SYP)¹⁰ a 1/600 de diluição ou cromogranina A (CGA)¹¹ e receptor de SOMATOSTATINA 2 (SSTR2)¹² a 1/400 diluição em tampão de anticorpo (2,5% de albumina sérica bovina, 0,1% de sódio azida, 25 mM TRIS pH 7,4, 150 mM cloreto de sódio).
   Nota: utilizar 300 μL ou mais de solução de anticorpos por tubo.
9. Lave três vezes com 1 mL de PBS + 3% de BSA.
10. Incubar com anticorpos secundários acoplados a FITC a 1/500 diluição em tampão de anticorpo durante 1 h. utilizar 300 μL ou mais de solução de anticorpos por tubo.
11. Lave 3 vezes com 1 mL de PBS + 3% de BSA. Certifique-se de aspirar e descartar todo o sobrenadante.
12. Adicionar 5 μL de meio de montagem contendo a mancha nuclear DAPI.
13. Use uma pipeta P20 para transferir 5 μL dos esferóides SBNET da etapa 4,12 para um slide de vidro e vedação com um deslizamento de cobertura.
14. Tome imagens usando um microscópio fluorescente usando os objetivos 10x, 20x ou 40x.

5. caracterização de esferóides da SBNET por imunoistoquímica (IHC)

1. Transfira esferoides sbnet da placa de cultura para um tubo de 1,5 ml usando uma pipeta P1000.
2. Centrifugue a 1.500 x g durante 1 min e retire o sobrenadante.
3. Fix esferoides sbnet adicionando 500 μL de formalina 10% para o tubo da etapa 5,2 e incubar à temperatura ambiente para 2-5 dias antes da incorporação de parafina e corte 4 μm de espessura esferóide seções.
4. Desparaffinize, rehidrate, e use a recuperação calor-induzida do epítopo na solução da recuperação do antígeno em pH 9 aquecendo ao ° c 97 por 20 minutos usando a estação de processamento de corrediça 3-in-1 automatizada para preparar corrediças para a incubação do anticorpo.
5. Bloqueie as lâminas e incubar com anticorpos primários contra SYP¹⁰ a uma diluição de 1/100 por 15 min, CGA¹¹ a uma diluição de 1/800 por 15 min, e SSTR2¹² a uma diluição de 1/5000 por 30 min.
6. Incubar com o sistema secundário da deteção do anticorpo por 15 minutos para a mancha de anti-SYP e de CgA e 30 minutos para a mancha SSTR2. Tire fotos usando um objetivo 400x.

6. tratamento de organoides da SBNET com rapamicina

1. Dissolva a rapamicina no DMSO para obter uma solução de estoque de 10 mM.
2. Prepare o meio de cultura SBNET com DMSO (por exemplo, 1 mL de meio de cultura SBNET + 1 μL de DMSO) e meio de cultura SBNET com 10 μM de rapamicina (por exemplo, 1 mL de meio de cultura SBNET + 1 μL de solução de 10 mM de rapamicina).
3. Transfira 200 μL de mídia com meio de cultura SBNET com DMSO ou 10 μM de rapamicina para culturas de esferóide SBNET.
4. Incubar esferóides SBNET por 5 dias em incubadora de 37 ° c.
5. Adicionar 1 μm de etidium homodímero e incubar por 30 min. Retire o meio contendo etidium homodímero, lave com 200 μL de PBS e transfira 200 μL de PBS para cada poço.
6. Tome imagens da microscopia de esferoides de sbnet com e sem tratamento da droga usando o cubo vermelho do filtro com os objetivos 10x, 20x, ou 40x de um microscópio fluorescente.
   Nota: as células mortas coradas com ethidium homodímero aparecem como vermelhas usando o cubo de filtro vermelho G de um microscópio disponível comercialmente (tabela de materiais). Alternativamente, o sinal pode ser capturado usando um espectrofotômetro em 535 de excitação nm e emissão de 624 nm.

7. rachar esferoides sbnet

Observação: isso é feito para expansão e para compartilhamento com outros pesquisadores.

1. Use uma pipeta P1000 para quebrar mecanicamente o ECM e aspirar o ECM com esferoides de sbnet a um tubo estéril de 1,5 ml.
2. Centrifugador em 1.000 x g em 4 ° c, remova todo o sobrenadante e coloc o tubo no gelo.
3. Adicione 2-4x o volume de ECM novo ao pellet. Misture o ECM novo com os esferoides velhos do ECM e do sbnet pipetando acima e para baixo 10x. Evitando a introdução de bolhas de ar.
4. Transfira 5-20 μl do ECM e da mistura dos esferoides de sbnet a uma placa nova e permita que o ECM solidify.
5. Cubra com o novo meio SBNET e transfira para a incubadora. A taxa de recuperação é de aproximadamente 95 a 100%.
6. Para o envio de esferoides sbnet para outro laboratório, transferir esferoides sbnet com ECM novo para um balão T25 e permitir ECM para solidify.
7. Encha o balão T25 com o meio esferóide de sbnet, parafuse na tampa firmemente, e prepare o pacote da expedição.
8. Ao receber uma cultura esferóide sbnet, remova o meio de cultura e execute a etapa 7,1 para 7,5 para colocar esferoides sbnet volta na cultura.

8. cryostorage e recuperação de esferoides sbnet

1. Transfira esferoides de sbnet de 5-10 poços pequenos a um tubo de 15 ml. Centrifugador em 500 x g por 15 minutos em 4 ° c, remova o sobrenadante, ressuscitem no meio de congelação (90% FBS + 10% DMSO), armazene em um recipiente de congelação da pilha, e coloc este em-80 ° c.
2. Transferência para o nitrogênio líquido para maior armazenamento.
3. Para recuperar os esferóides da SBNET, coloque o frasco congelado no gelo e aguarde até que o conteúdo seja completamente thawed. Inverta o tubo e reposicione no gelo para acelerar o processo de descongelar.
4. Uma vez que a amostra é descongelada, colocada dentro de uma centrífuga pré-refrigerada e girar em 1.000 x g por 10 min.
5. Retire o sobrenadante e ressuscitem os esferóides no ECM. Mantenha o tubo no gelo, transfira 20 μL para uma placa nova e aguarde que o ECM se solidifique.
6. Transferência 200 μL de meio de cultura SBNET com 10 μM de inibidor de rocha (Y-27632)¹³ e transferência para a incubadora.
7. Permita que os esferoides de sbnet recuperem e cresçam por 1 semana. Retire o meio de cultura antigo, reabasteça com 200 μL de meio de cultura SBNET e retorne à incubadora.
8. Permita que os esferoides de sbnet continuem a crescer.
   Nota: é preciso pelo menos 1 semana para que os esferóides de crescimento rápido comecem a se recuperar após a criopreservação¹³. Os esferoides de sbnet tomam um mínimo de 2-4 semanas para começar crescer. Muitas pilhas de SBNET morrerão dentro das primeiras 2 semanas e a taxa de sobrevivência é menos de 10%. Uma vez que este é um processo muito demorado e de baixo rendimento, é melhor compartilhar com outros pesquisadores esferoides sbnet em frascos de cultura (como descrito na etapa 7). Cryostorage e recuperação só deve ser usado como um plano de backup em caso de uma contaminação bacteriana ocorre.

Resultados

Existem atualmente apenas 2 linhas de células sbnet estabelecidas e publicadas^2,3,4,5 e elas não estão prontamente disponíveis para muitos pesquisadores. Aqui, propomos a cultura sbnet como esferoides em ECM e usar isso como um modelo alternativo para estudar a sensibilidade à droga sbnet. O tumor derivado do paciente de um sbnet que metástase ao fígado foi coletado, digerido para libera...

Discussão

As culturas do tumor 3D tornaram-se um recurso valioso para o teste de droga pré-clínico¹⁵. Os vários e biobancos organoid do tumor foram estabelecidos recentemente dos tumores^16,17do cancro da mama e de próstata. Neste estudo, nós fornecemos um protocolo detalhado à cultura sbnet como esferoides e um método simples e rápido para validar as culturas do esferóide para marcadores líquidos pela imunofluorescência e pela sensibilida...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-rabbit FITC	Jackson ImmunoResearch	11-095-152	Secondary antibody couple to a green fluorophore
Antigen Retrieval Solution	Agilent Dako	S2367	Solution at pH 9 for preparing slides for IHC
Autostainer Link 48	Agilent Dako	Not Available	Automated system for antibody staining
Cell freezing container	Thermo Scientific	5100-0001	Container to for freezing cells
CellSence	Olympus	Version 1.18	Computer software for using fluorescent microscope
Chromogranin A antibody	Abcam-45179	RB-9003-PO	Antibodies for IF
Chromogranin A antibody (clone LK2H10)	Thermo Scientific	MA5-13096	Antibodies for IHC
Collagenase	Sigma	C0130	Enzyme for digesting tumor tissue
DMEM	Gibco	11965-092	Medium for tissue preparation
DMEM/F12	Gibco	11320-033	Medium for organoid cultures
DMSO	Sigma	D8418	Solvent for dissolving drug
DNAse	Sigma	DN25	Enzyme for digesting tumor tissue
Ethidium Homodimer	Chemodex	CDX-E0012-T1E	DNA and RNA binding dye
FBS	Gibco	16000044	Reagent for culture media
Fluorescent microscope	Olympus	CKX35	Microscope for taking pictures of SBENT spheroids
Glutamine	Gibco	A2916801	Reagent for culture media
ImageJ	National Institutes of Health	Version 1.51	Computer software for image analysis
Insulin	Sigma	I0516	Reagent for culture media
Matrigel	Corning	356235	Matrix to embed and anchore organoids
Mounting medium (VECTASHIELD)	Vector Laboratories	H-1200	Fixative for labelled-cells with a nuclear stain
Nicotinamide	Sigma	72340	Reagent for culture media
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Reagent to fix cells
PEN/STREP	Gibco	15140-122	Reagent for culture media
PT Link	Agilent Dako	Not Available	Automated system to prepare slides for IHC staining
Rapamycin	Alfa Aesar	J62473	Drug that can inhibit NET growth
Secondary antibodies for IHC	Agilent Dako	K8000	Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system
SSTR2 antibody	GeneScritp	A01591	Antibodies for IF
SSTR2 antibody (clone UMB1)	Abcam	ab134152	Antibodies for IHC
Synaptophysin antibody	Abcam	32127	Antibodies for IF
Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP)	Agilent Dako	M7315	Antibodies for IHC
TritonX	Mallinckrodt	3555 KBGE	Reagent to permeablize cells
Y-2763 ROCK inhibitor	Adipogen	AG-CR1-3564-M005	To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw